מהדור בתפוקה גבוהה תלת מימדי הגידול Spheroids להקרנה סמים
5 בספטמבר 2018
במגוון רחב של מחלות אינדיקציות, דגמים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית מתנהג הסמים מפותחת, מיושמים לתוך גילוי תוכניות. המערכת החדשה דגם המתוארים כאן מדגים איך תלת מימדי הגידול יכול להיות תרבותי ולא הוקרן תפוקה גבוהה 1536-ובכן צלחת מערכת מבוססת לחיפוש תרופות חדשות אונקולוגיה spheroids.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גילוי התרופות, כגון, מהי הגדרת תרבית הרקמה הרלוונטית ביותר לזיהוי פגע לעופרת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת תרבית של תאים בתלת מימד, בצורה תפוקה גבוהה, באמצעות 1536 לוחות באר. מי שתדגים את הפרוטוקול הזה תהיה קליאני גמפה, מדענית בכירה מהמעבדה שלי.
כדי להקים תרבית ספרואיד גידול תלת מימדית, נתק את קווי התאים הסרטניים המעניינים עם שלוש שטיפות של BBS. ואחריו תוספת של מיליליטר טריפסין לכל שטח מרובע של חמישה סנטימטרים של בקבוק תרבות. לאחר חמש דקות, נטרלו את הטריפסין עם פי חמישה מנפח הסרום בכל בקבוק, וספרו את התאים.
השתמש בקלטת מעוקרת וקטנה עם קצה נירוסטה עם מערכת מבוססת משאבה פריסטלטית כדי לזרוע בסך הכל 500 תאים בשמונה מיקרוליטר של מדיום ספרואיד לכל באר של צלחת שטופלה בתרבית רקמות של 1,536 בארות. לאחר מכן השתמש בחותם צלחת דבק נושם כדי לכסות את הצלחת. והניחו את הצלחת באינקובטור מסתובב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-10 סל"ד עם 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות יחסית למשך שלושה ימים.
השלב הקריטי ביותר הוא לוודא שהצלחות אטומות היטב לפני הכנסתן לחממה. הספרואידים יצטרכו שלושה ימים להיווצר ושלב זה מונע אידוי בינוני. בסוף הדגירה, סובב במהירות את לוחות התרבית המרופדים בסרטן בכוח הכבידה פי 100 כדי לאסוף כל עיבוי, והסר את אטמי הדבק.
הנח כל צלחת לטיפול על מתקן אקוסטי המוגדר לספק בסך הכל שמונה ננוליטר מכל תרכובת. דילול לריכוז סופי של 0.1% DMSO לבאר, ומינון תרכובת עליון של 10 מיקרומולר. לאחר הוספת התרכובת לצלחות המתאימות, הניחו מכסה תרבית תאי נירוסטה בהתאמה אישית על כל צלחת כדי למנוע אידוי, והחזירו את הצלחות לחממה המסתובבת למשך חמישה ימים נוספים.
בתום הדגירה, הוסף שלושה מיקרוליטרים של מגיב ליזיס תאים מחומם מראש, בתוספת לוציפרין לכל באר של כל צלחת תרבית תאים. ודגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפחות. לאחר מכן צלם את זוהר ה-ATP על לומינמטר צלחת.
לאחר ניתוח כל הלוחות, חלץ את הנתונים הגולמיים מהמכשיר ונרמל את כל השדות המכילים את תרכובות הבדיקה לממוצע של כל הבארות המכילות DMSO בלבד כבקרה ניטרלית. לאחר מכן ניתן לחשב את אחוז עיכוב הצמיחה של כל תרכובת על פי הנוסחה, וניתן ליצור עקומות תגובת מינון, וניתן ליצור IC50s מעכבים. מגוון של תאי סרטן מבוססים הידועים כגדלים היטב בתנאי תרבית דו-ממדית יצרו גם מבנים תלת-ממדיים כאשר תרבבו כפי שהודגם זה עתה, למרות ההבדלים המורפולוגיים ביניהם.
כאשר משתמשים בו להקרנה בקנה מידה גדול, ניתן להבחין ברגישות דיפרנציאלית לתרכובות בין תרביות שגדלו בדו-ממד לעומת אלו שגדלו בתלת-ממד. כאשר כל נקודה מייצגת את הריכוז המעכב של תרכובת בודדת שעבורה נצפית תגובת הרג תאים של 50% בשתי הגדרות התרבית. בניסוי מייצג זה, שניהם נבדקו תרכובות מעכבות קינאז של RAF היו חזקות יותר בתנאי תלת מימד בתרבית קו סרטן ריאות של תאים לא קטנים המכילה מוטציה מפעילה בחלבון KRAS.
עם זאת, התרכובות מדגימות עוצמה דומה הן בתרביות סרטן המעי הגס התלת-ממדיות והן בתרביות סרטן המעי הגס הדו-ממדיות המכילות מוטציה מפעילה G13D ב-KRAS. הבדיקה התלת-ממדית מאפשרת גם התבוננות בתופעת הפעלת הצמיחה הפרדוקסלית, המתרחשת כאשר יש עיכוב לא שלם של דימרים של RAF בקווים מוטנטיים של RAFs פעילים מאוד, כפי שמעידה צמיחת תאים בריכוזים נמוכים של התרופה, המדוכאת בריכוזים גבוהים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות לסרטן לחקור תנאי תרבית חלופיים לזיהוי חומר כימי חדש ויעיל כנגד מטרות ידועות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חדשנית לגילוי תרופות באמצעות ספרואידים של גידולים בתלת-ממד, המגודלים במערכת של פלטות בעלות 1536 בארות לסריקה רב-נפחית (high-throughput). גישה זו שואפת להגביר את הרלוונטיות של תנאי תרביות רקמה בזיהוי תרופות פוטנציאליות לאונקולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אונקולוגיה
- גילוי תרופות
- טכניקות לתרבית תאים
רקע
- תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות נכשלות לעיתים קרובות בחיקוי הסביבה המיקרוסופית של הגידול.
- תרביות תלת-ממדיות מספקות מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר הסרטן.
- סריקה בתוספת של תפוקה גבוהה (High-throughput screening) חיונית לגילוי תרופות יעיל.
- מחקר זה מתמקד באופטימיזציה של גידול ספרואידים של גידולים סרטניים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה עם תפוקה גבוהה (high-throughput) לגידול של ספרואידים של גידולים סרטניים.
- הערכת הרלוונטיות של מודל זה לגילוי תרופות.
- סיוע בזיהוי של תרופות אונקולוגיות חדשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ניתוק של קווי תאי סרטן באמצעות שטיפות BBS.
- שימוש בטריפסין לניתוק תאים ונטרול באמצעות מצע עשיר בסרום.
- גידול תאים בפורמט של פלטה בעלת 1536 בארות.
- סריקה של מועמדים פוטנציאליים לתרופות בשיטה של סריקה רב-נפיחה (high-throughput).
תוצאים עיקריים
- השיטה מאפשרת גידול יעיל של ספרואידים של גידולים ב-3D.
- יכולות של סריקה בתפוקה גבוהה (High-throughput) מאפשרות סריקה מהירה של מועמדים לתרופות.
- הוכחת הרלוונטיות של מודל תרבית ה-3D בגילוי תרופות.
- פוטנציאל לשיפור תהליך הזיהוי של hit-to-lead.
מסקנות
- שיטה זו לתרבית ספרואידים של גידולים בתלת-ממד משפרת את מאמצי גילוי התרופות.
- היא מספקת ייצוג מדויק יותר של הביולוגיה של הגידול.
- גישה זו עשויה להוביל לזיהוי של טיפולים אונקולוגיים חדשניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לפער התרגומי בתהליכי גילוי תרופות לאונקולוגיה, על ידי כך שהיא מאפשרת סריקה בסביצועים גבוהים (high-throughput screening) במודל ספרואידים של גידולים בתלת-ממד (3D) הרלוונטי מבחינה פיזיולוגית. היא תומכת בביטחון ניבוי לאישור המטרה (target validation) באמצעות חשיפת תגובות שונות לתרופות בין תנאי תרבית בדו-ממד (2D) לבין תנאי תרבית בתלת-ממד (3D). הגישה משפרת את זיהוי ה-hit-to-lead עבור מעכבי מסלול MAPK במודלים של סרטן המוגדרים גנטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במערכת רלוונטית למחלה, הלוכדת אינטראקציות תאיות תלת-ממדיות וארגון מרחבי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי השוואת יעילות תרכובות בתרביות 2D לעומת 3D כדי לזהות פעילות תלוית-הקשר.
- ערך ניבוי: מסייע בזיהוי מולקולות מובילות (lead identification) על ידי זיהוי רגישות דיפרנציאלית במודלים של סרטן ריאה מסוג non-small cell עם מוטציה ב-KRAS תחת תנאי 3D.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מערכת תרבית תלת-ממדית סטנדרטית וניתנת לשחזור, התואמת לפורמטים של 1536 בארות לצורך סריקת תרכובות בהיקף רחב.
- ערך תפעולי: מאפשר קריאות לומנסנס כמותיות מבוססות ATP למדידת עיכוב גדילה וליצירת עקומות תגובה למינון וערכי IC50.
- מוכנות הבדיקה: משתמש בפיזור אקוסטי למסירת תרכובות מדויקת בנפחים של ננו-ליטרים ובדגירה אטומה למניעת התאיידות, מה שמבטיח את שלמות הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מגשר בין תהליכי גילוי לתהליכי עבודה פרה-קליניים על ידי מידול אינטראקציות בין הגידול לסטרומה ותנאים דמויי מטריקס חוץ-תאי בפורמט בר-התרחבות.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר תצפית על הפעלה פרדוקסלית של גדילה במוטציות של RAF dimer, דבר המסייע בגיבוש אסטרטגיות לטיפול משולב והפחתת סיכונים של מועמדים קליניים.
- הלימה של סממנים ביולוגיים: תומך בהערכה של מעכבים ספציפיים למסלולים (למשל, MAPK) ברקעים מוגדרים גנטית, כדי לבחון מתאם בין הגנוטיפ לתגובה התרופתית.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ומאפשרת הערכה מוקדמת של יעילות התרכובת בהקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית לפני השקעה בשלב הפרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי חשיפת האופן שבו תרבית תלת-ממדית משנה את הרגישות לתרופות במודלים מונעי אונקוגנים, כגון NSCLC עם מוטציה ב-KRAS.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור באמצעות יצירה סטנדרטית של ספרואידים בלוחות בעלי 1536 בארות, עם פרוטוקולי אינקובציה ואיטום מבוקרים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה כמותית של המשתנה התלוי באמצעות נורמליזציה של לומינסנציית ATP ביחס לבקרי DMSO, ובכך מקלה על חישוב IC50 וניתוח עוצמה השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית על ידי מידול ארכיטקטורת גידול מרחבית ואינטראקציות קלונליות שאינן קיימות במערכות דו-ממדיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר לסריקת קווי תאי סרטן מגוונים וספריות תרכובות המכוונות למסלולים שמורים כגון MAPK.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות השוואה ישירה של תגובות תרופתיות ב-2D וב-3D.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה באמצעות תהליכי עבודה בלוחות של 1536 בארות התואמים למערכות רובוטיות ודגירה אטומה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי זיהוי תרכובות בעלות פעילות תלוית-הקשר, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מועמדים (leads) מותאם-סיכון על בסיס יעילות דיפרנציאלית במודלים רלוונטיים פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של תרביות תאים תלת-ממדיות, כולל נטרול טריפסין, ספירת תאים וזריעה סטרילית.
- תלוי במכשור כגון מערכות קסטות מבוססות משאבה פריסטלטית, מפזרים אקוסטיים, אינקובטורים מסתובבים ומדי לומינומטר של פלטות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי איטום, פרמטרים של אינקובציה (37°C, 10rpm, 5% CO2, 95% humidity), ונהלי נרמול נתונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור שורות תאי סרטן שונות, שכן יעילות היווצרות הספרואידים עשויה להשתנות למרות היווצרות מוצלחת בשורות תאים מבוססות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך במניעת אידוי במהלך אינקובציות ממושכות ואופטימיזציה של מינון תרכובות בנפחים של ננולטר.
