ExCYT: ממשק משתמש גרפי עבור התייעלות ניתוח של נתוני Cytometry גבוהה-ממדי
16 בינואר 2019
ExCYT הוא MATLAB מבוסס גרפי וממשקי משתמש (GUI) המאפשר למשתמשים לנתח את הנתונים cytometry זרימה שלהם דרך כלל המועסקים בשיטות אנליטיות עבור נתונים גבוהה-ממדי כולל הפחתת dimensionality באמצעות t-סנה, מגוון אוטומטיות וידניות קיבוץ באשכולות שיטות heatmaps, זרימה גבוהה-ממדי הרומן חלקות.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-רפואי, כגון הבנת הפנוטיפ של תת-אוכלוסיות רלוונטיות ביולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לאדם ללא ניסיון בתכנות לנתח את נתוני הציטומטריה שלהם עם העדכניים ביותר בטכניקות ממדיות גבוהות. כדי להתחיל צינור ניתוח, בחר תחילה את סוג הציטומטריה ואת מספר האירועים שיש לדגום מהקובץ.
לאחר מכן, לחץ על אוכלוסיית שער, בחר את אוכלוסיות התאים המעניין והזן את אחוז האירועים לניתוח במורד הזרם. לאחר מכן בחר את מספר הערוצים שישמשו לניתוח בתיבת הרשימה. עבור הטבעת שכן סטוכסטי עם T, או ניתוח t-SNE, לחץ על t-SNE כדי להתחיל לחשב את ערכת הנתונים של מידתיות מופחתת.
לאחר חישוב קבוצה זו, לחץ על שמור תמונת TSNE, ובתפריט המוקפץ סמן-ספציפי t-SNE, בחר סמן מסוים של עניין. איור יופיע המציג ייצוג מפת חום של העלילה t-SNE שניתן לשמור עבור יצירת איורים. כדי להתחיל בניתוח קיבוץ באשכולות, בחר אפשרות בתיבת הרשימה שיטת קיבוץ באשכולות ולחץ על אשכול.
כדי למיין את האשכולות לפי סמן מעניין, בחר באפשרות המתאימה המתאימה מהתפריט הנפתח Sort ולחץ על סדר עולה, יורד, כדי לעדכן את רשימת האשכולות בתיבת הרשימה אשכולות. להגדרת ערך סף מינימלי לאשכול נתון בערוץ מסוים, בחרו אפשרות מהתפריט הנפתח Threshold והגדירו סף מתאים. לאחר קביעת הסף, לחצו על 'הוסף מעל סף' או על 'הוסף מתחת לסף', כדי לציין את כיוון הסף והזינו תסתם מספרי בתיבה 'סף תדירות אשכול', בחלונית 'מסנן אשכולות', כדי לקבוע סף מינימלי לתדירות האשכול.
כדי לבחור אשכולות לצורך אינדיבידואליזציה של ניתוח נוסף, בחר את אשכולות העניין בתיבת הרשימה אשכולות. ולהשתמש בלחצן בחר, כדי להעביר את האפשרויות לתיבת הרשימה ניתוח אשכולות. ליצירת מפות חום של האשכולות, בחרו באשכולות המעניינים בתיבת הרשימה 'ניתוח אשכולות' ולחצו על הלחצן 'מפת חום של אשכולות'.
כדי ליצור התוויית תיבה רב-ממדית, או התוויית זרימה רב-ממדית, בחר את אשכולות העניין בתיבת הרשימה ניתוח אשכולות ולחץ על התוויית תיבה ממדית גבוהה או על התוויית זרימה ממדית גבוהה, כדי להעריך באופן חזותי את התפלגות הערוצים הנתונים באשכולות שונים בכל הממדים. להצגת אשכולות בחלקות זרימה 2D מסורתיות, בחרו בהמרה ובערוצים המתאימים בחלונית 'התוויית זרימה קונבנציונלית' ולחצו על 'התוויית זרימה קונבנציונלית'. כאן, ניתוח t-SNE מייצג של מפות חום עבור סמנים שונים בתוך צינור ניתוח פאנל מיאלואיד, מוצגים.
באמצעות היישום החמדנות המהיר בתוך ExCYT כדי לקבץ את הנתונים עם 100, 000 מהשכנים הקרובים ביותר, נחשפו 19 תת-אוכלוסיות של תאים. השוואת מפות החום המקוריות לאשכולות שנוצרו על ידי ExCYT אפשרה לזהות אשכולות דומים של תאי המיאלואיד בין שתי קבוצות הנתונים. ניתוח של לוח הלימפה עם גישת קיבוץ היררכי קונבנציונלית ומהירה יותר, הניב הפצות סמן דומות באמצעות מפות חום t-SNE.
יתר על כן, קיבוץ מחדש של הנתונים באמצעות אשכולות היררכיים הדגים אשכולות דומים של תאי הלימפה. יש לציין כי אוכלוסיית תאי T רגולטורית ייחודית זוהתה גם באמצעות חלקת זרימה ממדית גבוהה. כדי להעריך במהירות ובאופן כמותי שיוכים שותף בין סמנים, תחילה נעשה שימוש באלגוריתם קיבוץ באשכולות קשה של K-means כדי להניח 5,000 אשכולות על נתוני t-SNE הדו-ממדיים.
הביטוי החציוני של כל סמנים מכל האשכולות שימש אז, כדי ליצור מפת חום מאשכולות אלה, המאפשר שיתוף שיוכים להיות מזוהה בקלות, כגון שיוך שותף של טים-3, PD-1, CD38 ו 4-1BB. בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לזכור לחקור את הפרמטרים השונים, כגון שיטות קיבוץ באשכולות שונות, כדי לחקור באופן מלא את הנתונים שאתה לומד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ExCYT הוא ממשק גרפי (GUI) המבוסס על MATLAB, שתוכנן לניתוח נתוני ציטומטריית זרימה באמצעות טכניקות אנליטיות מתקדמות. הוא מאפשר למשתמשים ללא ניסיון בתכנות לבצע הפחתת ממדיות, קיבוץ (clustering) והדמיה של נתונים רב-ממדיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ציטומטריית זרימה
- ניתוח נתונים
- מחקר ביו-רפואי
רקע
- ציטומטריית זרימה היא חיונית לניתוח אוכלוסיות תאים.
- ניתוח נתונים רב-ממדיים הוא חיוני להבנת מערכות ביולוגיות מורכבות.
- ExCYT מפשט את תהליך הניתוח עבור משתמשים שאינם מתכנתים.
- טכניקות להפחתת ממדיות כגון t-SNE חיוניות להדמיה של נתונים.
מטרת המחקר
- מתן ממשק ידידותי למשתמש לניתוח נתוני ציטומטריה זרימה.
- הקלה בהבנת תת-אוכלוסיות בעלות רלוונטיות ביולוגית.
- מתן אפשרות לחוקרים להשתמש בטכניקות אנליטיות מתקדמות ללא מיומנויות תכנות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירת סוג הציטומטר ודגימת אירועים.
- ביצוע Gating לאוכלוסיות תאים לצורך ניתוח.
- שימוש ב-t-SNE להפחתת ממדיות.
- יצירת מפות חום (heatmaps) ותרשימי זרימה רב-ממדיים.
תוצאות עיקריות
- ExCYT מאפשרת ניתוח יעיל של נתוני ציטומטריית זרימה מורכבים.
- משתמשים יכולים להציג ולפרש מערכי נתונים רב-ממדיים בקלות.
- ממשק המשתמש הגרפי תומך בשיטות מקבץ (clustering) אוטומטיות וידניות כאחד.
- מסייעת בזיהוי של אוכלוסיות תאים רלוונטיות.
מסקנות
- ExCYT הוא כלי רב עוצמה עבור חוקרים בתחום הביו-רפואי.
- הוא הופך את הגישה לטכניקות מתקדמות של ניתוח נתונים לנגישה יותר.
- התוכנה משפרת את ההבנה של פנוטיפים תאיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ExCYT נותנת מענה לאתגר הגובר של ניתוח נתוני ציטומטריה רב-ממדיים בתהליכי גילוי תרופות, באמצעות אספקת ממשק ללא קוד (no-code) עבור טכניקות ניתוח מתקדמות. דבר זה מאפשר גישה רחבה יותר לתהליכי סריקה פנוטיפית ותיקוף מטרות (target validation), מפחית את התלות במומחי ביו-אינפורמטיקה ומאיץ את קבלת ההחלטות בשלבי הגילוי המוקדמים. הכלי תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים (mechanistic de-risking) על ידי סבסוד זיהוי אובייקטיבי של תתי-אוכלוסיות בעלות רלוונטיות ביולוגית מתוך מערכי נתונים מורכבים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות חקירה פנוטיפית בלתי מוטה של הטרוגניות תאית.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי זיהוי ואפיון של אוכלוסיות תאים המגיבות לתרופה ללא הטיות של סינון ידני (manual gating).
- ערך ניבוי: מגביר את הביטחון בבחירת המטרה על ידי חשיפת דפוסי ביטוי משותף של נקודות בקרה חיסוניות וסמני הפעלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו ולידציה לסריקות המשך, באמצעות הגדרת אשכולות (clusters) מובחנים פנוטיפית בעזרת t-SNE וקיבץ (clustering).
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הפחתת ממדים וזיהוי אשכולות הניתנים לשחזור על פני קבצי FCS שעברו פיצוי (compensated) וכאלו שלא.
- יכולת הרחבה: מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור פאנלים מגוונים של אימונולוגיה ואונקולוגיה, באמצעות בחירת ערוצים גמישה וסינון מבוסס סף.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תומך בניתוח מערכות רלוונטיות למחלה על ידי קישור של קו-אסוציאציות של סמנים (למשל, Tim-3, PD-1, CD38, 4-1BB) לפנוטיפים תפקודיים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקל על תיקוף פרה-קליני באמצעות ויזואליזציה של תרשימי זרימה רב-ממדיים החושפים אוכלוסיות נדירות כגון תאי T רגולטוריים.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר קבלת החלטות מבוססות נתונים לגבי המשך או הפסקת הניסוי (go/no-go) באמצעות ספי סבירות כמותיים של אשכולות ויכולות מיון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
ExCYT משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית ועד לזיהוי מובילים (leads), על ידי הפיכת נתוני ציטומטריה גולמיים לתובנות פנוטיפיות ישימות המכוונות את בחירת המטרה ואת המוכנות לסריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למקבול (clustering) אובייקטיבי של אימונופנוטיפים מפאנלים רב-ממדיים.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה באמצעות ויזואליזציית t-SNE הניתנת לשחזור ובידוד מקבולים לצורך תיקוף תפקודי בהמשך.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים הכוללים מפות חום (heatmaps), ספי סבירות של מקבולים, וגרפי זרימה רב-ממדיים להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לעבודת פרה-קלינית על ידי זיהוי דפוסי ביטוי משותף של ביומרקרים בעלי רלוונטיות תרגומית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה אנליטית לשימוש חוזר בין פרויקטים שונים הודות לתמיכה בסוגי ציטומטריה מגוונים ובסבבי עבודה עם פיקוח או ללא פיקוח (unsupervised/supervised).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות אשכול (clustering) לא מוטה.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות אוטומציה מבוססת ממשק משתמש גרפי (GUI) של תהליכי עבודה של t-SNE, אשכול וסינון (gating).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן גישה רחבה יותר של הצוות לניתוחים מתקדמים, ובכך מפחית צווארי בקבוק בפירוש הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון על ידי אספקת מדדי אשכול כמותיים המנחים החלטות לגבי קידום הפרויקטים.
שיקולי יישום
- נדרשת היכרות עם תכנון ניסויי של ציטומטריה ובחירת פאנל סמנים.
- נדרשת סביבת הרצה של MATLAB וגישה לתשתיות נתונים של קובצי FCS.
- מומלץ לבצע סטנדרטיזציה בין-צוותית של אסטרטגיות gating ופרמטרי clustering להשגת תוצאות הדירות.
- שיקולי התאמה כוללים כיוונון של ה-perplexity ב-t-SNE ושל ספי סף (thresholds) של אשכולות בהתבסס על מורכבות המערכת הביולוגית.
- מגבלה מעשית: הביצועים עשויים להשתנות במקרה של מערכי נתונים גדולים במיוחד (>1M events) ללא דגימה (sampling) בשלבים מאוחרים יותר.
