רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

המטרה הכוללת של הכנת ספריית CDNA זו היא לאפשר ריצוף מוצלח של RNA קטנים שאוחסנו ברקמות משובצות פרפין רשמיות וקבועות. שיטה זו שימושית מאוד לניתוח דגימות משובצות פרפין פורמליות וקבועות. אתה מחלץ RNA מעד 18 דגימות, אתה מנתח את התוכן של כל אלה ומקבל פרופיל של כל המיקרו-RNase עבור כל הדגימות.

כדי להתחיל בפרוטוקול, הוסף 8.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה שהוכנה בעבר לכל אחת מ-18 דגימות FFPERNA המצוטטות בנפרד. העבירו בעדינות את הצינורות, וצנטריפוגה למשך שתי שניות. לאחר הצנטריפוגה יש לאחסן את הצינורות על קרח.

השתמש בפיפטה של שלושה מיקרוליטר כדי להעביר מיקרוליטר אחד מכל מתאם, לדגימות FFPERNA המתאימות המכילות RNA ותערובת מאסטר קשירה. אין לזרוק למעלה ולמטה, ולהחליף טיפים בין FFPERNA samples. סוגרים כל צינור, מעבירים אותם לערבוב וצנטריפוגות למשך שתי שניות.

הניחו את הצינורות על קרח. דנטור את התגובות על ידי הנחת הצינורות על גוש חום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ולאחר מכן הנח אותם מיד על קרח. לאחר מכן, השתמש בפיפטה של שלושה מיקרוליטר כדי להעביר מיקרוליטר אחד של אנזים הקשירה המדולל לכל אחת מ-18 דגימות ה-RNA.

הניחו את הקשרים על קרח, והניחו אותם בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס לדגירה של לילה של 18 שעות. הנח את הצינורות על גוש חום למשך דקה אחת בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס כדי לבטל את תגובת הקשירה ולאחר מכן החזיר אותם לקרח למשך שתי דקות לפחות כדי להתקרר. מעבירים 1.2 מיקרוליטר מתערובת מאסטר המשקעים לכל צינור.

הוסף 63 מיקרוליטר של 100% אתנול. סגור כל צינור, החלק את הצינורות לערבוב וצנטריפוגה אותם למשך שתי שניות. הניחו את הצינורות על קרח.

שלב את התוכן של כל 18 הצינורות לצינור סיליקון יחיד של 1.5 מיליליטר והפוך שלוש פעמים לערבוב. צנטריפוגה את הצינורות למשך שתי שניות, והניחו אותם על קרח למשך 60 דקות כדי לשקע. לאחר משקעים, צנטריפוגה את צינור ה-1.5 מיליליטר עם הקשרים המאוגדים.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד אך השאר מעט נוזלים בתחתית. הטה את הצינור, והשתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להסיר את הסופרנטנט שנותר. שאבו את הסופרנטנט בוואקום עם פיפטה פסטר עם קצה של 10 מיקרוליטר, ואז השעו מחדש את כדור ה-RNA ב-20 מיקרוליטר מים נטולי RNase על ידי לחיצה על הצינור.

הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת טעינת ג'ל PAA כדי להשעות מחדש את ה-RNA. העיף את הצינור, צנטריפוגה את הצינור למשך שתי שניות בטמפרטורת החדר והנח את הצינור על קרח. החלף את ה-0.5 XTBE שהוכן בעבר של מנגנון הג'ל ב-0.5 XTBE טרי, וטען את האחרון, סמני הגודל וה-RNase הקשור במרכז הג'ל, והשאיר שתי בארות ריקות משני הצדדים.

ואז הפעל את הג'ל. לאחר הפעלת הג'ל, פתח את הדף של 15% על ידי הסרת אחת מלוחות הזכוכית. רססו קלות את הג'ל היושב על צלחת הזכוכית עם 10 מיקרוליטר תמיסת צבע פלורסנט ו -25 מיליליטר של 0.5 XTBE, ותנו לו לשבת שטוח במשך חמש דקות בחושך.

הנח את הכוס עם הג'ל על טרנס-מאיר אור כחול, ויישר גם 19 נוקלאוטידים וגם 24 סמני גודל נוקלאוטידים עם סרגל כדי לכוון את הכריתה של ה-RNA הקטנים הקשורים. לאחר מכן, הסירו את הג'ל. הנח את הג'ל הכרות בצינור של 0.5 מיליליטר המיועד לפצל פרוסות ג'ל, ממוקם היטב בצינור מיקרו-צנטריפוגה סיליקון של 1.5 מיליליטר.

צנטריפוגה את הג'ל ב -16 אלף פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את הג'ל המפוצל עם 300 מיקרוליטר של תמיסת נתרן כלוריד 400 מילי-מולרי. סגור את הצינור ואטום אותו בסרט פרפין.

מערבבים את התוכן במיקסר תרמו ב -11 מאות סל"ד בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס לדגירה של לילה. למחרת, הוציאו את הצינור ממערבל התרמו והשתמשו בפיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר את התמיסה לצינור פילטר של חמישה מיקרומטר, המוחדר לצינור איסוף נטול RNase בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור למשך שלוש דקות ב 23 מאה פעמים G בטמפרטורת החדר.

השליכו את צינור המסנן, הוסיפו 950 מיקרוליטר של 100% אתנול לצינור האיסוף המכיל את התמיסה המסוננת, והפכו את הצינור לערבוב. צנטריפוגה את הצינור למשך שתי שניות, והנח אותו על קרח למשך 60 דקות. לאחר מכן, זרז את כדור ה-RNA.

לאחר מכן, יבש את כדור ה-RNA על ידי פתיחת המכסה והסרה זהירה של הסופרנטנט עם פיפטה של מיליליטר אחד, תוך השארת מעט נוזלים בתחתית. השתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להסיר את כל הסופרנטנט שנותר מבלי לגעת בגלולה. הטה את הצינור כך שכל תמיסה שנותרה תעבור לצד הנגדי של הגלולה.

השתמש בפיפטה של פסטר כדי לשאוב את הסופרנטנט ולייבש את הכדור באמצעות ואקום. השעו מחדש את כדור ה-RNA ב-5.6 מיקרוליטר מים נטולי RNase. הפשירו את ריאגנטים לשעתוק הפוך על קרח למשך 15 דקות.

הגדר תגובת שעתוק הפוך על ידי הוספת שלושה מיקרוליטר של מאגר 5X, 4.2 מיקרוליטר של 10X דיאוקסינוקלאוטיד טריפוספט, או DNTPs, ו-1.5 מיקרוליטר של דיתיותרייטול, או DTT. החלק בעדינות את הצינור כדי לערבב את התגובה, וצנטריפוגה למשך שתי שניות כדי לאסוף את התמיסה. לאחר שהתגובה נמצאת על גוש חום בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות בדיוק, העבירו אותה ישירות למיקסר תרמו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות כדי להשוות את הטמפרטורה.

הוסף 0.75 מיקרוליטר של אנזים השעתוק ההפוך ישירות לתמיסה. יש לערבב בעדינות ולהחזיר את הצינור למיקסר התרמו בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מיד. לאחר 30 דקות, העבירו את הצינור לגוש חום בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת כדי לעצור את השעתוק ההפוך.

הוסף 95 מיקרוליטר מים ללא RNase ישירות לשעתוק ההפוך. יש לערבב את השפופרת ולהניח אותה ישירות על הקרח למשך שתי דקות. הרכיבו את תגובת ה-PCR של הפיילוט והגדירו שני מחזורי PCR על המחזור התרמו.

הגדר את תגובת ה-PCR של הפיילוט על ה-thermo cycler והתחל file אחד. בסוף הקובץ הראשון, השתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להעביר 12 מיקרוליטר מתגובת ה-PCR הפיילוט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל שלושה מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

ותייגו אותו 10 מחזורים. סגור את צינור ה-PCR של הפיילוט והתחל file שניים במחזור התרמו. בסוף הקובץ השני, השתמש בפיפטה של 20 מיקרוליטר כדי להעביר 12 מיקרוליטר של תמיסה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עם שלושה מיקרוליטר של צבע טעינת ג'ל פי 5, ותייג אותו 12 מחזורים.

חזור על השלבים לעיל כדי לאסוף 12 מיקרוליטר של מוצרי PCR מתגובת ה-PCR הפיילוט במחזורי PCR 14, 16, 18 ו-20. לאחר מכן הוסף שלושה מיקרוליטרים של צבע טעינת ג'ל 5X לכל אחד מ-12 מיקרוליטר PCR aliquots, ולסולם 20 הנוקלאוטידים המכיל שלושה מיקרוליטרים של סולם ותשעה מיקרוליטרים של מים נטולי RNase. לאחר הפעלת הדגימות על ג'ל אגרוז עם 0.5 XTBE, הערך את הג'ל על קופסת UV כדי לזהות את מחזור ה-PCR האופטימלי.

לאחר מכן הגדר את תגובות ה-PCR בקנה מידה גדול לטיהור ספריית ג'ל אגרוז. לאחר הגברת PCR, העבירו תשעה מיקרוליטר מכל צינור PCR לשישה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, המכילים שלושה מיקרוליטרים של צבע טעינת ג'ל פי 5. הכן סולם 20 נוקלאוטידים.

טען את הסולם, בקרת PCR שלילית ושישה מוצרי PCR על ג'ל האגרוז, והפעל את הג'ל למשך 30 דקות ב-120 וולט. ודא את האחידות של השלכות ה-PCR בין נתיבים בקופסת UV, וצלם תמונה. שלב שלוש תגובות PCR לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה סיליקון של 1.5 מיליליטר, הוסף 27 מיקרוליטר של נתרן כלורי מולארי ו-950 מיקרוליטר של 100% אתנול.

הפוך את הצינורות לערבוב, וקבע אותם על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את מוצרי ה-PCR. באמצעות הפרוטוקול, התברר מתאם ביטוי המיקרו RNA בין שני ה-RNA הטריים של הגידול הקפוא לבין עמיתיהם הספציפיים לדגימת FFPERNA. העלילות בין המיקרו-RNA הקפוא הטרי התואם ל-FFPE מצביעות על כך שהכנת ספריית ה-CDNA מספקת יכולת שחזור טובה, מכיוון שיש מתאם גבוה בין המיקרו-RNA שזוהה בדגימות שעובדו בצורה שונה.

כדי לקבוע אם פרוטוקול ההכנה האופטימלי של ספריית CNDA היה ישים וניתן לשחזור עם דגימות FFPE ישנות יותר ויותר, התקבלו פרופילי ביטוי מיקרו RNA מרקמות FFPE שאוחסנו במשך 18, 20, 22, 27, 30 ו-35 שנים. מקדם המתאם נשאר מעל 0.96 ללא קשר לגיל הדגימה או לשבוע ההכנה לספרייה. לכן, פרוטוקול ההכנה האופטימלי של ספריית CDNA מספק כלי חזק לניתוח ניתן לשחזור של דגימות FFPE, ללא קשר לזמן הארכיון שלהן.

אז לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להכין את ספריות ה-RNA הקטנות שלך ולקבל פרופיל מיקרו-ביטוי מלא של כל הדגימות הרשמיות והקבועות היקרות שלך המשובצות בפרפין.