Name: הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: חקור את הפעילות הנוגדת סרטן של קומרינים באמצעות מערכות תרבית תלת-ממדיות ודגי זברה. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות תרופות בסביבה פיזיולוגית רלוונטית ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי מולקולות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר-סנו נתמך על ידי נבחרת מחקר קרן (ב- NRF) על ידי MEST של קוריאה למענק הגידול Microenvironment גלובל הליבה מחקר במרכז (GCRC), [גרנט מספר 2011-0030001]; המענק מחקר סיאול האוניברסיטה הלאומית ועל ידי המוח קוריאה (BK21), בנוסף לתוכנית.

1. המושבה היווצרות מבחני
<ol><li>התרבות התאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב-15 מיליליטר RPMI1640 תא בינוני תרבות בתוספת 10% FBS (סרום שור עוברית) ואנטיביוטיקה % 1 בבקבוקון2 75 ס מ ב חממה2 CO-CO 37 ° C ו-5%2.</li>
	<li>ביום של הניסוי, לקבוע את הריכוז תא על-ידי שימוש של hemocytometer. לאסוף 50,000 תאים על ידי צנטריפוגה ב x 400 גרם במשך 7 דקות צינור microcentrifuge 1.5 mL והשהה מחדש תאים µL 100 ל- 1 x סטרילי PBS (פוספט Buffered מלוחים) 1.5 mL צינורות.</li>
	<li>לוותר על 1.1 מיליליטר מוצק למחצה מבוססי methylcellulose בינוני (MCBM) 15 מ"ל צינורות עם multipipette. מכינים שפופרת אחת עבור כל תנאי.</li>
	<li>להוסיף µL 110 של FBS 1.1 מ של MCBM באמצעות micropipette P200.</li>
	<li>זרעים תאים-תאים למ"ל 1,000. לאסוף µL 2.4 תא השעיה מן הפתרון מניות (50,000 תאים ב- 100 µL ל- 1 x PBS) באמצעות micropipette P2 ולהוסיף 1.1 מ של MCBM בתוספת 10% FBS.</li>
	<li>לאחר הוספת התאים, מערבולת הצינורות עבור 1 דקות, החזקתם אנכית במהירות הגבוהה ביותר לערבב היטב MCBM ותאים.</li>
	<li>הוסף מבחן תרכובות (OT48 לבד או בשילוב עם A1210477). הכן צינור בנפרד כפקד לחומר המשמש (כאן דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)). בהתאם הריכוז של תרכובות ונפח נוסף עבור כל תנאי, הפקד הממס יכלול את הריכוז הגבוה ביותר של הממס המשמש את דילולים של הבדיקה במתחם, כדי להעריך על תופעות לוואי שנגרמו על ידי הממס.</li>
	<li>וורטקס צינורות במשך דקה אחת.</li>
	<li>עבור כל assay, להוסיף 1 מ"ל של התערובת עם micropipette P1000 מרכז טוב צלחת תרבות תא 12-. טוב.</li>
	<li>למלא בארות ריק עם 1 מ ל מים סטרילי או PBS x 1 לייצב את הלחות.</li>
	<li>תקופת דגירה תרבות צלחות של 10 ימים באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.</li>
	<li>לאחר 10 ימי דגירה, להוסיף 200 µL של MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד) מניות פתרון (5 מ"ג/מ"ל) כל טוב להגיע ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>דגירה 10 דקות בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2. מושבות בת קיימא יהפוך ויולט.</li>
	<li>ללכוד את התמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית באמצעות לוח רקע לבן (LAS דיה לבנה מגש). השתמש בהגדרות הבאות: השיטה, דיגיטייז; סוג החשיפה, דיוק; זמן החשיפה, ידני, לשנייה אחת; רגישות/רזולוציה, ברזולוציה גבוהה. לשמור את התמונה בתבנית tiff.</li>
	<li>לכמת מושבות בת קיימא באמצעות תוכנת ImageJ. בחר בתפריט "תמונות | סוג | 8 סיביות". בתפריט בחר ' התאם | הסף". הגדר את הסף ולשמור קבועה עבור כל התנאים; בתפריט בחר "נתח | ניתוח חלקיקים". שמירת הנתונים ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.</li>
</ol>2. ספרואיד היווצרות Assay
<ol><li>התרבות תאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב- 75 ס מ2 מבחנות עם 15 mL RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.</li>
	<li>ביום של הניסוי, להכין 96 ובכן צלחת U-התחתון.</li>
	<li>צלחת 10,000 תאים לבאר וכבר מכילה את המתחם עניין (כאן 50 מיקרומטר של OT48) ו/או 20 מיקרומטר של A1210477. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 100 µL תא תרבות בינוני. מספר התאים היוצרים spheroids אחיד עם הגבול החיצוני ללא פגע נחשב מספיק כדי spheroids טופס.</li>
	<li>תקופת דגירה של 3 ימים באינקובטור 37 ° C וכן ב 5% CO2.</li>
	<li>לאחר 3 ימי דגירה, לכידת תמונות של spheroids באמצעות מיקרוסקופ אור עם 4 x הגדלה.</li>
</ol>3. דג זברה Xenograft Assay
הערה: גישה טכנית זו הוא מדמיין כמו שרטוט (איור 1).
<ol><li>
הכנה של ריאגנטים מניות
	<ol>
<li>להכנת 1 ליטר של 30 x הפתרון של Danieau: 1740 מ"מ NaCl, 21 מ מ אשלגן כלורי, 12 מ מ MgSO4∙7H2O, 18 מ מ Ca (3)2ו- 150 מ מ HEPES. התאם את רמת ה-pH של המאגר כדי 7.6 באמצעות מד pH.</li>
		<li>להכין 1% (50 x) tricaine פתרון: לפזר 20 מ ג של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) ב- 2 מ ל מים מזוקקים.</li>
		<li>להכין 1% פנול אדום-PBS פתרון: להוסיף 2 µL פנול אדום מלח נתרן לפתרון µL 198 בפתרון PBS סטיריליים צינור 1.5 µL.</li>
		<li>להכין 3% methylcellulose: להוסיף דור 3 של methylcellulose 100 מ של 1 x הפתרון של Danieau.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ייצור הביצים דג זברה, דגירה
	<ol>
<li>הפרד בין נקבה אחת ואחד דג זברה זכר במיכל מחיצה מלאה עם מים מהברז עיקור UV ומסוננות ב 28.5 ° C בחושך. לאחר 24 שעות של הפרדה, מערבבים דג של שני המינים כדי להזדווג. העברה הביצים ממיכל ההזדווגות צלחת פטרי המכיל 5 מ של הפתרון של Danieau טריים.</li>
		<li>לשטוף ביצים שלוש פעמים עם 5 מ של הפתרון של Danieau. לשטיפת מכוניות, תשאף היטב את הביצים עם פיפטה, העברה עד 5 מ"ל של פתרון טריים. תקופת דגירה של 8 שעות ב- 28.5 ° C.<ol>
<li>אחרי 8 שעות של דגירה בפתרון של Danieau, שנה, לאודנום של Danieau 0.03% 1-phenyl-2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי לעכב פיגמנטציה. למיין את הביצים אטום (מופרית או המכיל לא מפותחים עוברי) כדי למנוע זיהום.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
העובר dechorionation
	<ol>
<li>h 24 שעות ביממה פוסט הפריה (hpf), העוברים דג זברה dechorionate באמצעות מלקחיים חדה. דגירה הבקיעה עוברי בפתרון של Danieau עם 0.03% פרופילתיואוראציל ב 28.5 ° C עד 48 hpf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת תרכובת שטופלו תא
	<ol>
<li>זרעי A549 תאים-תאים/ס מ 20,0002 ב 25 ס מ2 תרבות מבחנות. לאחר 24 שעות של זריעה, להוסיף תרכובות (OT48 כאן ב 50 מיקרומטר, ו/או A1210477 ב- 20 מיקרומטר) במשך 24 שעות ביממה באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. להגדיר את זמן הטיפול בכל המתחם כדי לשמור על הכדאיות של התאים, אבל לבצע אותם לקראת מוות של תאים. הפעם צריך נקודת בנפרד להגדיר מבוסס על הכדאיות תא, המורפולוגיה. סמנים מולקולריים.</li>
		<li>שעתיים לפני סוף הטיפול, הכתם תאים עם 4 מיקרומטר של התא פלורסנט המעקב לצבוע ס מדיל-CO 37 ° C ו-5%2. לאחר שעתיים של דגירה, trypsinize תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, לדלל 106 תאים ב- 50 µL של פנול אדום-PBS פתרון לפני ההזרקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מיקרו-הזרקה של תאי הסרטן על היווצרות xenograft
	<ol>
<li>עזים ומתנגד דג זברה בפתרון tricaine 0.02% במשך 5 דקות עד שיספיקו להתמקם על צלחת אגר.</li>
		<li>משוך 1.0 מ מ (מחוץ קוטר (OD) זכוכית נימי) מאת פולר micropipette (תוכנית הגדרות: 300 p:, חום: 260, משוך: ול 60,: 50, זמן: 200). חותכים את microcapillary עם מזרק כדי ליצור קצה חד. לטעון microcapillaries עם 20 µL של התא/פנול אדום-PBS פתרון. הגדר הזרקה בלחץ והזמן כדי לוותר על 2 nL לכל זריקה.</li>
		<li>להזריק 100-200 תאים לתוך שק החלמון על ידי שהזרקת 6 עד 10 nL באמצעות זריקות 3 עד 5. לאחר ההזרקה, לאפשר דגים לשחזר למשך 10-30 דקות ב 5 מ של הפתרון של Danieau טריים המכילים פרופילתיואוראציל פתרון. מוקד בדגים. ובכן 24 צלחות עם 1 מ"ל של הפתרון של Danieau המכילה פתרון פרופילתיואוראציל, תקופת דגירה של 72 h ב- 28.5 ° C.</li>
		<li>לאחר 72 h של דגירה, עזים ומתנגד דגים בפתרון tricaine 0.02%, לשתק על משטח זכוכית עם ירידה של 3% methylcellulose. לצלם תמונות x 5 על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באורך-גל של 620-750 ננומטר.</li>
		<li>לכמת את הגודל של גידולים פלורסנט באמצעות תוכנת ImageJ. בתפריט בחר "נתח | מדד". שמירת ערכים המתאימים לאות פלורסנט ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Giancotti, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulation+of+cell+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Deregulation of cell signaling in cancer.</a> FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).</li>
<li>Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioprinting for cancer research.</a> Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).</li>
<li>Santo, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+3D+in+vitro+tumor+models%3A+overcoming+current+pitfalls+of+efficacy+read-outs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs.</a> Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).</li>
<li>Tanner, K., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+3D+culture+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Beyond 3D culture models of cancer.</a> Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289(2015).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Talhi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%284-hydroxy-2H-chromen-2-one%29%3A+synthesis+and+effects+on+leukemic+cell+lines+proliferation+and+NF-kappaB+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406473">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytostatic+hydroxycoumarin+OT52+induces+ER%2FGolgi+stress+and+STAT3+inhibition+triggering+non-canonical+cell+death+and+synergy+with+BH3+mimetics+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer.</a> Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+to+the+soft-agar+assay+that+permits+high-throughput+drug+and+genetic+screens+for+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).</li>
<li>Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Cycle+Imaging+in+a+3D+Cell+Culture+Model+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma.</a> Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).</li>
<li>Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging-+and+Flow+Cytometry-based+Analysis+of+Cell+Position+and+the+Cell+Cycle+in+3D+Melanoma+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Ji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dialkyl+resorcinol+stemphol+disrupts+calcium+homeostasis+to+trigger+programmed+immunogenic+necrosis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer.</a> Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שיעור של היווצרות המושבה שהושג עם MCBM תלויה בסוג התא. בדרך כלל, עבור תאים שאינם מחסידי, מספר מושבות הוא הרבה יותר גבוה לעומת תאים חסיד. הבחנו כי תאים A549 הקימו מושבות 30 עד 40 לאחר 10 ימים. בעבר דיווחנו על תאי סרטן שונים כי מספר מושבות הוא בין 200 ל-2509. התוצאות שלנו הראה כי OT48 לבד לא לייצר ירידה משמעותית של מספר מושבות לבד. עם זאת, בשילוב עם BH3 ויוצרים-יכולת מימטי של A1210477 המושבה, תאים A549 בסינרגיה צומצם. בעבר דיווחנו נגזרת hydroxycoumarin עוד את OT52 גם סיווג עם BH3 מימטיקה כדי לעכב את...

סרטן נגרמת על ידי מוטציות תאיות, כתוצאה מכך הביוכימי איתות המסלולים הם שיבשו מפעילה חלוקת תאים בלתי מבוקרת והתנגדות מוות של תאים. גידולים להפריע פונקציות פיזיולוגיים של העיכול, לחוצה, הדם מערכות, רקמות שכנות לאחר מכן1. למרות מאמצי מחקר מקיף, הסרטן נשאר המחלה שכיחה ביותר מסכני העולם2. רפואה דיוק הוכר יסוד ותרופות לסרטן בעתיד. גופים מולקולריים חדשים נבחנים באופן שגרתי בשילוב עם תרופות קיימות כדי לשפר את התוצאה הקלינית.
אולם, אחת המגבלות משמעותיים הקשורים לפיתוח טיפולים ממוקדים יעיל החדש הוא הכישלון של מבחני נפוץ לדמות התוצאה ביולוגי מדויק של חשיפה לסמים3. גילוי תרופות הסרטן עדיין בעיקר מסתמך על בדיקת יעילותם של סוכני טיפולית בתוך שורות תאים סרטן בתרבית בתרבויות טפט 2D, אשר קשה לאמת בניסויים קליניים4. לכן, אין עניין הולך וגובר לפתח מודלים סרטן יותר עדיף לחקות את התכונות מקורית של גידולים ויוו5. בשנים האחרונות, הביא עניין הולך וגדל בתרבות תלת-ממד מודלים לפיתוח מתודולוגיות שיפור לייצר מודלים 3D הגידול5.
כאן, אנו מציגים גישה עם שלוש טכניקות תרבות שונים תא 3D המאפשר לשפר את ההבנה של עוצמת hydroxycoumarin OT486 בשילוב עם BH3 מימטיקה לפני יותר בעומק ויוו מבחני. השיטה שלנו מורכב המשלב המושבה לבין SFAs עם ויוו הגידול היווצרות מבחן המבוסס על מודל של דג זברה נוסף לאמת את היעילות של השילוב של OT48 ו BH3 מימטיקה בתאי סרטן ריאות, לעקוב אחר התקדמות סרטן ב חי . אורגניזם.
מבחני היווצרות המושבה משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של תרופות נגד סרטן סוכנים עבור סרטן הן מוצק כמו גם hematopoietic. וזמינותו קובעת את היכולת של תא כדי להתרבות ללא הגבלת זמן ויוצרים מושבות7. ההשפעה של סוכן נגד סרטן על המושבה ויוצרים את היכולת של תאי נקבעת על ידי ירידה של מספר ו/או גודל של המושבות.
Spheroids מייצגים במבחנה הגידול מודלים ומגישים כפלטפורמה ההקרנה בעלות נמוכה עבור סוכני נגד סרטן. Spheroids אגרגטים של תאי גידול ההשעיה או מוטבע בתוך מטריצה תלת-ממד. גישה זו הוא בשימוש נרחב והתרופות הקרנה ומחקרים של הגידול, התפשטות וצמיחה של החיסון אינטראקציה עם8.
כדי להבין באופן מלא את המאפיינים של תרופה חדשה, זה חיוני כדי ניסויים ויוו מכרסמים. עם זאת, שיטה זו המקובלת היא זמן רב ויקר. בשנים האחרונות, דג זברה (רזבורה rerio) הפך אורגניזם מעבדה נרחב למד כי הוא זול יותר ומהיר יותר לגדל. גידולים שפותחה בגישה דג זברה מייצגים תלת-ממד תא תרבות אך בתוך הגדרת ויוו של חוליות9.
בסך הכל, נשתמש כאן שלוש גישות התרבות 3D שונים לרבות פרנקים, SFAs דג זברה ויוו היווצרות הגידול כדי להדגים את הקיבולת נגד סרטן של hydroxycoumarin OT48 במודל התא סרטן A549 ריאות בשילוב עם BH3 מימטיקה.

<table><tbody><tr><td><חומרים חזקים>הנדרשים לבדיקות היווצרות מושבה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>לונזה</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS תמיסת</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינור</td> אקסטרגן-170-C <td></td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>צינור 15 מ"ל</td><td>יונדאי מיקרו</td><td>H20015</td><td>RT</td></tr><tr><td>12 צלחת באר</td><td>SPL</td><td>30012</td><td>RT</td></tr><tr><td>טכנולוגיות MethoCult</td><td>StemCell</td><td>4230-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>תיאזוליל כחול טטרזוליום ברומיד (אבקת MTT)</td><td>Sigma</td><td>M5622</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>LAS4000</td><td>GE Healthcare Technologies</td><td></td><td>RT</td></tr><<tr><td>strong>חומרים הנדרשים לבדיקת היווצרות ספרואידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>לונזה</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>PBS פתרון</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>קורנינג כוכב אטצ'מנט נמוך במיוחד 96 צלחת באר</td><td>קורנינג</td><td>3474</td><td>RT</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה</td><td>ניקון</td><td>Eclipse TS100</td><td>RT</td><</tr><tr><td>חזק>חומרים הנדרשים עבור דג הזברה xenografts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>37 C&deg;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>30096</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520-500-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>לונזה</td><td>17-602E-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T25</td><td>SPL</td><td>70025</td><td>RT</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T75</td><td>SPL</td><td>70075</td><td>RT</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים T175</td><td>SPL</td><td>71175</td><td></td></tr><tr><td>RT צינור 1.5 מ"ל</td> צינור <td>אקסטרגן-170-C</td><td></td><td>RT</td></tr><tr><td>24 צלחת באר</td><td>SPL</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>RT Petridish</td><td>SPL</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>RT PBS פתרון</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.02</td><td>RT</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25-300-054</td><td>4 C&deg;</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>71382</td><td>RT</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCL)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P9541</td><td>RT</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטאהידראט (MgSO4.7H2O)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2773</td><td>RT</td></tr><tr><td>סידן חנקתי טטרהידרט (Ca(NO3)2)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1396</td><td>RT</td></tr><tr><td>תמיסת HEPES</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H0887</td><td>RT</td></tr><tr><td>אתיל 3-אמינובנזואט מתאן סולפונאט (טריקאין)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521</td><td>RT</td></tr><tr><td>פנול תמיסה אדומה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0290</td><td>RT</td></tr><tr><td>מתיל צלולוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0512</td><td>RT</td></tr><tr><td>1-פניל-2-תיאוריאה (PTU)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>RT CM-Dil צבע</td><td>Invitrogen</td><td>C7001-20</td> <td>C&deg;</td></tr><tr><td>נימי זכוכית</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW 100F-4</td><td>RT</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>מכשיר תריס, ארה"ב</td><td>P-97</td><td>RT</td></tr><tr><td>מיקרו מזרק</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>RT</td></tr><tr><td>מזרק</td><td>KOVAX</td><td>1 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>RT מיקרו מעמיס</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>RT</td></tr><tr><td>זכוכית שקופית</td><td>מרינפלד</td><td>HSU-1000612</td><td>RT</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית</td><td>Leica</td><td>DE/DM 5000B</td><td>RT</td></tr></tbody></table>

הערכת פרה bioactivity של ot48 נגד סרטן קומרין spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה xenografts

Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts

הקרנת קליניים בתוך חוץ גופית ו ויוו של סוכני טיפולית הרומן הן כלי חיוני בגילוי סרטן סמים. למרות שורות תאים סרטניים אנושיים מגיבים תרכובות טיפולית תרביות תאים חד שכבתי (מימד) 2D, 3D תרבות מערכות פותחו כדי להבין את היעילות של תרופות יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במודלים. בשנים האחרונות, שינוי פרדיגמה נצפתה במחקרים קליניים כדי לאמת את העוצמה של מולקולות חדשות במערכות תרבות תלת-ממד, ליתר דיוק מחקה את microenvironment הגידול. מערכות אלה מאפיינים את המחלה באופן רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ולעזור כדי לקבל יותר מכניסטית תובנה והבנה של הכדורים מינון תרופתי של מולקולה נתונה. יתר על כן, עם המגמה הנוכחית בשיפור ויוו סרטן מודלים, דג זברה התפתחה כמודל חוליות חשוב להעריך ויוו היווצרות הגידול וללמוד את ההשפעה של סוכני טיפולית. . חקרנו את היעילות הטיפולית של hydroxycoumarin OT48 לבד או בשילוב עם BH3 מימטיקה ב סרטן ריאות תאים בטור A549 באמצעות שלוש מערכות התרבות 3D שונים כולל מבחני היווצרות המושבה (CFA), ספרואיד היווצרות assay (SFA) ו אין ויוו xenografts דג זברה.

איור 2, סרטן ריאות תא קו A549 היה נזרע ב MCBM למושבות הטופס לאחר הטיפול עם OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3 בריכוזים המצוין. התוצאות הראו כי השילוב הקטינה באופן משמעותי מספר וגודל השטח הכולל של המושבות לאחר 10 ימים של דגירה.
איור 3, התאים A549 שטופלו OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3, הורשו טופס spheroids על ידי הטכניקה צלחת U-התחתון. לאחר 3 ימי דגירה, צו...

כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

In vitro and in vivo pre-clinical screening of novel therapeutic agents are an essential tool in cancer drug discovery. Although human cancer cell lines ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גילוי תרופות כדי לזהות השפעה אנטי-סרטנית ולקבל תובנה מכניסטית טובה יותר לגבי מולקולות חדשות המשתמשות במערכות תרבית תלת מימדיות in vitro ו-in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זני ההשפעה הפרמקולוגית של תרכובות במודל in vivo רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית. כדי להתחיל, צלחת 20,000 תאי A549 לסנטימטר רבוע ב-15 מיליליטר של מדיום תרבית תאים RPMI 1640, בתוספת 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה, בבקבוק של 75 סנטימטר רבוע.דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. ביום הניסוי, השתמש בהמוציטומטר כדי לקבוע את ריכוז התא. אסוף 50,000 תאים בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-400 גרם למשך שבע דקות והשהה מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי 1x.בעזרת מולטי פיפט, הוצא 1.1 מיליליטר של מדיום מבוסס מתיל צלולוז חצי מוצק, או MCBM, לתוך צינורות, והכין צינור אחד לכל מצב. לאחר מכן, הוסף 110 מיקרוליטר FBS לכל צינור. לאחר מכן, חסוך 1000 תאים למיליליטר.לאחר מכן, הכניסו 2.4 מיקרוליטר מתמיסת תא המלאי לתוך הצינורות של MCBM ו-FBS. לאחר הוספת התאים, החזיקו את הצינורות אנכית ומערבלו אותם במהירות הגבוהה ביותר למשך דקה אחת כדי לערבב היטב את ה-MCBM והתאים. כעת, הוסף לדגימות את תרכובת הבדיקה OT48 לבד או בשילוב עם A1210477.הכן צינור נפרד כבקרה לממס המשמש, כגון DMSO. לאחר מכן, מערבל את הדגימות למשך דקה אחת. עבור כל בדיקה, צנרת מיליליטר אחד מהתערובת לבאר המרכזית של צלחת תרבית תאים של 12 בארות.לאחר מכן, השתמש במיליליטר אחד של מים סטריליים או PBS כדי למלא את הבארות הריקות. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 10 ימים. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת מלאי MTT של חמישה מיליגרם למיליליטר לכל באר.לאחר דגירה של הצלחות במשך עשר דקות, בדוק אם יש מושבות ברות קיימא שיהפכו לסגולות. בעזרת לוח רקע לבן, צלמו תמונות בעזרת הקביעות הבאות:לשיטה, בחרו 'דיגיטציה'. עבור סוג חשיפה, בחר דיוק.לזמן חשיפה, בחר ידני ושנייה אחת. עבור רגישות ורזולוציה, בחר רזולוציה גבוהה. לאחר מכן, שמור את התמונות שצולמו בפורמט TIFF.עם תוכנת ImageJ, כמת מושבות ברות קיימא על ידי בחירת תמונת תפריט, סוג, 8 סיביות. בחר התאמת תפריט וסף. הגדר את הסף לשליטה ושמור אותו קבוע עבור כל התנאים.לאחר מכן, בחר ניתוח תפריט, נתח חלקיקים. שמור את הנתונים ונתח אותם באמצעות תוכנת סטטיסטיקה לייצוג גרפי. לאחר הכנת ריאגנטים מלאי על פי פרוטוקול הטקסט, הפרד נקבה אחת וזכר אחד של דג זברה במיכל מחיצה מלא במי ברז מעוקרים ומסוננים UV בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס והניחו אותם בחושך.לאחר 24 שעות של הפרדה, הסר את המחיצה כדי להתחיל את ההזדווגות. העבירו ביצים מופרות ממיכל ההזדווגות לצלחת פטרי המכילה חמישה מיליליטר תמיסת דניוס טרייה. השתמש בחמישה מיליליטר של תמיסת דניוס כדי לשטוף את הביצים שלוש פעמים על ידי שימוש בפיפט כדי לשאוב בזהירות את הביצים ולהעביר אותן לחמישה מיליליטר של תמיסה טרייה.לאחר מכן, דגרו על הביצים בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס למשך שמונה שעות. החלף לתמיסת Danios המכילה 0.03% PTU כדי לעכב פיגמנטציה ולמיין ביציות לא מופרות אטומות כדי למנוע זיהום. 24 שעות לאחר ההפריה, השתמש במלקחיים חדים כדי לפרק את העוברים.לאחר מכן, דגרו את העוברים בתמיסת Danios עם PTU עד 48 שעות לאחר ההפריה. לאחר זריעת תאי A549 ודגירתם בתרכובות על פי פרוטוקול הטקסט, 24 שעות לפני סיום הטיפול, הוסף ארבעה מיקרומולר של צבע מעקב התאים הפלואורסצנטיים, CM-Dil, כדי לצבוע את התאים ולדגור אותם למשך שעתיים. לאחר הדגירה, השתמש ב-0.05%Trypsin-EDTA כדי לנסח את התאים.לאחר מכן, יש לדלל עשרה עד שישי תאים ב-50 מיקרוליטר של תמיסת PBS אדומה פנול לפני ההזרקה. כדי לבצע מיקרו-הזרקה של תאים סרטניים, משוך נימי זכוכית בגודל 1.0 מילימטר באמצעות הגדרות התוכנית הבאות:השתמש במזרק כדי לחתוך את הנימים כדי לייצר קצה חד. לאחר מכן, טען את המיקרו-נימי ב-20 מיקרוליטר של תמיסת הפנול האדומה של התא.לאחר הרדמת דג הזברה על פי פרוטוקול הטקסט, הזרקו 100 עד 200 תאים לשק החלמון על ידי הזרקת שישה עד עשרה ננוליטרים באמצעות שלוש עד חמש זריקות. יש לבצע מיקרו-הזרקות בזהירות ובדייקנות רבה כדי להבטיח שהנפח הנכון של התאים מוזרק והפגיעה בהזרקה היא מינימלית ולחץ הפחמן הדו חמצני צריך להיות אופטימלי כדי למנוע סדק לרוחב. לאחר ההזרקה, אפשר לדג להתאושש במשך עשר עד 30 דקות בחמישה מיליליטר של תמיסת דניוס טרייה המכילה PTU.מעבירים את הדגים לצלחות של 24 בארות עם מיליליטר אחד של תמיסת Danios PTU, ודוגרים אותם בחום של 28.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. לאחר הדגירה, לאחר הרדמת הדגים על פי פרוטוקול הטקסט, יש לשתק אותם על מגלשת זכוכית עם טיפה של 3% מתיל צלולוז. צלם תמונות פלואורסצנטיות פי 5 באורך גל של 620 עד 750 ננומטר.השתמש בתוכנת ImageJ כדי לכמת את גודלם של גידולים פלואורסצנטיים על ידי בחירת ניתוח ומדידה. לאחר מכן, שמור את ערכי הקרינה ונתח אותם באמצעות תוכנת סטטיסטיקה לייצוג גרפי. בניסוי זה, קו תאי סרטן הריאה A549 נזרע ב-MCBM ליצירת מושבות לאחר טיפול ב-OT48 לבד או בשילוב עם חיקוי BH3, A1210477, בריכוז שנראה כאן.התוצאות הראו כי השילוב הפחית משמעותית את המספר, הגודל ושטח הפנים הכולל של המושבות לאחר עשרה ימי דגירה. כאן, לאחר טיפול ב-OT48 לבד או בשילוב עם חיקוי BH3, A1210477, התאים הורשו ליצור ספרואידים בטכניקת צלחת U-bottom. לאחר שלושה ימי דגירה, הספרואידים צולמו וכומתו, ונוצרו תמונות תלת מימד.נתון זה ממחיש את הפוטנציאל המעכב של OT48 ו/או A1210477 על היווצרות גידול מכימות גידולים פלואורסצנטיים שנוצרו כאשר תאים מטופלים הוזרקו לשק החלמון של דג הזברה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על מספר הדגים עבור כל מצב סביב עשרה או יותר כדי למנוע את השינויים החשובים המשפיעים על ההערכה הסטטיסטית של הנתונים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח היסטולוגי על מנת להעריך את ביטוי חלבון היעד בקסנוגרפט של דג הזברה.טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום גילוי תרופות לחקור את היעילות של תרכובות במיקרו-סביבה in vivo בקסנוגרפט של דג הזברה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאמת את יעילות התרופה בסביבת תרבית תלת מימדית.

preclinical-assessment-bioactivity-anticancer-coumarin-ot48-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר את הטכניקה ליצירת מודל xenograft הנגזר מדג זברה. בפרוטוקול הדגימה, אנו מעריכים את יעילות התרופות Gemcitabine ו- Navitoclax במודל xenograft גידול הלבלב.

דג זברה שמקורו בחולה קסנוגרפט (zPDX): מודל סרטן

סרטון זה מתאר את בדיקת היווצרות המושבה, המסייעת לקבוע את יכולתם של תאי סרטן הריאה להתרבות ללא הגבלת זמן וליצור מושבות בודדות. אנו יכולים לנתח את ההשפעה של סוכן אנטי-סרטני על התאים יוצרי המושבה על ידי ניתוח השינויים במספר ו / או בגודל של המושבות המתקבלות.

בדיקת היווצרות מושבה: הערכת היעילות של חומרים אנטי-סרטניים על תאי סרטן ריאה יוצרי מושבה

סרטון זה מתאר את בדיקת xenograft של דג הזברה כדי להעריך היווצרות גידול in vivo וללמוד את ההשפעה של חומרים טיפוליים.

Zebrafish Xenograft Assay: שיטה להערכת היעילות האנטי-סרטנית של טיפולים על גידולים בדגי זברה in vivo

סרטון זה מתאר שיטה לסינון גנים משני מלנומה באמצעות מודל גידול של דג זברה מהונדס. כאשר מוזרק להם וקטור miniCoopR הגורם למלנומה, דג הזברה מפתח מלנומה ולכן ניתן להשתמש בו כדי לחקור את הגורמים הגנטיים המשפיעים על התפתחות הגידול בדגי זברה.

transgenesis מבוסס וקטור miniCoopR: טכניקה לסינון גנים הגורמים למלנומה במודל הגידול של דגי זברה

דרך מהירה למסך למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה מוצגת. הוא מנצל את וקטור miniCoopR המאפשר ביטוי של גנים מלנומה מועמד במלנוציטים. שיטה להשיג עקומות מלנומה ללא הישרדות, assay פלישה, פרוטוקול למכתים נוגדן של מלנוציטים קנה המידה וassay השתלה מלנומה מתוארת.

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

בשיטה זו משתמשת עוברי דג זברה כדי לבדוק ביעילות את יכולת פולשני כלי הדם של תאים סרטניים. תאים סרטניים פלורסנט מוזרקים לתוך שק סינוס או חלמון precardiac של עוברים בפיתוח. פלישת תאים סרטניים כלי דם extravasation נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אזור הזנב 24 כדי 96 שעות מאוחר יותר.

בדיקת היכולת פולשנית דם של תאים סרטניים דג הזברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;)

Zebrafish מודלים מבע לאפשר סינון תפוקה גבוהה ההקרנה והדמיה פלורסנט של תאים סרטניים אנושיים ב vivo microenvironment. פיתחנו זרימת עבודה עבור קנה מידה גדול, הקרנת תרופות אוטומטיות על החולה הנגזרת דגימות לוקמיה ב דג זברה באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי מצויד במיקרוסקופ הדמיה יחידה.

הקרנת התרופה של החולה העיקרי הנגזר גידול Xenografts ב Zebrafish

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד, עם טיפים ליצירת קסנוגרפטים והנחיות לניתוח התנהגות הגידול, חיסוניות של כל ההר, וכימות הדמיה confocal.

דור של זברה דג זחל קסנוגרפטים וניתוח התנהגות הגידול

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר יצירת מודלים תלת-ממדיים של תרביות גידול מתאי סרטן ראשוניים והערכת רגישותם לתרופות באמצעות בדיקות כדאיות תאים ובדיקות מיקרוסקופיות.

קביעת ספרואידים תלת מימדיים מדגימות גידול שמקורן בחולה והערכת רגישותם לתרופות

פרוטוקול זה מתאר הליך סינון תרופות בזחלי זברה 3-7 ימים לאחר ההפריה ואחריו הערכה מורפולוגית.

בדיקת מולקולות קטנות ובדיקת רעילות בזחלי דגי זברה בשלב מוקדם

חקור את הפעילות הנוגדת סרטן של קומרינים באמצעות מערכות תרבית תלת-ממדיות ודגי זברה. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות תרופות בסביבה פיזיולוגית רלוונטית ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי מולקולות חדשות.

הערכת פרה Bioactivity של OT48 נגד סרטן קומרין Spheroids, מבחני היווצרות המושבה ועל דג זברה Xenografts

גלה סרטונים נוספים