דור של תאי אפיתל באף אדם Spheroids למחקר הרגולטור מוליכות Transmembrane תגובותיהם סיסטיק פיברוזיס

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר ספרואידים של תאי אף אנושיים שיכולים לשמש בסופו של דבר כמבחן למחקרי CFTR פונקציונליים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סיסטיק פיברוזיס כגון הערכת תגובת הנבדק לתרופות משנות CFTR במערכת מודל ex vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמספר רב של ספרואידים נוצרים במסגרת זמן מהירה יחסית מדגימת תאי אף קטנה המאפשרת בדיקה נרחבת.

ידגימו את ההליך לורן סטרקר וג'סיקה מונצ'יוויז, טכנאות מהמעבדה שלי. לאחר עיבוד והרחבת תאי אפיתל אף אנושיים או תאי HNE על פיברובלסטים מזינים על פי פרוטוקול הטקסט, הביאו מדיום הרחבה שהוכן בעבר, מדיום התמיינות, תמיסת EDTA 0.1% טריפסין ו-PBS סטרילי לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן השתמש באתנול 70% כדי לנקות את המיכלים ולהעביר אותם לארון בטיחות ביולוגית נקי.

בארון הבטיחות הביולוגית, השתמש בפיפטה של פסטר המחוברת לקו ואקום כדי לשאוב ולהשליך את המדיום מתרבית HNE. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית נקייה, השתמש בחמישה מיליליטר PBS כדי לשטוף את הכלים על ידי הוספה, סיבוב ושאיבת המאגר. הוסף לתרבית חמישה מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA של 0.1% והחזיר אותה לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ הפוך במהירות של ארבע עד פי 10, בדוק שהתאים מתנתקים מהצלחת, הופכים עגולים וצפים. הקש בעדינות על צד צלחת התרבית כדי לעקור את התאים ובמידת הצורך, דגר מחדש את המנה למשך חמש דקות נוספות עד שרוב התאים מנותקים. לאחר מכן, בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, הוסיפו חמישה מיליליטר של מדיום הרחבה לכלי ואספו את כל הנוזל לצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר.

אם התאים נשארים דבוקים לצלחת התרבות לאחר שלושה סבבים של טריפסיניזציה, השתמש במגרד תאים סטרילי כדי לשחרר בעדינות את התאים הנותרים ועם חמישה מיליליטר של מדיום התפשטות, שטפו את המגרד והכלי ואספו את התוכן לאותו צינור חרוטי מסומן. צנטריפוגה את הצינור ב -360 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנטנט והשתמשו במיליליטר אחד של מדיום התפשטות כדי להשעות מחדש את כדור התא.

לאחר מכן השתמש בהמוציטומטר כדי לספור את התאים. הפשירו את מטריצת קרום המרתף על קרח לפי הוראות היצרן. הפרד מספר מתאים של תאי מעבר טריפסיניים דיפרנציאלית לריכוז סופי של 500,000 תאים למיליליטר של המטריצה.

לצלחת של ארבע בארות השתמש ב -200, 000 תאים ואסוף אותם לצינור של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תערובת התאים בלא יותר מ -360 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, שאפו לחלוטין ובזהירות והשליכו את המדיום, תוך הקפדה לא להפריע לכדור התא.

שמור את צינור התאים על קרח כאשר אינך מטפל בו באופן פעיל. השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי להוסיף 100 מיקרוליטר ממטריצת קרום המרתף לכל באר מתוכננת לתאים. אמנם לא מרוקן לחלוטין את קצה הפיפטה כדי למנוע החדרת בועות אוויר, אך פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את התאים בזהירות וביסודיות.

זז במהירות כדי למנוע התמצקות של המטריצה. כדי לזרוע מטריצה של 100 מיליליטר לתוך כל באר של צלחת תרבית IVF עם ארבע בארות, השתמש במספריים נקיים כדי לקצץ את שלושת עד ארבעה המילימטרים הדיסטליים מקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. פיפטה בזהירות ובאטיות טיפה של 100 מיקרוליטר של תערובת מטריצת תאים למרכז כל באר, וודא שהטיפה תישאר כדורית ולא תיגע בצידי הבאר.

דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 30 דקות עד שהיא מוצקה. לאחר מכן פיפטה בזהירות 500 מיקרוליטר של מדיום בידול לכל באר, תוך הקפדה לא להפריע לירידת המטריצה. ודא שהמדיום רק מכסה את הטיפה והוסף עוד במידת הצורך.

כדי לתרבית ספרואידים HNE, באמצעות קצה פיפטה של מיליליטר אחד, שואבים בעדינות את כל המדיום מהבאר תוך הימנעות מהמטריצה שתשמיד את הספרואידים. לאחר מכן עם קצה פיפטה טרי של מיליליטר אחד ותוך הימנעות מלגעת או להפריע למטריצה, הוסף בעדינות 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות לבאר סביב המטריצה. המשיכו לדגור על הספרואידים, והחליפו את מדיום ההתמיינות שלוש פעמים בשבוע כפי שהודגם זה עתה.

תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 20, הערך את המורפולוגיה הספרואידית מדי יום. ספרואידים אמורים להיווצר תוך שלושה עד חמישה ימים מהציפוי ולהגיע לבגרות תוך כ-10 ימים. HNEs צריכים להיצמד לצלחת התרבות וליצור איים קטנים תוך 72 שעות מרגע הזריעה.

דוגמאות להיווצרות איים טובים וגרועים בשבוע אחד מוצגות כאן. האיים צריכים להתרחב כדי לכסות את המנה במהלך 15 עד 30 יום. במהלך שלושת עד ארבעה הימים הראשונים של התרבות, מבנים ציסטיים קטנים אמורים להתחיל להיווצר במטריקס ולהבשיל במשך כ -10 ימים.

אם מצופים בצפיפות המתוארת, תרביות מוצלחות יכילו 50 עד 100 ספרואידים לכל טיפת מטריצה. הלומנים עשויים להיות שקופים יחסית כמו ב-CFTR מסוג בר או מלאים בפסולת תאית וריר כמו בספרואידים CF. מיסוך לתיחום האזור הלומינלי של הספרואידים מודגם בשני לוחות אלה.

מוצגות כאן דוגמאות לתרבויות ספרואידיות לא מוצלחות שנוצרו בצורה גרועה. כפי שמודגם בגרפים אלה ממבחנים פונקציונליים, ספרואידים מנבדקים עם CFTR מסוג פרא צריכים להתנפח במשך שעה כאשר הם מגורים וצריכים להתנפח פחות או להתכווץ אם הם מגורים בנוכחות מעכב CFTR inh-172. ספרואידים מנבדק הומוזיגוטי עבור F508del-CFTR צריכים להתכווץ או להתנפח מעט מאוד עם נפיחות מוגברת או פחות התכווצות כאשר הם מתוקנים פרמקולוגית עם מאפנני CFTR VX809 ו-VX770.

לאחר השליטה, זריעת ספרואידים של תאי אף יכולה להיעשות תוך 15 עד 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על נהלי הפעלה נקיים בתוך ארון הבטיחות הביולוגית כדי למזער את הסיכון לזיהום הדגימה ולמנוע סיכונים לבריאותך. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קיבוע, צביעה ומיקרוסקופיה על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי מורפולוגיה והרכב תאים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספרואידים ראשוניים של תאי אף אנושיים שניתן להשתמש בהם כבדיקה מותאמת אישית של תפקוד CFTR. אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות ראשוניות עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש נכון בציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.