אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעה של אבלציה בלייזר של נוירונים מסוימים על פעילות והתנהגות מעגלים. בעזרת טכניקה ניסויית זו אנו יכולים לבחון את נחיצותם של נוירונים במעגל העומד בבסיס ההתנהגות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח שלנו בתחום ההתנהגות ומדעי המוח, כגון כיצד נתפס טרף וכיצד התנהגות שנלכדה על ידי פעילות עצבית.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לכרות נוירונים באופן ספציפי בגלל התיוג הגנטי של נוירונים אלה וגם רזולוציה מרחבית גבוהה של הלייזר. לאחר גידול הזחלים והרכבתם באגרוז נמס נמוך של 2% על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את זחלי האגרוז המוטבעים מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים והפעל את מערכת המיקרוסקופיה. פתח את תוכנת רכישת התמונות ותחת לשונית הלייזר לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את הלייזר.

המתן עד שמצב הלייזר ישתנה ממצב עסוק למצב נעול. בכרטיסיית הערוצים הגדר את אורך הגל של הלייזר ל-880 ננומטר עבור אבלציה של EGFP או 800 ננומטר עבור אבלציה של GCaMP. בחר את העדשה הסובייקטיבית פי 20 על-ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה.

לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה אתר, לחץ GFP כדי לשנות את המסלולים האופטיים ולהציג ישירות את הקרינה בעין. מרכז את מוח זחל דג הזברה בשדה הראייה, ולאחר מכן לחץ על לשונית הרכישה כדי לחזור למיקרוסקופ שני פוטונים ולהגדיר את עוצמת הלייזר והרווח. כתיעוד של התנאי לפני האבלציה לחץ על מחסנית Z כדי לבחור באפשרות Z stack

לאחר מכן, לאחר התמקדות בקצה הגחון של מוח הזחל, לחצו על כפתור ההגדרה הראשונה כדי להגדיר את הגבול התחתון, ולאחר שהתמקדו במשטח הגבי ביותר של המוח, לחצו על כפתור הגדר אחרון כדי להגדיר את הגבול העליון. לבסוף, לחץ על כפתור התחל ניסוי כדי להפעיל את רכישת תמונות מחסנית Z. לאחר מכן, בחר את העדשה הסובייקטיבית 63X על ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה.

לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה איתור כדי לעבור למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית. מרכז את התאים שיש לכרות בעין ולאחר מכן לחץ על לשונית הרכישה כדי לחזור למיקרוסקופ סריקת לייזר. בכרטיסייה מצב רכישה הגדר את גודל המסגרת ל-256 על 256

לחץ בשידור חי והתבונן בתאי העצב המעניינים. לאחר מכן, החל מהצד הגבי ביותר, מצא מישור מוקד שבו התאים המיועדים לכריתת נמצאים בפוקוס. באמצעות פונקציית האזורים סמן אזור עגול קטן בקוטר של כ-1/3 מגודל התא על כל נוירון כהחזר ROI.

הגדר את מהירות הסריקה ל-13.9 שניות לכל 256 על 256 פיקסלים, המתאימה לזמן שהייה בלייזר של כ-200 מיקרו-שניות לפיקסל או 200 מיקרו-שניות לחצי מיקרון. כמו כן, הגדר את מחזור האיטרציה לארבע חזרות. לחץ על התחל ניסוי כדי לבצע את סדרת הזמן ופונקציות ההלבנה.

השווה את התמונה לפני האבלציה לתמונה לאחר אבלציה במחזור סדרת הזמן כדי להבטיח שהפלואורסצנטיות בתאי המטרה נעלמת. לאחר מכן, הזיזו את מישור המוקד מעט עמוק יותר ובחרו את מישור המוקד הבא שבו מופיעים תאים לא מבוטלים. בצע את פונקציית ההלבנה כפי שהודגם זה עתה וחזור על התהליך עד שכל התאים במבנה העצבי המעניין הוסרו.

לאחר האבלציה בדוק את התאים לאיתור פלואורסצנטיות מבוטלת וחזור על הקרנת הלייזר במידת הצורך. לאחר ההקרנה יש לשחזר את הזחלים. בצע בזהירות חתכים זעירים בניצב באגרוז סביב הזחלים.

לאחר מכן, המתן עד שהדג ישחה החוצה מהאגרוז בכוחות עצמו כאשר חומר ההרדמה יתפוגג. לאחר גידול פרמציה והרדמה של זחל דג זברה על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את הזחלים בנקודת התכה נמוכה של 2% והסר מיד את כל האגרוז העודף כך שפני השטח של האגרוז ייראו מעט קמורים. בעזרת מחט חיתוך כוונו במהירות את הזחלים למצב זקוף.

לאחר מכן, בעזרת סכין כירורגית בצע כמה חתכים קטנים באגרוז כדי להסיר את האגרוז סביב ראש דג הזברה שמפנה מקום לפרמציום לשחות. הסר בזהירות את שאריות האגרוז על ידי שפיכת מי המערכת בעדינות על החדר. לאחר מכן, הכניסו פרמציום אחד לתא ההקלטה כדי לשמש כגירוי חזותי.

לאחר מכן הנח את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמת CMOS מדעית ובחר עדשת אובייקט 2.5X. הפעל את אפליקציית רכישת התמונות עבור המצלמה המצוידת לחץ על חלונית הרצף ובחר רשומת דיסק קשיח בחלונית.

במקטע הגדרת הסריקה, הגדר את ספירת הפריימים ל-900 או כל מספר מסגרת כולל אחר הרצוי. בחלונית הלכידה הגדר את זמן החשיפה ל-30 אלפיות השנייה ואת ה-binning לשניים על שניים. לחץ בשידור חי בחלונית הצילום כדי לאתר את הזחלים במצלמה view ופוקוס ולאחר מכן לחץ על עצור בשידור חי ולחץ על כפתור ההתחלה.

שמור את הסרט בפורמט cxd ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר הגדרת מערכת ההקלטה ההתנהגותית והכנסת הזחל לתא הקלטה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרו-פיפטה כדי לאסוף 50 פרמציה ולהניח אותן בתא ההקלטה. כדי להניח פתק כיסוי על גבי תא ההקלטה, הניחו טיפת מים קטנה על החלקת הכיסוי לפני הנחתה על פני המים של תא ההקלטה כדי למנוע הכנסת אוויר לתא.

הנח את תא ההקלטה במערכת התאורה. לאחר מכן, התחל את הקלטת קיטועי הזמן ב-10 פריימים לשנייה למשך 11 דקות. לבסוף, ניתוח ביצוע לפי פרוטוקול הטקסט.

בניסוי זה עם קו Gal4 המסמן גרעינים באזור הקדם-טקטי ותת-אוכלוסייה של נוירונים של נורת הריח. הנוירונים הקדם-טקטליים עברו ניתוק לייזר דו-צדדי. נוירוני הריח הוסרו כבקרה.

התוצאות מראות כי לייזר שני הפוטונים יכול להפחית תאים ממוקדים תוך השארת נויריטים סמוכים ללא פגיעה. בניסוי זה נחקרה הקישוריות התפקודית של נוירונים טרום-טקטיים המקרינים את האקסונים שלהם לעבר ה-ILH באופן מקביל. גם הפרטקטום וגם ה-ILH הראו פעילות עצבית בנוכחות הפרוקסימלית של הטרף, מה שמרמז על כך ששתי הפעילויות העצביות מונעות חזותית.

הדמיית סידן שימשה גם לצפייה בפעילות עצבית בפרטקטום וב-ILH בזחלים שעברו כריתת נוירונים קדם-טקטליים. הפרטקטום השמאלי שהוסר בלייזר הראה פעילות עצבית שיורית עד ללא פעילות עצבית. בנוסף, ה-ILH המקביל הראה פעילות עצבית שנעקרה באופן דרמטי, מה שמרמז על כך שהקלט העיקרי ל-ILH מגיע מה-pretectum המקביל

לעומת זאת, ה-ILH בצד השני של הפרטקטום הלייזר הראה פעילות עצבית דומה לפעילות העצבית בפרטקטום המקביל, מה שמרמז על כך שה-ILH הימני מקבל קלט מהפרטקטום הימני. לאחר השליטה ניתן לבצע אבלציה בלייזר תוך כשעה עבור כל זחל דג זברה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפרק רק את הנוירונים הממוקדים עם קרינת לייזר מתאימה, ולהימנע מנזקי חום על ידי הלייזר.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע אבלציה של נוירונים באזורי מוח אחרים כמו המוח הקדמי או המוח האחורי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד נוירונים אלה מעורבים בתפקודים קוגניטיביים או בתפקודים מוטוריים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים לחקור מעגלים עצביים פונקציונליים במודלים של דגי זברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע לייזר באופן ספציפי נוירונים במוח זחלי דגי הזברה ולהעריך את ההשלכות התפקודיות וההתנהגותיות.

אל תשכח שעבודה עם לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד לציית להוראות היצרן בעת ביצוע הליך זה.