Name: CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: למד שיטות CARIP-Seq ו-ChIP-Seq לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין ואינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים. טכניקות אלו מאפשרות מיפוי אפיגנומי גלובלי ומחקר מתקדם בתחומי האפיגנטיקה והביולוגיה של תאי גזע.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ויין סטייט, Karmanos סרטן אוניברסיטאי, מענק מן הלאומי ללב, ריאות ודם המכון (1K22HL126842-01A1) הוענק B.L.K. עבודה זו מנוצל ויין המדינה אוניברסיטת גבוהה ביצועי מחשוב ברשת עבור משאבים חישובית (< https://www.grid.wayne.edu/>). אנו מודים ג'יג'י Kurup על סיוע עם ניתוח נתונים CARIP-Seq.
התרומות של המחברים:
B.L.K. היגו בשיטת CARIP-Seq, תוכנן ביצעו ניסויים שבב-Seq ו- CARIP-Seq, ניתח את הנתונים רצף ו ניסח את כתב היד. כל המחברים לקרוא, אישר את הגרסה הסופית של כתב היד הזה.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

שבב-Seq היא שיטה שימושית כדי להעריך את המיקום של אינטראקציות חלבון העולמי-DNA (למשל., גורמי שעתוק/שינוי שינויים אנזימים/היסטון ודנ א היסטון) תאים ES, בעוד פרוטוקול CARIP-Seq פיתח הוא שימושי חוקר את השיוך ברמת הגנום של RNAs המרכיבים כרומטין. שבב-Seq הוא כלי בסיסי המשמש כדי להעריך נופים epigenetic של תאים ES, סוגי תאים אחרים. האיכות של שבב-Seq וספריות CARIP-Seq תלויה ברובה נוגדנים שבב-כיתה. ההתאמה של נוגדנים עבור שבב-Seq יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-PCR, איפה ≥ 3 כדי 5-fold העשרה-אזורי בקרה חיובית ביחס אזורי...

החלטות גורל תאי גזע עובריים (ES) מוסדרים על ידי תקשורת בין אותות חוץ-תאית וכן שורה של גנים ברמת השעתוק-וסתים, כולל היסטון מגבילים, תרגום שלאחר שינוי של היסטון זנבות. אינטראקציות אלה להקל על נגישות כרומטין, אריזה של כרומטין לתוך אחד של שתי מדינות: euchromatin, אשר פתוח ופעיל transcriptionally, ואת הטרוכרומטין, אשר הוא קומפקטי וקל בדרך כלל transcriptionally לא פעיל. גורמי שעתוק DNA רצף ספציפי איגוד הזיקות, עמית מכפילי epigenetic עם אזורים תהיה להשתתף בשליטה על ביטוי גנים. הדור הבא רצפי שיטות, כולל צ'יפ-Seq1, היה אינסטרומנטלי מיפוי הגנום כולו רשתות תעתיק מהותי עבור ES תא התחדשות עצמית, pluripotency2,3,4 5, ,6. יתר על כן, בעוד immunopreciation RNA ואחריו הדור הבא רצף (RIP-Seq)7 ההערכות של אינטראקציות חלבון ה-RNA מציע כי ה-DNA מחייבת חלבונים אינטראקציה עם RNAs להסדיר אירועים תעתיק7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, מחקרים מעטים חקרו לוקליזציה ברמת הגנום של RNAs המשויך כרומטין12או גלובלי האינטראקציות בין שינויים RNA והיסטון. זמן אי קידוד RNAs (lncRNAs) הם קבוצה אחת של RNAs אשר נמצאו להסדיר את הפעילות של חלבונים הקשורים כרומטין13,14,15. לדוגמה, Xist הוא lncRNA המווסת, בתאים בתרבית של נקבה, איון של כרומוזום X אחד, דרך הגיוס של epigenetic repressors16,17. אולם, מלוא הספקטרום של RNAs הקשורים עם כרומטין הוא אינו מודע לקיומם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הרומן, הקשורים כרומטין RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq), לזיהוי הקשורים כרומטין RNAs על בסיס הגנום כולו, תאים ES, כולל הכנה ספריה עבור הדור הבא רצפי, צ'יפ-Seq למפות תפוסת הכללית של שינויים היסטון, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic. שלא כמו שאר שיטות RIP-Seq7, CARIP-Seq כולל שלבים crosslinking ו sonication, המאפשרים זיהוי ישיר RNAs הקשורים עם כרומטין. יחד, צ'יפ-Seq הוא כלי רב עוצמה לזיהוי אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו, בזמן CARIP-Seq היא שיטה חזקה סקר RNAs הקשורים רכיבים כרומטין.

<table><tbody><tr><td>גורם מעכב לוקמיה של עכברים (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 או 107 יחידות</td></tr><tr><td>GSK3&beta; מעכב CHIR99021 (GSK3i)</td>ממס <td>גזעי</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>מעכב MEK PD0325901 (MEKi)</td>ממס <td>גזעי</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), גלוקוז</td> <td>גבוהInvitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), פנול</td><td>אדום Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES סרום בקר עוברי מוסמך, 500 מ"ל</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% תמיסת ג'לטין</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G7126-500G</td><td>1.25 M חיבור מלאי במים</td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td><td>איכות ביולוגית</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)</td><td>סיגמא</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>רוש</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן דודציל סולפט (20%)</td> <td>ביולוגי איכותי</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 סוניפייר</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון G למשקעים חיסוניים</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון A עבור משקעים חיסוניים</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads חלבון A/חלבון G ו חבילת מגנט מתנע</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>ליתיום כלוריד</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ערכת טיהור mRNA (לטיהור mRNA מהכנות RNA כוללות)</td> <td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript סינתזת cDNA דו-גדילית ערכת</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיקון קצה DNA</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5 'exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 מ"מ)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX agarose gels, 2%</td> <td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion תערובת מאסטר 2X בנאמנות גבוהה עם מאגר HF</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ טרימתיל-היסטון H3 (Lys4) - נוגדן מאומת ChIP</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-היסטון H3 (די מתיל K4) [Y47] - כיתה ChIP (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar צלחות תרבית תאים תחתונות שטוחות (6 בארות)</td><td>פישר</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>פלקון כלי תרבית רקמות סטנדרטיים (10 ס"מ)</td><td>פישר</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>pico Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute ערכת ניקוי תגובה</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי היסטון H4 (טרי מתיל K20) - כיתה ChIP (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>מסובב רעידת אדמה</td><td>תרמו פישר</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמת Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq ו שבב-seq: שיטות לזיהוי rnas הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-dna בתאי גזע עובריים

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

גזע עובריים (ES) תא התחדשות עצמית, בידול נשלטת על ידי אותות חיצוני ורשתות מהותי של גורמי שעתוק epigenetic regulators, שינויים פוסט-תרגום של שינויים היסטוניים combinatorially להשפיע על הגן מצב ביטוי של גנים הסמוכה. RNA הוכח גם לקיים אינטראקציה עם חלבונים שונים כדי לווסת כרומטין דינמיקה של ביטוי גנים. כרומטין-הקשורים RNA immunoprecipitation (CARIP) ואחריו הדור הבא רצפי (CARIP-Seq) היא שיטה סקר RNAs המשויך חלבוני כרומטין, בעוד immunoprecipitation כרומטין ואחריו (הדור הבא רצפי ChIP-Seq) היא טכניקה גנומיקה חזק כדי למפות את המיקום של שינוי post-translational של שינויים היסטוניים, גורמי שעתוק, מכפילי epigenetic בקנה מידה עולמי תאים ES. כאן, אנו מתארים שיטות לבצע CARIP-Seq שבב-Seq, כולל בניית ספריה עבור הדור הבא רצף, ליצירת RNA הקשורים כרומטין הכללית ומפות epigenomic ES תאים.

בהצלחה חקרנו את הכריכה ברמת הגנום של H3K4me3, H3K4me2 ו- KDM5B ES תאים באמצעות פרוטוקול זה צ'יפ-Seq6. ES התאים היו בתרבית בתנאי נטולת מזין (איור 1), קישורים צולבים כמתואר לעיל. Sonication לאחר מכן שבוצעה כמתואר בשלב 3.2 של פרוטוקול שבב-Seq, והוא מוערך על ידי הפעלת הדנ א על 2% agarose ג'ל (איור 2). בשלב הבא, שבב בוצע כפי שמתואר בשלב 4, ספריית הכנה בוצע כפי שמתואר בשלב 6. שבב-Seq ספריות היו רציף על פלטפורמת ...

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

המטרה הכוללת של CARIP-Seq היא לסקור RNA הקשורים לכרומטין ברחבי הגנום. המטרה של ChIP-Seq היא להעריך אינטראקציות חלבון-DNA בקנה מידה עולמי בתאי גזע עובריים. שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האפיגנטיקה ותאי הגזע, לזהות את מיקום הגנום, גורמי שעתוק או קשירת רגולטור אפיגנטי או שינוי היסטון או RNA הקשורים לכרומטין בתאי גזע עובריים.היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מאפשרות חקירה בלתי משוחדת בכל הגנום של RNA הקשורים למרכיבי כרומטין וזיהוי גלובלי של אינטראקציות DNA חלבון. למרות ששיטות אלה יכולות לספק תובנה לגבי הביולוגיה של תאי גזע עובריים, ניתן ליישם אותן גם על סוגי תאי יונקים אחרים כדי לחקור ביולוגיה של סרטן או מחלות אנושיות אחרות. כדי לקצור את תאי הגזע העובריים, שטפו תחילה את התאים במי מלח עם פוספט.לאחר מכן, נתק את התאים עם 0.25% טריפסין, שחומם מראש ל -37 מעלות צלזיוס. לאחר הניסיון, יש להשעות מחדש את התאים במדיום MEF שחומם מראש, בתוספת סרום בקר עוברי של 10%. לאחר מכן, הוסיפו 37% פורמלדהיד לתאים בצינור חרוטי לריכוז סופי של 1% ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות כדי לקשר בין התאים.כדי לעצור את תגובת הקיבוע, הוסף 1.25 גליצין מולרי מקורר מראש בארבע מעלות צלזיוס לריכוז סופי של 0.125 טוחנת. לאחר מכן, הנח את הצינור על מסובב והפוך אותו בשמונה סיבובים לדקה למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חמש דקות, צנטריפוגה את הדגימה ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סיום הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם מי מלח חוצצים פוספט מקורר מראש ושוב צנטריפוגה את הדגימה. לאחר מכן, הסר את מי המלח הפוספטים והקפיא את התאים בחנקן נוזלי למשך דקה.לאחר שתאי הגזע העובריים מופשרים על קרח, השעו מחדש את הגלולה ב-2.5 מיליליטר של מאגר סוניקציה. כדי לחקור גורמי שעתוק או גורמים אפיגנטיים, השעו מחדש את כדור התא במאגר סוניקציה ללא נתרן דודציל סולפט. לשינויים בהיסטון, השעו מחדש את כדור התא במאגר המכיל נתרן דודציל סולפט.לאחר מכן, עבור משקעים חיסוניים של כרומטין, סוניקציה של הכרומטין למשך 14 עד 18 מחזורים במשרעת של 40% עם מצב מנוחה של 30 שניות ו-30 שניות מנוחה. כדי להמיס את הכרומטין עבור גורם החלבון ChIP, השלם את מאגר הסוניקציה ב-28 מיקרוליטר של 10% נתרן דודציל סולפט. עבור גורמי חלבון בשינויים בהיסטון, הוסף 28 מיקרוליטר נתרן דאוקסיכולט ו -0.28 מיליליטר של 10% טריטון X-100 וערבב היטב.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-10,000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לנקות מראש את הכרומטין. בצינור קשירה נמוך של 1.5 מיליליטר, הוסף 40 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים A או G. לאחר מכן, שטפו את החרוזים עם 600 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט והעבירו את הצינור עם החרוזים על מתלה המכיל מגנט ודגרו למשך דקה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הסר את מי המלח הפוספטים ושוב השהה את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מי מלח חוצץ פוספט. לצינור, הוסיפו שניים עד ארבעה מיקרוגרם של נוגדן ודגרו אותו על ידי הנחתו על מסובב למשך 40 דקות בשמונה סיבובים לדקה כדי לקדם את קשירת הנוגדנים לחרוזים. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מי מלח חוצצים פוספט כדי לשטוף את החרוזים.לאחר הכביסה, דגרו את תמצית הכרומטין הסוניקטיבית על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את החלבונים הקשורים לכרומטין. למחרת, שטפו את החרוזים ודגרו עם מאגר RIPA, מאגר RIPA עם מלח, מאגר ליתיום כלוריד, מאגר Tris-EDTA עם Triton X-100 ומאגר Tris-EDTA, כל אחד למשך 10 דקות על מסובב. כדי להצליב את הקישור ל-ChIP, השהה מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA.לאחר מכן הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 10% נתרן דודציל סולפט וחמישה מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K, ודגרו על החרוזים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר הדגירה, למחרת, הפכו את הצינורות כמה פעמים, השאירו אותם על המדף המגנטי והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. לאחר מכן, שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA, המכילים 0.5 נתרן כלורי מולארי ושלבו את שני הסופרנטנטים.כדי להצליב עבור CARIP, השעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר Tris-EDTA. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 10% נתרן דודציל סולפט וחמישה מיקרוליטרים של 20 מיליגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ודגרו על החרוזים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע עד 12 שעות. שוב, הפוך את הצינור מספר פעמים והנח על המדף המגנטי כדי להעביר את הסופרנטנט לצינור טרי.לאחר מכן, שטפו את החרוזים המגנטיים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חוצץ Tris-EDTA, המכילים 0.5 נתרן כלורי מולארי ולאחר מכן שלבו את שני הסופרנטנטים. לבסוף, בודד את דגימת ה-RNA על ידי שימוש באלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם ביחס של 25 עד 24 לנפח אחד. לאחר מכן, השתמש ב-DNase כדי להסיר DNA מדגימת ה-RNA המשקעת החיסונית הקשורה לכרומטין.לאחר מכן, הוסף מאגר 10X DNase לדגימת CARIP והתאם את עוצמת הקול הסופית לריכוז 1X. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, סנתז את הגדיל הראשון של DNA משלים על ידי הגדרת תגובת PCR על ידי הוספת 10.5 מיקרוליטר RNA ומיקרוליטר אחד של שלושה מיקרוגרם למיליליטר של פריימרים הקסמרים אקראיים.כדי לפגוע במבנה המשני, ראשית, דגרו את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן על קרח למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת המאסטר לצינור ה-PCR ודגרו בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של 200 יחידות למיקרוליטר של כתב עילי שניים והפעל את תוכנית התרמו-ציקלר.כדי לסנתז את הגדיל השני של ה-DNA המשלים, הגדר את התגובה על קרח על ידי הוספת הריאגנטים, המאגר והאנזימים. לאחר מכן, מערבולת לערבב את הריאגנטים בעדינות ולדגור בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר סינתזה של ה-DNA, טהר את ה-DNA המשלים באמצעות ערכת טיהור PCR.לאחר מכן, איחוי ה-DNA הדו-גדילי, השתמש בסוניפייר של אמבט מים ובצינור של 1.5 מיליליטר כדי לחלוק את ה-DNA לגודל של 250 עד 500 זוגות בסיסים למשך שלוש פעמים 10 דקות או ארבע פעמים 10 דקות. לאחר מכן, הכן את הספרייה ובצע ריצוף מהדור הבא. כאן, תמונות ניגודיות פאזה של תאי גזע עובריים צולמו כדי לדמיין את מושבות תאי הגזע.בפרוטוקול זה, התאים תורבתו בנוכחות או בהיעדר פיברובלסטים עובריים של עכברים מושבתים עם LIF ו/או GSK3i במצע התרבית כדי למנוע התמיינות של התאים. לאחר מכן, כדי לדמיין את יעילות הסוניקציה של כרומטין תאי הגזע העובריים הצולבים, הועמס DNA דו-גדילי סוניקטיבי על ג'ל אגרוז של 2%. תמונת הג'ל מציגה כרומטין גזוז בטווח של 200 עד 500 זוגות בסיסים.לאחר מכן, ספריות ChIP-Seq נוצרו ורצפו באמצעות פלטפורמת ריצוף מהדור הבא כדי להעריך את התפוסה הכלל-גנומית של אנזים משנה היסטון ושינויים בהיסטון בתאי גזע עובריים. מתצוגת הדפדפן המותאמת אישית של UCSC, טרימתילציה מועשרת של H3K4, דימתילציה של H3K4 ו-KDM5B נראים בגן הליבה של מווסת הפלוריפוטנטיות, POU5F1 ובאשכול HOXC. ניתוח CARIP-Seq בוצע גם כדי להעריך RNA הקשורים לכרומטין בתאי גזע עובריים.תצוגת הדפדפן המותאמת אישית של UCSC מציגה תפוסה של RNA הקשור ל-H4K20 trimethylation ו-H4K20 trimethylation בתאי גזע עובריים. מתוצאות CARIP-Seq, ניתן לפרש שלמרות שה-RNA קשור לטרימתילציה של H4K20, ייתכן שהוא לא מקיים אינטראקציה עם הלוקוס המסוים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לסקור RNA הקשורים לכרומטין באמצעות CARIP-Seq ולזהות אינטראקציות DNA חלבון בקנה מידה עולמי בתאי גזע עובריים.

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ההבחנה בין ESC עולה בקנה אחד עם תא מסוג שינויים ספציפיים במבנה ובהרכב של הכרומטין. זיהוי של שינויים אלה מספק תובנות רבות ערך את המנגנונים שמגדירים stemcellness והתמיינות תאים. הכרומטין immunoprecipitation (שבב) מייצגת שיטת ערך לנתח את המנגנונים המולקולריים שבבסיס תא גזע בידול.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

סרטון זה מציג את השלבים הבסיסיים לביצוע ניתוח טרנסקריפטום שלם על דגימות חוט שדרה עוברי של אפרוח מנותח לאחר טרנספקציה עם אלקטרופורציה בביצית.

RNA-Seq ניתוח של ביטוי הגנים בדיפרנציאל חוט השדרה Electroporated אפרוח עוברי

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

כאן, אנו מתארים של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) ופרוטוקול שבב-seq ספריית הכנה ליצירת פרופילים epigenomic גלובל מדגימות עובריים נמוך-שפע עוף.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אינטראקציות בין DNA-DNA כרומטין ל-RNA למיפוי ארגון הגנום התלת-ממדי הקשור ל-RNA.

שיטת האינטראקציה של כרומטין DNA-DNA המקושר ל-RNA

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

למד שיטות CARIP-Seq ו-ChIP-Seq לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין ואינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים. טכניקות אלו מאפשרות מיפוי אפיגנומי גלובלי ומחקר מתקדם בתחומי האפיגנטיקה והביולוגיה של תאי גזע.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

גלה סרטונים נוספים