CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

המטרה הכוללת של CARIP-Seq היא לסקור RNA הקשורים לכרומטין ברחבי הגנום. המטרה של ChIP-Seq היא להעריך אינטראקציות חלבון-DNA בקנה מידה עולמי בתאי גזע עובריים. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האפיגנטיקה ותאי הגזע, לזהות את מיקום הגנום, גורמי שעתוק או קשירת רגולטור אפיגנטי או שינוי היסטון או RNA הקשורים לכרומטין בתאי גזע עובריים.

היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מאפשרות חקירה בלתי משוחדת בכל הגנום של RNA הקשורים למרכיבי כרומטין וזיהוי גלובלי של אינטראקציות DNA חלבון. למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי הביולוגיה של תאי גזע עובריים, ניתן ליישם אותן גם על סוגי תאי יונקים אחרים כדי לחקור ביולוגיה של סרטן או מחלות אנושיות אחרות. כדי לקצור את תאי הגזע העובריים, שטפו תחילה את התאים במי מלח עם פוספט.

לאחר מכן, נתק את התאים עם 0.25% טריפסין, שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הניסיון, יש להשעות מחדש את התאים במדיום MEF שחומם מראש, בתוספת סרום בקר עוברי של 10%. לאחר מכן, הוסיפו 37% פורמלדהיד לתאים בצינור חרוטי לריכוז סופי של 1% ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות כדי לקשר בין התאים.

כדי לעצור את תגובת הקיבוע, הוסף 1.25 גליצין מולרי מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס לריכוז סופי של 0.125 טוחנת. לאחר מכן, הנח את הצינור על מסובב והפוך אותו בשמונה סיבובים לדקה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, צנטריפוגה את הדגימה ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם מי מלח חוצצים פוספט מקורר מראש ושוב צנטריפוגה את הדגימה. לאחר מכן, הסר את מי המלח הפוספטים והקפיא את התאים בחנקן נוזלי למשך דקה.

לאחר שתאי הגזע העובריים מופשרים על קרח, השעו מחדש את הגלולה ב-2.5 מיליליטר של מאגר סוניקציה. כדי לחקור גורמי שעתוק או גורמים אפיגנטיים, השעו מחדש את כדור התא במאגר סוניקציה ללא נתרן דודציל סולפט. לשינויים בהיסטון, השעו מחדש את כדור התא במאגר המכיל נתרן דודציל סולפט.

לאחר מכן, עבור משקעים חיסוניים של כרומטין, סוניקציה של הכרומטין למשך 14 עד 18 מחזורים במשרעת של 40% עם מצב מנוחה של 30 שניות ו-30 שניות מנוחה. כדי להמיס את הכרומטין עבור גורם החלבון ChIP, השלם את מאגר הסוניקציה ב-28 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט. עבור גורמי חלבון בשינויים בהיסטון, הוסף 28 מיקרוליטר נתרן דאוקסיכולט ו -0.28 מיליליטר של 10% טריטון X-100 וערבב היטב.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות מראש את הכרומטין. בצינור קשירה נמוך של 1.5 מיליליטר, הוסף 40 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים A או G. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם 600 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט והעבירו את הצינור עם החרוזים על מתלה המכיל מגנט ודגרו למשך דקה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הסר את מי המלח הפוספטים ושוב השהה את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט. לצינור, הוסיפו שניים עד ארבעה מיקרוגרם של נוגדן ודגרו אותו על ידי הנחתו על מסובב למשך 40 דקות בשמונה סיבובים לדקה כדי לקדם את קשירת הנוגדנים לחרוזים. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט כדי לשטוף את החרוזים.

לאחר הכביסה, דגרו את תמצית הכרומטין הסוניקטיבית על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את החלבונים הקשורים לכרומטין. למחרת, שטפו את החרוזים ודגרו עם מאגר RIPA, מאגר RIPA עם מלח, מאגר ליתיום כלוריד, מאגר Tris-EDTA עם Triton X-100 ומאגר Tris-EDTA, כל אחד למשך 10 דקות על מסובב. כדי להצליב את הקישור ל-ChIP, השהה מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA.

לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 10% נתרן דודציל סולפט וחמישה מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K, ודגרו על החרוזים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, למחרת, הפכו את הצינורות כמה פעמים, השאירו אותם על המדף המגנטי והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. לאחר מכן, שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA, המכילים 0.5 נתרן כלורי מולארי ושלבו את שני הסופרנטנטים.

כדי להצליב עבור CARIP, השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 10% נתרן דודציל סולפט וחמישה מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ודגרו על החרוזים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד 12 שעות. שוב, הפוך את הצינור מספר פעמים והנח על המדף המגנטי כדי להעביר את הסופרנטנט לצינור טרי.

לאחר מכן, שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חוצץ Tris-EDTA, המכילים 0.5 נתרן כלורי מולארי ולאחר מכן שלבו את שני הסופרנטנטים. לבסוף, בודד את דגימת ה-RNA על ידי שימוש באלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם ביחס של 25 עד 24 לנפח אחד. לאחר מכן, השתמש ב-DNase כדי להסיר DNA מדגימת ה-RNA המשקעת החיסונית הקשורה לכרומטין.

לאחר מכן, הוסף מאגר 10X DNase לדגימת CARIP והתאם את עוצמת הקול הסופית לריכוז 1X. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, סנתז את הגדיל הראשון של DNA משלים על ידי הגדרת תגובת PCR על ידי הוספת 10.5 מיקרוליטר RNA ומיקרוליטר אחד של שלושה מיקרוגרם למיליליטר של פריימרים הקסמרים אקראיים.

כדי לפגוע במבנה המשני, ראשית, דגרו את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת המאסטר לצינור ה-PCR ודגרו בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של 200 יחידות למיקרוליטר של כתב עילי שניים והפעל את תוכנית התרמו-ציקלר.

כדי לסנתז את הגדיל השני של ה-DNA המשלים, הגדר את התגובה על קרח על ידי הוספת הריאגנטים, המאגר והאנזימים. לאחר מכן, מערבולת לערבב את הריאגנטים בעדינות ולדגור בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר סינתזה של ה-DNA, טהר את ה-DNA המשלים באמצעות ערכת טיהור PCR.

לאחר מכן, איחוי ה-DNA הדו-גדילי, השתמש בסוניפייר של אמבט מים ובצינור של 1.5 מיליליטר כדי לחלוק את ה-DNA לגודל של 250 עד 500 זוגות בסיסים למשך שלוש פעמים 10 דקות או ארבע פעמים 10 דקות. לאחר מכן, הכן את הספרייה ובצע ריצוף מהדור הבא. כאן, תמונות ניגודיות פאזה של תאי גזע עובריים צולמו כדי לדמיין את מושבות תאי הגזע.

בפרוטוקול זה, התאים תורבתו בנוכחות או בהיעדר פיברובלסטים עובריים של עכברים מושבתים עם LIF ו/או GSK3i במצע התרבית כדי למנוע התמיינות של התאים. לאחר מכן, כדי לדמיין את יעילות הסוניקציה של כרומטין תאי הגזע העובריים הצולבים, הועמס DNA דו-גדילי סוניקטיבי על ג'ל אגרוז של 2%. תמונת הג'ל מציגה כרומטין גזוז בטווח של 200 עד 500 זוגות בסיסים.

לאחר מכן, ספריות ChIP-Seq נוצרו ורצפו באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא כדי להעריך את התפוסה הכלל-גנומית של אנזים משנה היסטון ושינויים בהיסטון בתאי גזע עובריים. מתצוגת הדפדפן המותאמת אישית של UCSC, טרימתילציה מועשרת של H3K4, דימתילציה של H3K4 ו-KDM5B נראים בגן הליבה של מווסת הפלוריפוטנטיות, POU5F1 ובאשכול HOXC. ניתוח CARIP-Seq בוצע גם כדי להעריך RNA הקשורים לכרומטין בתאי גזע עובריים.

תצוגת הדפדפן המותאמת אישית של UCSC מציגה תפוסה של RNA הקשור ל-H4K20 trimethylation ו-H4K20 trimethylation בתאי גזע עובריים. מתוצאות CARIP-Seq, ניתן לפרש שלמרות שה-RNA קשור לטרימתילציה של H4K20, ייתכן שהוא לא מקיים אינטראקציה עם הלוקוס המסוים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסקור RNA הקשורים לכרומטין באמצעות CARIP-Seq ולזהות אינטראקציות DNA חלבון בקנה מידה עולמי בתאי גזע עובריים.