Name: אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: למדו שיטת אבלציה עצבית מדויקת באמצעות לייזר שני-פוטונים בזחלים של דג זברה. טכניקה זו מאפשרת חקירת תפקידי נוירונים במעגלים עצביים ובהתנהגות ציד טרף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקרים אלה, במימון מענקים שהתקבלו מן MEXT, JSPS KAKENHI גרנט מספרים JP25290009, JP25650120, JP17K07494, JP17H05984.

<ol><li>Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+whole+picture%3A+A+comprehensive+imaging+approach+to+functional+mapping+of+circuits+in+behaving+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish.</a> Neuroscience. 296, 26-38 (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+visualization+with+an+improved+GCaMP+calcium+indicator+reveals+spatiotemporal+activation+of+the+spinal+motor+neurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).</li>
<li>Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+space+cadet+gene+controls+axonal+pathfinding+of+neurons+that+modulate+fast+turning+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements.</a> Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Sternberg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+Neurotoxin+to+Investigate+the+Contribution+of+Excitatory+Interneurons+to+Speed+Modulation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+zebrafish+behavior+with+halorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).</li>
<li>Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+visually+guided+behavior+by+distinct+populations+of+spinal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).</li>
<li>Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+projection+neurons+control+turning+behaviors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish.</a> Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).</li>
<li>Smear, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+glutamate+transport+at+a+central+synapse+limits+the+acuity+of+visual+perception+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish.</a> Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).</li>
<li>Bianco, I. H., Engert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visuomotor+transformations+underlying+hunting+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish.</a> Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).</li>
<li>Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+driven+chaining+of+elementary+swim+patterns+into+a+goal-directed+motor+sequence%3A+a+virtual+reality+study+of+zebrafish+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture.</a> Front Neural Circuits. 7, 86(2013).</li>
<li>Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2D+virtual+reality+system+for+visual+goal-driven+navigation+in+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae.</a> Sci Rep. 6, 34015(2016).</li>
<li>Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+of+neuronal+activity+during+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization of neuronal activity during perception.</a> Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).</li>
<li>Del Bene, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtering+of+visual+information+in+the+tectum+by+an+identified+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit.</a> Science. 330 (6004), 669-673 (2010).</li>
<li>Semmelhack, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+visual+pathway+for+prey+detection+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish.</a> Elife. 3, 04878(2014).</li>
<li>Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+object+size+in+retinotectal+microcircuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Classification of object size in retinotectal microcircuits.</a> Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).</li>
<li>Romano, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Neuronal+Network+Dynamics+Reveal+Circuit%27s+Functional+Adaptations+for+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior.</a> Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).</li>
<li>Barker, A. J., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+decision+making+in+the+zebrafish+tectum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum.</a> Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).</li>
<li>Ewert, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642675027">Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior</a>. , Springer Verlag. (1980).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+hypothalamic+feeding+centre+upon+visual+prey+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection.</a> Nat Commun. 8, 15029(2017).</li>
<li>Muto, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+in+Free-Swimming+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="https://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>National BioResource Project Paramecium. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en">http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en</a> (2017).</li>
<li>Fiji. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://fiji.sc">https://fiji.sc</a> (2017).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Mueller, T., Wullimann, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU-%2C+neuroD+%28nrd%29-+and+Hu-studies+reveal+unusual+non-ventricular+neurogenesis+in+the+postembryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).</li>
<li>Muto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+of+visual+behavior+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish.</a> PLoS Genet. 1 (5), 66(2005).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
</ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לדווח.

למרות שני הפוטונים הלייזר יש רזולוציה מרחבית מעולה כדי במיוחד ablate נוירונים בודדים, נהדר זהירות יש לנקוט כדי למנוע נזק בלתי רצויה על רקמת המוח עקב חום. הצעד החשוב ביותר לניסוי אבלציה היא לקבוע את כמות לייזר הקרנה אופטימלית. הקרנה לא מספיקות נכשלת להרוג את הנוירונים. הקרנה מדי יהיה חום-פגיעה ברקמות שמסביב, אשר תגרום תופעות לוואי. הטווח האופטימלי של לייזר הקרנה (תחומי ROIs, מספר חזרות, ומהירות סריקה) נראה צר. מספר גורמים משפיעים על יעילות הטיפול.
ראשון, באמצעות הכתב שונה פלורסנט חלבונים, התנאי...

כדי להבין איך התנהגות נובעת פעילות. עצבית במוח, יש צורך לזהות את המעגלים העצביים המעורבים הדור של התנהגות זו. בשלב הזחל, מספק דג זברה במודל חיה אידיאלית עבור לומדים של תפקוד המוח הקשורים להתנהגות כי המוח שלהם קטן, שקופים מאפשרים לחקור פעילות. עצבית ברזולוציה הסלולר באזור רחב של המוח תוך כדי התבוננות של התנהגות1. הדמיה של פעילות. עצבית בנוירונים מסוים הפך אפשרי דרך ההמצאה של אינדיקטורים מקודדים גנטית סידן (Ca) (GECIs) כגון GCaMP2. דג זברה מהונדס GCaMP הוכיחו להיות שימושי עבור שיוך המעגל עצבית תפקודית התנהגות על-ידי עריכת Ca הדמיה ב מתנהג בעלי חיים3.
בעוד דימות Ca יכולים להדגים מתאמים בין פעילות. עצבית והתנהגות, להראות סיבתיות, דיכוי פעילות. עצבית ובדיקה שלו consequence(s) על התנהגות הם צעדים חשובים. ישנן מספר דרכים להשיג זאת: שימוש מוטציה גנטית שמשנה את המעגלים העצביים ספציפי4, ביטוי של רעלנים עצביים ב-5,נוירונים ספציפיים6, שימוש בכלים optogenetic כגון halorhodopsin7, ו לייזר אבלציה של נוירונים יישוב8,9. אבלציה לייזר מתאים במיוחד עבור ביטול פעילות במספר קטן יחסית של נוירונים ספציפיים. חיסול בלתי הפיך של פעילות. עצבית על ידי הריגת נוירונים מקלה על הערכת השלכות התנהגותיות.
התנהגות מעניין אחד זה יכול להיות שנצפו בשלב הזחל בתוך דג זברה היא ללכוד את הטרף (איור 1א'). התנהגות זו מונחה באופן חזותי, מכוון מטרה מספק מערכת ניסויית רייטינג לצורך המחקר של זיהוי של התפיסה החזותית, טרנספורמציה visuomotor11,12,13, חדות הראייה10 אובייקטים14,15,16,17,18, קבלת החלטות19. איך טרף מזוהה על ידי טורפים, כיצד זיהוי הטרף מוביל טרף לתפוס התנהגות כבר בשאלה מרכזית neuroethology20. בנייר זה, אנו מתמקדים התפקיד של המעגל pretecto-היפותלמי הנוצרת על-ידי הקרנות של גרעין ב pretectum (גרעין pretectalis השטחי pars magnocellularis, בעתיד, פשוט ציינו גם pretectum) כדי ILH. לייזר-אבלציה של pretectum הוצגה להפחית את פעילות ללכוד טרף, לבטל את הפעילות העצבית ILH המשויך תפיסה חזותית טרף21. כאן, פרוטוקולים לביצוע לייזר השפעתו באמצעות Ca2 + הדמיה והקלטה התנהגותית דג זברה הזחלים מתוארים אבלציה ובדיקות.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז</td></tr><tr><td>6 ס"מ צלחת</td><td>פטרי FALCON</td><td>מוצר#:351007</td><td></td></tr><tr><td>מחט ניתוח</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. מס' 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>קארל זייס</td><td></td><td>מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X עדשת אובייקטיבית</td></tr><tr><td>Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>תוכנת רכישת תמונה למיקרוסקופים קונפוקליים</td></tr><tr><td>אטם תא היברידיזציה Secure-Seal, 8 תאים, קוטר 9 מ"מ x 0.8 מ"מ עומק</td> קטלוג <td>בדיקות מולקולריות</td><td># S-24732</td><td>משמש כתא הקלטה בתאי הדמיה של Ca</td></tr><tr><td></td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5</td><td>משמש כסכין כירורגית תא הקלטה התנהגותי</td></tr><tr><td>סכין</td><td></td><td>עיניים MANI MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>דגם: C11440-22CU</td><td>מצלמת CMOS מדעית</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>תוכנה לעיבוד תמונה</td></tr><tr><td>מודול הקלטת דיסק קשיח</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>מודול תוכנה המאפשר שמירת קבצי הסרט על כונן דיסק קשיח תוך זמן קצר</td></tr><tr><td>סטריאוסקופ</td><td>SZX7</td><td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>DF PL 0.5X</td><td>Olympus</td><td></td><td>עדשת אובייקט עבור SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 מגה פיקסל מונו USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>מס' מוצר GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS מצלמת</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ מצלמה</td><td>XIMEA</td><td>מס' מוצר </td><td>מצלמת CMOS</td>MQ042RG-CM</tr><tr><td>טבעת אור LED</td><td>CCS</td><td>דגם: LDR2-100SW2-LA</td><td>לבן LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>רשת ניילון 32&micro; m</td><td>מסך טוקיו</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>רשת ניילון 13&מיקרו; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>מתכת seive 150 מיקרון צמצם</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>מתכת seive 75 מיקרון</td><td>Tokyo Screen</td><td></td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & בריאות ושות' בע"מ</td><td></td><td>שמרי בירה יבשה</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td><td>סביבת פיתוח משולבת לתכנות</td></tr><tr><td>Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>לייזר דו-פוטוני&nbsp;</td></tr></tbody></table>

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

כדי לזהות את התפקיד של subpopulation של נוירונים בהתנהגות, זה חיוני כדי לבדוק את ההשלכות של חסימת פעילותו בבעלי חיים. אבלציה לייזר של נוירונים היא שיטה יעילה למטרה זו כאשר נוירונים מסומנות באופן סלקטיבי עם הגששים פלורסנט. במחקר הנוכחי, מתוארים פרוטוקולי לייזר ablating של subpopulation של הנוירונים באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים ובדיקות של השלכותיה פונקציונלי והתנהגותיים. במחקר זה, התנהגות לכידת הטרף דג זברה הזחלים משמש כמודל המחקר. המעגל pretecto-היפותלמי ידוע מונחת ביסוד זה טרף מונחה באופן חזותי לתפוס התנהגות. דג זברה pretectum היו ablated לייזר, נבחנה פעילות. עצבית באונה נחות של ההיפותלמוס (ILH; היעד של התחזית pretectal). התנהגות לכידת הטרף לאחר אבלציה pretectal נבחנה גם.

נוירונים ספציפיים גנטית עם תווית עם EGFP או GCaMP6s, אשר הביטוי גורשו בקווים Gal4 GSAIzGFFM119B קו Gal4 שימשה תווית גרעין באזור pretectal (הזרם שטחית pretectal גרעין), subpopulation של הנורה הריח נוירונים. קו Gal4 אחר, hspGFFDMC76A, שימש כדי לתייג את ILH. אנחנו לייזר-ablated הנוירונים pretectal דו צדדיים (איור 2א פאנל שמאלי), גם ablated נוירונים בהנורה הריח דו צדדיים כפקד (לוח נכוןאיור 2א ) בדג ז...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לבחון את ההשפעה של אבלציה בלייזר של נוירונים מסוימים על פעילות והתנהגות מעגלים. בעזרת טכניקה ניסויית זו אנו יכולים לבחון את נחיצותם של נוירונים במעגל העומד בבסיס ההתנהגות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח שלנו בתחום ההתנהגות ומדעי המוח, כגון כיצד נתפס טרף וכיצד התנהגות שנלכדה על ידי פעילות עצבית.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לכרות נוירונים באופן ספציפי בגלל התיוג הגנטי של נוירונים אלה וגם רזולוציה מרחבית גבוהה של הלייזר. לאחר גידול הזחלים והרכבתם באגרוז נמס נמוך של 2% על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את זחלי האגרוז המוטבעים מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר של שני פוטונים והפעל את מערכת המיקרוסקופיה. פתח את תוכנת רכישת התמונות ותחת לשונית הלייזר לחץ על כפתור ההפעלה כדי להפעיל את הלייזר.המתן עד שמצב הלייזר ישתנה ממצב עסוק למצב נעול. בכרטיסיית הערוצים הגדר את אורך הגל של הלייזר ל-880 ננומטר עבור אבלציה של EGFP או 800 ננומטר עבור אבלציה של GCaMP. בחר את העדשה הסובייקטיבית פי 20 על-ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה אתר, לחץ GFP כדי לשנות את המסלולים האופטיים ולהציג ישירות את הקרינה בעין. מרכז את מוח זחל דג הזברה בשדה הראייה, ולאחר מכן לחץ על לשונית הרכישה כדי לחזור למיקרוסקופ שני פוטונים ולהגדיר את עוצמת הלייזר והרווח. כתיעוד של התנאי לפני האבלציה לחץ על מחסנית Z כדי לבחור באפשרות Z stack.לאחר מכן, לאחר התמקדות בקצה הגחון של מוח הזחל, לחצו על כפתור ההגדרה הראשונה כדי להגדיר את הגבול התחתון, ולאחר שהתמקדו במשטח הגבי ביותר של המוח, לחצו על כפתור הגדר אחרון כדי להגדיר את הגבול העליון. לבסוף, לחץ על כפתור התחל ניסוי כדי להפעיל את רכישת תמונות מחסנית Z. לאחר מכן, בחר את העדשה הסובייקטיבית 63X על ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה.לאחר מכן, לחץ על הכרטיסייה איתור כדי לעבור למיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית. מרכז את התאים שיש לכרות בעין ולאחר מכן לחץ על לשונית הרכישה כדי לחזור למיקרוסקופ סריקת לייזר. בכרטיסייה מצב רכישה הגדר את גודל המסגרת ל-256 על 256.לחץ בשידור חי והתבונן בתאי העצב המעניינים. לאחר מכן, החל מהצד הגבי ביותר, מצא מישור מוקד שבו התאים המיועדים לכריתת נמצאים בפוקוס. באמצעות פונקציית האזורים סמן אזור עגול קטן בקוטר של כ-1/3 מגודל התא על כל נוירון כהחזר ROI.הגדר את מהירות הסריקה ל-13.9 שניות לכל 256 על 256 פיקסלים, המתאימה לזמן שהייה בלייזר של כ-200 מיקרו-שניות לפיקסל או 200 מיקרו-שניות לחצי מיקרון. כמו כן, הגדר את מחזור האיטרציה לארבע חזרות. לחץ על התחל ניסוי כדי לבצע את סדרת הזמן ופונקציות ההלבנה.השווה את התמונה לפני האבלציה לתמונה לאחר אבלציה במחזור סדרת הזמן כדי להבטיח שהפלואורסצנטיות בתאי המטרה נעלמת. לאחר מכן, הזיזו את מישור המוקד מעט עמוק יותר ובחרו את מישור המוקד הבא שבו מופיעים תאים לא מבוטלים. בצע את פונקציית ההלבנה כפי שהודגם זה עתה וחזור על התהליך עד שכל התאים במבנה העצבי המעניין הוסרו.לאחר האבלציה בדוק את התאים לאיתור פלואורסצנטיות מבוטלת וחזור על הקרנת הלייזר במידת הצורך. לאחר ההקרנה יש לשחזר את הזחלים. בצע בזהירות חתכים זעירים בניצב באגרוז סביב הזחלים.לאחר מכן, המתן עד שהדג ישחה החוצה מהאגרוז בכוחות עצמו כאשר חומר ההרדמה יתפוגג. לאחר גידול פרמציה והרדמה של זחל דג זברה על פי פרוטוקול הטקסט, הנח את הזחלים בנקודת התכה נמוכה של 2% והסר מיד את כל האגרוז העודף כך שפני השטח של האגרוז ייראו מעט קמורים. בעזרת מחט חיתוך כוונו במהירות את הזחלים למצב זקוף.לאחר מכן, בעזרת סכין כירורגית בצע כמה חתכים קטנים באגרוז כדי להסיר את האגרוז סביב ראש דג הזברה שמפנה מקום לפרמציום לשחות. הסר בזהירות את שאריות האגרוז על ידי שפיכת מי המערכת בעדינות על החדר. לאחר מכן, הכניסו פרמציום אחד לתא ההקלטה כדי לשמש כגירוי חזותי.לאחר מכן הנח את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמת CMOS מדעית ובחר עדשת אובייקט 2.5X. הפעל את אפליקציית רכישת התמונות עבור המצלמה המצוידת לחץ על חלונית הרצף ובחר רשומת דיסק קשיח בחלונית.במקטע הגדרת הסריקה, הגדר את ספירת הפריימים ל-900 או כל מספר מסגרת כולל אחר הרצוי. בחלונית הלכידה הגדר את זמן החשיפה ל-30 אלפיות השנייה ואת ה-binning לשניים על שניים. לחץ בשידור חי בחלונית הצילום כדי לאתר את הזחלים במצלמה view ופוקוס ולאחר מכן לחץ על עצור בשידור חי ולחץ על כפתור ההתחלה.שמור את הסרט בפורמט cxd ונתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר הגדרת מערכת ההקלטה ההתנהגותית והכנסת הזחל לתא הקלטה בהתאם לפרוטוקול הטקסט, השתמש במיקרו-פיפטה כדי לאסוף 50 פרמציה ולהניח אותן בתא ההקלטה. כדי להניח פתק כיסוי על גבי תא ההקלטה, הניחו טיפת מים קטנה על החלקת הכיסוי לפני הנחתה על פני המים של תא ההקלטה כדי למנוע הכנסת אוויר לתא.הנח את תא ההקלטה במערכת התאורה. לאחר מכן, התחל את הקלטת קיטועי הזמן ב-10 פריימים לשנייה למשך 11 דקות. לבסוף, ניתוח ביצוע לפי פרוטוקול הטקסט.בניסוי זה עם קו Gal4 המסמן גרעינים באזור הקדם-טקטי ותת-אוכלוסייה של נוירונים של נורת הריח. הנוירונים הקדם-טקטליים עברו ניתוק לייזר דו-צדדי. נוירוני הריח הוסרו כבקרה.התוצאות מראות כי לייזר שני הפוטונים יכול להפחית תאים ממוקדים תוך השארת נויריטים סמוכים ללא פגיעה. בניסוי זה נחקרה הקישוריות התפקודית של נוירונים טרום-טקטיים המקרינים את האקסונים שלהם לעבר ה-ILH באופן מקביל. גם הפרטקטום וגם ה-ILH הראו פעילות עצבית בנוכחות הפרוקסימלית של הטרף, מה שמרמז על כך ששתי הפעילויות העצביות מונעות חזותית.הדמיית סידן שימשה גם לצפייה בפעילות עצבית בפרטקטום וב-ILH בזחלים שעברו כריתת נוירונים קדם-טקטליים. הפרטקטום השמאלי שהוסר בלייזר הראה פעילות עצבית שיורית עד ללא פעילות עצבית. בנוסף, ה-ILH המקביל הראה פעילות עצבית שנעקרה באופן דרמטי, מה שמרמז על כך שהקלט העיקרי ל-ILH מגיע מה-pretectum המקביל.לעומת זאת, ה-ILH בצד השני של הפרטקטום הלייזר הראה פעילות עצבית דומה לפעילות העצבית בפרטקטום המקביל, מה שמרמז על כך שה-ILH הימני מקבל קלט מהפרטקטום הימני. לאחר השליטה ניתן לבצע אבלציה בלייזר תוך כשעה עבור כל זחל דג זברה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפרק רק את הנוירונים הממוקדים עם קרינת לייזר מתאימה, ולהימנע מנזקי חום על ידי הלייזר.בעקבות הליך זה ניתן לבצע אבלציה של נוירונים באזורי מוח אחרים כמו המוח הקדמי או המוח האחורי על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד נוירונים אלה מעורבים בתפקודים קוגניטיביים או בתפקודים מוטוריים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח ההתנהגותיים לחקור מעגלים עצביים פונקציונליים במודלים של דגי זברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע לייזר באופן ספציפי נוירונים במוח זחלי דגי הזברה ולהעריך את ההשלכות התפקודיות וההתנהגותיות.אל תשכח שעבודה עם לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד לציית להוראות היצרן בעת ביצוע הליך זה.

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מתארים שיטה הרכבה עוברי דג הזברה הדמיה לטווח ארוך, שני הפוטונים הדמיה רקמות נזק טכניקות זמן לשגות הדמיה confocal.

שני הפוטונים axotomy ואת זמן לשגות הדמיה confocal עוברי דג הזברה לחיות

סרטון זה מתאר את מבחן לכידת הטרף. הסרטון דן בשיטה לחקר התנהגות לכידת טרף של זחלי דגי זברה לאחר אבלציה בלייזר של נוירונים ספציפיים.

בדיקת לכידת טרף: שיטה לחקר התנהגות לכידת הטרף של זחלי זברה

סרטון זה מתאר את השיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה באמצעות שתי אקסוטומיות לייזר פוטונים וצפייה בהתאוששות אקסונלית מפציעה.

אקסוטומיה של לייזר דו-פוטון: שיטה לפצוע אקסונים בעוברים של דגי זברה ולצפות בהתאוששות אקסונלית

סרטון זה מדגים את השיטה לחקר זיהוי טרף חזותי בזחלי זברה טרנסגניים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית מבוססת מחוון סידן כאשר תאי העצב שלהם מבטאים קומפלקסים של אינדיקטור סידן פלואורסצנטי.

ניתוח הפעילות העצבית המעוררת טרף בזחל דג זברה מהונדס

מקור: Morsch, M.,  et. al., הפעלת מתח ומוות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של לייזר UV קונבנציונלית. J. Vis. Exp. (2017) בסרטון זה, אנו בוחנים את הטכניקה של אבלציה בלייזר UV בעוצמה גבוהה למיקוד מדויק ולימוד של נוירונים בודדים בדג זברה טרנסגני. אנו מדגימים כיצד להכין, לשתק ולדמיין תגובות עצביות, תוך הדגשת הדינמיקה התאית של פציעה והתאוששות.

אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

מקור: Muto, A., . אבלציה של אוכלוסייה עצבית באמצעות לייזר דו-פוטוני והערכתה באמצעות הדמיית סידן ורישום התנהגותי בזחלי דג זברה. J. Vis. exp. (2018)} } בסרטון זה,  מודגם הליך אבלציה בלייזר דו-פוטוני, המאפשר הרס סלקטיבי של נוירונים פלואורסצנטיים בזחלי דג זברה משותקים באגרוז. הדמיה ברזולוציה גבוהה לפני ואחרי ההליך מאשרת נזק עצבי יעיל, כפי שנצפה בהיעדר פלואורסצנטיות.

אבלציה עצבית ממוקדת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזחל דג זברה

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

פרוטוקול זה מתאר גישת אבלציה בלייזר של שני פוטונים המתבצעת בזחלי דגי זברה, המשמשת מודל לחקר התחדשות העצם והשפעות התגובה החיסונית לאבלציה.

אבלציה בתיווך לייזר דו-פוטוני של אוסטאובלסטים בהתפתחות זחלי דגי זברה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבחינת פעילות עצבית באזורי מוח של דגי זברה טרנסגניים המבטאים מדדי סידן GCaMP באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

ב Vivo הדמיה פלואורסצנטית קונפוקלית של פעילות עצבית הנגרמת על ידי גירוי חושי בדג זברה זחל מרוסן חלקית

למדו שיטת אבלציה עצבית מדויקת באמצעות לייזר שני-פוטונים בזחלים של דג זברה. טכניקה זו מאפשרת חקירת תפקידי נוירונים במעגלים עצביים ובהתנהגות ציד טרף.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

גלה סרטונים נוספים