Name: פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למדו שיטה בטוחה להנדסה גנטית של תאי גזע CD133+ המופקים ממח עצם באמצעות טרנספקציה לא ויראלית מבוססת ננו-חלקיקים מגנטיים. הפרוטוקול מאפשר שיפור תכונות תאיות ומעקב אחרי התאים באמצעות MRI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך הפדרלי, גרמניה מחקר (FKZ 0312138A, FKZ 316159), את מדינת מקלנבורג-פורפומרן עם הקרנות המבניות של האיחוד האירופי (ESF/IVWM-B34-0030/10 ו- ESF/IVBM-B35-0010/12), את DFG (DA1296/2-1), קרן לב גרמני (F/01/12), את BMBF (VIP + 00240), קרן לח. בנוסף, F.H. ל בערב נתמכים על ידי FORUN תוכנית של רוסטוק המרכז הרפואי האוניברסיטאי ע"ש (889001).

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

בשנים האחרונות, CD133+ SCs הופיעו כאוכלוסייה תא מבטיח עבור טיפולים מבוססי-SC כפי שמעידים מספר שלב אני II, III בניסויים קליניים43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 ,</s...

CD133+ SCs מייצגים הטרוגנית גזע ו קדמון תא אוכלוסיה עם מבטיח פוטנציאל עבור רפואה רגנרטיבית. שלהם בידול hematopoietic, אנדותל, myogenic פוטנציאליים1,2,3 מאפשר את CD133+ תאים, למשל, לתרום כורוידאלית תהליכים באמצעות בידול לתוך לאחרונה יוצרים כלי והפעלה של pro-אנגיוגנזה איתות על-ידי paracrine מנגנונים4,5,6,7.
למרות הפוטנציאל שלהם גבוהה הפגינו יותר מ 30 ניסויים קליניים מאושרים (ClinicalTrails.gov), התוצאה הטיפולית שלהם הוא עדיין תחת הדיון במחלוקת4. אכן, יישום קליני של SCs היא הקשו על ידי שמירה נמוך באיבר של עניין תא הראשונית מסיבית מוות5,8,9. נוספים הנדסה של CD133+ השתלת מוקדמת SCs יכול לעזור להתגבר על האתגרים הללו.
תנאי הכרחי אחד עבור טיפול יעיל תא יהיה צמצום מסיבית הראשונית של המוות של תאים כדי לשפר את engraftment של התאים הרלוונטיים טיפולית10. מחקרים נוכחיים הפגינו אובדן תא העצום של 90-99% באיברים מאוד perfused כמו מוח ולב, במהלך ה 1-2 הראשון, ללא תלות בסוג התאים המושתלים או יישום לנתב11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC תיוג באמצעות חלקיקים מגנטיים (MNPs) מאפשר אסטרטגיית לא פולשנית חדשניות לתאי היעד לאתר של עניין22,23,24,25,26 בו זמנית מאפשרת תא ניטור באמצעות MRI27 ו חלקיקים מגנטיים הדמיה (MPI). ה היעילה ויוו מחקרים החלה תא magnetized מיקוד שמירה תא בשימוש לאחר המינהל המקומית העדפה תא הדרכה לאחר הזרקה תוך ורידי23,24,28 . לכן, הקבוצה שלנו עיצב מערכת המורכבת חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי29. בטכניקה זו, CD133+ SCs ואת תאי אנדותל יפתור (HUVECs) יכול ביעילות ניתן לפלח, כפי שמגלה במבחנה ניסיונות30,31.
. עוד משוכה SC טיפולים הוא הסביבה דלקתיות עוינת של רקמות שנפגעו לאחר ההשתלה, אשר תורמת מות התא הראשוני32. מספר מחקרים מיזוג מראש, היישום של מירס הרלוונטיים טיפולית היה נבדק33; זה בהצלחה הוכח כי מירס אנטי-מוות לעכב אפופטוזיס במבחנה ולשפר את התא engraftment ויוו33. אלו מולקולות קטנות, מורכב 20 – 25 נוקלאוטידים, לשחק תפקיד מכריע כמו מאפננים posttranscriptional של RNAs שליח (mRNAs), ובכך להשפיע על גורל והתנהגות תאי גזע34. יתר על כן, המבוא אקסוגני של מירס להימנע השילוב יציב רצויה לתוך הגנום המארח34.
ניסיונות הנוכחי עבור מבוא יעילה של חומצות גרעין (NAs) לתוך ראשי SCs מתבססים בעיקר על וירוסים רקומביננטי8,35. למרות יעילות גבוהה תרביות תאים, וירוס רקומביננטי מניפולציה מציג מכשול גדול עבור תרגום ספסל-כדי-המיטה, למשל, ביטוי גנים בלתי נשלט, פתוגניות, immunogenicity ו- insertional מוטגנזה מכוונת35 ,36. לכן, נגיפי מערכות אספקה כגון בונה מבוסס פולימר הם קריטיים כדי לפתח. בין אלה, polyethylenimine (פיי) מייצג כלי רכב משלוח חוקי המציע הטבות עבור מירס כגון NA עיבוי להגן מפני השפלה, ספיגת הסלולר, אלבומו תאיים endosomal להימלט37,38. יתר על כן, מתחמי מיר-פיי הפגינו של הביו גבוהה בניסויים קליניים39. לכן, מערכת המסירה שלנו מורכב biotinylated קנים 25 kDa פיי מאוגדים מצופים streptavidin ליבה MNP30,31,40.
כתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף המתאר (i) הבידוד ידנית של CD133+ SC של תרומת מח עצם אנושית (מוניטור) עם אפיון מפורט של המוצר SC ו (ii) על אסטרטגיה יעילה ועדינה תקנים של דיסקות נגיפי מבוסס פולימר מערכת משלוח עבור הנדסה גנטית של CD133+ SCs באמצעות מירס. CD133+ SCs מבודדים, דיסקות מועשר מן האדם aspirates מוניטור בחזה ובצלעות באמצעות משטח נוגדן מבוססי מגנטי הופעל תא מיון (מקינטוש) מערכת. לאחר מכן, את הכדאיות תא, כמו גם את הטוהר תא מנותחים באמצעות cytometry זרימה. לאחר מכן, מתחמי מיר/פיי/MNP מוכנים, CD133+ SCs הם transfected. 18 h לאחר תרביות תאים, את יעילות ספיגת וההשפעה של תרביות תאים ב- SC סמן ביטוי ותא הכדאיות מנותחים. יתר על כן, הערכה של ההתפלגות תאיים של תרביות תאים מורכבים תרכובות מתבצעת באמצעות תיוג מארבעה צבעים, תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית עם טכנולוגיות תאי גזע כחולים מתילן</td><td></td><td>7060</td><td>3%</td></tr> <tr><td>אנטי-CD133/2-PE (שיבוט: 293C3)</td> <td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (שיבוט: AC136)</td> <td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (שיבוט: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>560178 צבע רודמין; צבע Atto 565 מצומד לביוטין</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 חלקיקי דקסטרן ברזל סופר-פרמגנטיים המקושרים לנוגדנים; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td></td> תא ספירת 11088831001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ציאנין 3 צבע עם תווית קודמן miR; Cy3 Colour-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Cyanine 5 dye miR ערכת תיוג; ערכת תיוג צבע Cy5 IT miRNA Mirus</td><td>Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr> <tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Blocking Reagent, Human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג חלבון ירוק בהיר; ערכת תיוג חלבון אורגון ירוק 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרכבה מימי; Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה שיפוע צפיפות; Leukosep צנטריפוגה</td><td>צינור גריינר Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מגנט MACS; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS מסנן טרום הפרדה</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 ומיקרו; </td></tr><tr><td>m עמודת הפרדת MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מגנט קבוע MACS; מפריד MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF מסנן</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu; m</td></tr><tr><td>עכבר IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>צבע תגובתי אמין; ערכת כתמי תאים מתים כמעט חיים / מתים הניתנת לתיקון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הפרדת לימפוציטים אנושיים; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>צפיפות: 1.077 גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>ללא Ca ו-Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>מסועף; 25 kDa</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>קודמן miR ללא תווית; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טיהור RNAse; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>מדיום לימפוציטים אנושי; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 בינוני</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>תוסף ציטוקינים אנושי רקומביננטי; StemSpan CC100 Stemcell</td><td>Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הרחבת תאים המטופויאטיים ללא סרום; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere חלקיקים פרמגנטיים</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>solution Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0.4</td></tr>% <tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0.5 מ'; pH 8.0</td></tr><tr><td>ZEN2011 תוכנה</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH אמבט מים סוניקט</td><td>בנדלין אלקטרוני</td><td></td><td>פלט נומינלי קולי: 80 וואט; תדר אולטרסאונד: 35 קילוהרץ</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול להעברת microrna לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

בעוד CD133+ תאי גזע hematopoietic (SCs) הוכחו מספקים פוטנציאל גבוה בתחום של רפואה רגנרטיבית, שיעורי ההחזקה נמוך שלהן לאחר ההזרקה לתוך רקמות פצוע, כמו גם שיעורי התמותה נצפתה תא מסיבית להוביל מאוד אפקטים טיפולית מוגבלת. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנחנו ביקשו להקים עבור הנדסה תא מתאים לפני הממשל שלהם פרוטוקול מבוסס נגיפי. השינוי של האדם CD133+ לבטא SCs באמצעות microRNA (מיר) טעון מגנטית polyplexes היה מיועד ביחס ספיגת יעילות, בטיחות, כמו גם פוטנציאל מיקוד של התאים. להסתמך על הפרוטוקול שלנו, נוכל להשיג מיר גבוהה שיעור ספיגת של 80-90% בזמן CD133+ מאפייני תא גזע נותרים ללא כל שינוי. יתר על כן, תאים ששונה אלה מציעות את האפשרות של פילוח מגנטי. נתאר כאן הליך בטוח ויעיל מאוד עבור השינוי של CD133+ SCs. אנו מצפים בגישה זו כדי לספק טכנולוגיה סטנדרטית למיטוב של תאי גזע הטיפולית תופעות לניטור של המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית (MRI).

פרוטוקול הציג מתאר ידנית בידוד והעשרה מגנטי של האדם הנגזרות מוניטור CD133+ SCs עם וירוס עוקבות תא עצמאית הנדסה אסטרטגיה, כטכנולוגיה פולשני מניפולציה במבחנה תא, ויוו כלי ניטור.
טכנולוגיה זו שלושה שלבים בידוד היתרי כניסה פרידה של MNCs ויטביע בחזה ובצלעות מתעכל מראש באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. לאחר מכן, CD133+ תא שבר יכול להיות דיסקות מועשר בטכנולוגיה המתאימה בידוד. הדבר מאפשר העשרה ש...

פרוטוקול זה ממחיש הליך בטוחים ויעילים כדי לשנות CD133+ hematopoietic תאי גזע. הציג נגיפי, מגנטי polyplex-הגישה המבוססת על עשוי לספק בסיס אופטימיזציה של תאי גזע טיפולית אפקטים כמו גם לגבי ניטור המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

הפרוטוקול שלנו יכול לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון האם ניתן לשפר תאים עבור התכונות המועילות וכן האם ניתן למקד אותם לאתר המעניין. יתרון מרכזי של הפרוטוקול שלנו הוא העובדה שניתן להנדס את התאים באופן ארעי, גנטי בשיטת הטרנספקציה הלא ויראלית שלנו, ובכך לשמור על תכונות התאים. השיטה של סאוטר יכולה לספק תובנה לגבי השינוי של תאי גזע המטופויאטיים שניתן ליישם על סוגי תאים אחרים המשמשים להשתלה כגון תאי גזע מזנכימליים.כדי להתחיל בפרוטוקול, יש לחמם מראש לימפוציטים אנושיים בטמפרטורת החדר ולהפשיר קולגנאז B ו-DNase. אוספים את מח העצם, או BM, לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר. השליכו את כל הקרישים הקיימים.קח דגימת BM של 200 מיקרוליטר לניתוח ציטומטרי זרימה לאחר מכן. אחסן את הדגימה בארבע מעלות צלזיוס עד הצורך. לאחר מכן, העבירו עשרה מיליליטר BM לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר והוסיפו שישה מיליליטר PBS EDTA, 20 מיליליטר מדיום לימפוציטים אנושי, 175 מיקרוליטר קולגנאז B ו-175 מיקרוליטר DNase.מערבבים בעדינות את התמיסה ומדגרים אותה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר. יש להניח צינור צנטריפוגה בשיפוע בצפיפות של 50 מיליליטר על ידי החלת 15 מיליליטר של מדיום הפרדת לימפוציטים אנושיים לתוך צינור ה-50 מיליליטר וצנטריפוגה ב-1,000 פעמים G למשך 30 שניות. שכבה בזהירות של 35 מיליליטר של BM מדולל על גבי מסנן צינור הצנטריפוגה של שיפוע הצפיפות וצנטריפוגה את הצינור ב-445 פעמים G למשך 35 דקות.הסר בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה מבלי לרעוד. השלך בזהירות מקסימום 20 מיליליטר מהתמיסה השקופה העליונה, מבלי לגעת בשכבה העכורה ישירות על גבי המסנן. העבירו בזהירות את השכבה העכורה המכילה את התאים החד-גרעיניים, או MNCs, לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר ומלאו אותו ב-PBS EDTA לנפח סופי של 50 מיליליטר.ספרו את ה-MNCs על ידי העברת 10 מיקרוליטר של מתלה התאים של 50 מיליליטר לתוך צינור של 1.5 מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטר של חומצה אצטית 3% עם מתילן כחול. מערבבים בעדינות את התכולה, ומורחים 10 מיקרוליטר לתא ספירה.חשב את מספר ה-MNCs. צנטריפוגה את תרחיף ה-MNC ב-300 פעמים G למשך 10 דקות. השליכו את הסופרנטנט.כדי להכין בחירה מגנטית עבור אחד כפול 10 עד מספר התא הכולל השמיני, השעו מחדש בזהירות את ה-MNCs ב-300 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסף 100 מיקרוליטר של מגיב חוסם FCR ו-100 מיקרוליטר של חלקיקי דקסטרן ברזל סופר-פרמגנטיים המקושרים לנוגדנים CD133. לאחר מכן, מערבבים בעדינות את תרחיף התאים ודוגרים אותו למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.יש לנער בעדינות את תרחיף התאים במהלך הדגירה פעמיים-שלוש. לאחר הדגירה, הוסף שני מיליליטר של מאגר MACS לכל אחד כפול 10 תאים. מערבבים בעדינות את תרחיף התאים וצנטריפוגה את התערובת ב -300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.הגדר את מחזיק המגנט של MACS וחבר את המגנט הקבוע של MACS. התקן את עמודת MACS והחל את מסנן טרום ההפרדה למעלה. איזון עמודת ה-MACS הראשונה ומסנן קדם-ההפרדה עם מאגר MACES.השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS. החל את מתלה התאים על מסנן ההפרדה המוקדמת. שטפו את עמודת ה-MACS ואת מסנן ההפרדה המקדים שלוש פעמים והשליכו את המסנן לפני ההפרדה.העבר את שבר התא ישירות לעמודת ה-MACS השניה. העבר מיד את עמודת ה-MACS הראשונה מעל עמודת ה-MACS השנייה ודחף את מתלה התאים דרך עמודת ה-MACS באמצעות הבוכנה המצורפת. שטפו את עמודת ה-MACS 3 פעמים עם מאגר MACS.הוצא את שבר התא מהעמודה על ידי הוספת מאגר MACS לעמודת ה-MACS השנייה והסרת עמודת ה-MACS מהמגנט הקבוע של MACS. העבר מיד את עמודת ה-MACS השנייה מעל צינור ודחף את מתלה תמיסת התא דרך עמודת ה-MACS. צנטריפוגה את הצינור.השליכו בזהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר MACS. קח דגימה של אחת כפול 10 לתאים הרביעיים לניתוח ציטומטרי זרימה לאחר מכן. השעו מחדש את התאים הנותרים במדיום תרבית וזרעו חמש פעמים 10 לתאים הרביעיים בצלחת של 24 בארות לצורך טרנספקציה.דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו-20% O2. השתמש בשתי דגימות BM של 10 מיקרוליטר ודגימה אחת של SCs חיוביים CD133 מבודדים טריים לניתוח. העבירו את התאים לצינור של 1.5 מיליליטר.הוסף 10 מיקרוליטר של מגיב חוסם FcR ומלא את הצינור במאגר MACS לנפח של 33 מיקרוליטר. הוסף את הנוגדנים לצד הפנימי של הצינור. לאחר הוספת כל הנוגדנים, יש לנער את צד הנוגדנים של הצינור.מערבבים בעדינות את התמיסה, בעלת נפח סופי של 50 מיקרוליטר, ומדגרים אותה למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של כדורית דם אדומה X אחת, או מאגר ליזה RBC. מערבבים בעדינות את המתלה ומדגרים את התמיסה על קרח למשך 10 דקות.ואז צנטריפוגה את המתלים. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה שהתקבלה ב-100 מיקרוליטר PBS. להעריך את הטוהר והכדאיות של תאים על ידי מדידות זרימה ציטומטריות.השתמש ב -20 פיקומולים של MIR לבאר של צלחת 24 בארות. יש לדלל MIR בתמיסת גלוקוז של 5% לריכוז סופי של 0.25% פיקומולס MIR למיקרוליטר. יש לדלל את ה-PEI בכמות שווה של תמיסת גלוקוז של 5%.לאחר מכן, הוסף את ה-PEI המדולל מראש לתוך ה-MIR והמערבולת המדוללת מראש למשך 30 שניות. תוך כדי דגירה של מתחמי MIR PEI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, סוניקציה של ננו-חלקיקים מגנטיים, או MNPs למשך 20 דקות ב-35 קילו-הרץ באמבט מים סוניקטיבי בטמפרטורת החדר. ודא שהחלקיקים נמצאים בתרחיף ואינם מצטברים.הוסף את ה-MNPs הסוניקטיביים למתחמי MIR PEI ומערבל את הפתרון למשך 30 שניות. דגרו את מתחמי MIR PEI MNP למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף את קומפלקס MIRNA PEI MNP ישירות לבאר המתאימה המכילה את ה-SCs החיוביים הטריים שבודדו CD133 במדיום תרבית.יש לערבב בעדינות על ידי נדנוד הצלחת קדימה ואחורה. לדגור על התאים. 18 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את תכולת כל באר בצינור נפרד של 1.5 מיליליטר.שטפו כל באר פעם אחת עם 500 מיקרוליטר PBS והעבירו את מתלה התאים הזה לאותו צינור. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב-300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר MACS.הוסף 0.5 מיקרוליטר של צבע תגובתי אמין כדי להבחין בין תאים חיים ומתים. מערבבים בעדינות את התרחיף ודוגרים על התאים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה שוב את התאים ב -300 פעמים G למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה שהתקבלה ב-100 מיקרוליטר PBS, הוסיפו 33 מיקרוליטר של 4% PFA וערבבו במרץ. להעריך את יעילות קליטת ה-MIR ואת הציטוטוקסיות המתווכת על ידי מדידות ציטומטריות זרימה. בעקבות השיטה המתוארת בפרוטוקול, ציטומטריית זרימה קבעה כי שבר התא החיובי CD133 המועשר מגנטית הניב כדאיות וטוהר גבוהים מ-80%שיטת הטרנספקציה המתוארת כאן מאפשרת החדרה יעילה ביותר של MIR ב-SCs חיוביים ל-CD133 אנושיים מבודדים טריים.עם יעילות ספיגה של כ -80% מהתאים הקיימאים. בנוסף, אין השפעות ציטוטוקסיות משמעותיות הניכרות 18 שעות לאחר הטרנספקציה בהשוואה לתאי הביקורת. יתר על כן, ניתן לראות אספקה מספקת והפצה רגילה של תרכובות מורכבות הטרנספקציה בתוך הציטופלזמה של תאים באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה, או SIM.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו יישום in vivo של תאי גזע ששונו. זה יאפשר לחקור את ההישרדות וההשפעות בפועל בתנאים דינמיים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליישם טרנספקציה מבוססת פולימר וננו-חלקיקים מגנטיים כדי להכניס ביעילות מיקרו-רנ"א לתאי גזע המטופויאטיים טריים.

protocol-for-microrna-transfer-into-adult-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

5 חלבוני ניאון קומבינטורית סימון של תאי גזע ואבות היווצרות הדם מאפשר במעקב משובט vivo באמצעות confocal ושני פוטונים במיקרוסקופ, מתן תובנות ארכיטקטורת hematopoietic מח העצם במהלך רגנרציה. שיטה זו מאפשרת מיפוי גורל לא פולשנית של תאים נגזרים HSPCs ספקטרלי מקודדים ברקמות שלמות לתקופות נרחבות של זמן לאחר השתלה.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

אספקת תאים ממוקדת שימושית במגוון יישומים ביו-רפואיים.  מטרת פרוטוקול זה היא להשתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרמגנטיים (SPION) כדי לתייג תאים ובכך לאפשר גישות מיקוד לתאים מגנטיים לרמה גבוהה של שליטה על העברת התאים ולוקליזציה.

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

Chondrogenesis מתאי גזע דורש כוונון עדין תנאי התרבות. כאן, אנו מציגים גישה מגנטית עבור עיבוי תאים, צעד חיוני ליזום chondrogenesis. בנוסף, אנו מראים כי התבגרות דינמית בתוך bioreactor חלה גירוי מכאני כדי המבנים הסלולר ומשפרת ייצור תאי מטריקס סחוסים.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

אנו מתארים את השימוש השתלת תא גזע hematopoietic (HSCT) כדי להעריך את פוטנציאל ממאיר של תאים מהונדסים גנטית hematopoietic. HSCT שימושית לצורך הערכת שונים תאים ממאירים hematopoietic ויוו , כמו גם יצירת קבוצה גדולה של עכברים עם תסמונות myelodysplastic (MDS) או לוקמיה להעריך טיפולים חדשניים.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אופטימלי של תרבית גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPC) לחריטה חזקה של תאים שעברו עריכה גנטית in vivo.

עריכת גנים CRISPR/Cas9 של תאי גזע ותאי אב המטופויאטיים ליישומי ריפוי גנטי

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

פרוטוקול זה מתאר הזרקה תוך-פמורלית של כמה תאי גזע המטופויטיים או לוקמיים, כולל תאים ערוכים גנטית, במודלים של קסנוגרפט מורין, אשר לא רק יאפשרו השתלה מהירה ובטוחה של תאים אלא גם ניתוחים סדרתיים של מח העצם.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

למדו שיטה בטוחה להנדסה גנטית של תאי גזע CD133+ המופקים ממח עצם באמצעות טרנספקציה לא ויראלית מבוססת ננו-חלקיקים מגנטיים. הפרוטוקול מאפשר שיפור תכונות תאיות ומעקב אחרי התאים באמצעות MRI.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

גלה סרטונים נוספים