Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לווסת את ביטוי הטרנסגנים על ידי מתן הגורם הכימי tebufenozide. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה התאית והמולקולרית, כגון מתי אתה צריך לעורר את הביטוי של גן מעניין בזמן הרצוי עם חוזק רצוי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי שילוב כל האלמנטים הנדרשים לביטוי טרנסגנים בתוך וקטור יחיד, ניתן לעורר ביטוי טרנסגנים על ידי מתן המשרה הכימי tebufenozide.

לאחר שיבוט ה-EGFP או ANKRD13A טרנסגנים על פי פרוטוקול הטקסט, הכינו ארבע מנות תרבית תאים המכילות תאי HEK 293 טריים בחמישה מיליליטר של DMEM בתוספת 5 עד 10% FBS ואנטיביוטיקה, אשר יכונו להלן מדיום תרבית. שמור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כאשר התאים מגיעים לצפיפות של 50 עד 60%, הוסף שלושה מיקרוליטרים של מגיב טרנספקציה ל-200 מיקרוליטר של מדלל המכיל את ה-DNA.

לאחר דגירה של התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, הוסיפו את התערובת לתאי HEK 293. השתמש בשתי מנות לטרנספקציה, והשאיר את השתיים האחרות ללא טיפול כבקרה. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות.

לאחר הדגירה, הוסף Teb לאחת מהדגימות שהועברו ולאחת מבקרות הלא מועברות. השאירו את שתי הדגימות האחרות ללא טיפול כבקרות ניסוי. דגרו את הצלחות למשך 12 עד 48 שעות.

אם אתה משתמש בתוספת EGFP, נתח את ביטוי EGFP תחת מיקרוסקופ פלורסנט. אחרת, כדי לקצור את התאים לצורך אימונובלוטינג, השתמשו ב-PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, השתמש במגרד תאים כדי להסיר אותם מהצלחת, ולהעביר אותם לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, סובב את הצינורות ב 21, 000 פעמים גרם ו -18 עד 25 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. לאחר מכן, לאחר השלכת ה-PBS, הוסף לגלולה 0.5 מיליליטר של מגיב מיצוי חלבון יונקים קרים כקרח, או M-PER, ומעכב פרוטאז. השעו מחדש את התאים עם מספר סבבי פיפטינג.

לאחר מכן, דגרו את תרחיף התאים בטמפרטורה של 18 עד 25 מעלות צלזיוס וטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. סובב את הליזאט של התא ב 21, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט המימי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר, ונתחו אותו על ידי אימונובלוטינג עם הנוגדנים המתאימים.

כדי להרוות את גירוי ה-Teb, הסר את מדיום התרבית המכיל Teb מהתאים, והשתמש ב-PBS מחומם מראש כדי לשטוף את התאים פעמיים. לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין/EDTA, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. הוסף לתאים 10 מיליליטר של מדיום תרבית מחומם מראש ונטול Teb, והשתמש במגרד תאים כדי לקצור אותם.

העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, סובב את התאים ב -21, 000 פעמים גרם ו -18 עד 25 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. השעו מחדש את התאים ב-50 מיליליטר של מדיום תרבית מחומם מראש ונטול Teb, והעבירו חמישה מיליליטר מהתאים לשלוש צלחות תרבית תאים טריות של 60 מילימטר.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24, 48 ו-72 שעות, בהתאמה. לבסוף, קצרו את התאים בנקודות זמן שונות, ומדדו את רמות הביטוי של הטרנסגן באמצעות אימונובלוטינג. בניסוי זה שהעריך את הפעילות והדליפה של pEUI-plus-EGFP, טרנספקטנטים וקטוריים מדומים לא הראו אות פלואורסצנטי ללא קשר לטיפול ב-Teb.

עם זאת, טרנספקטנטים pEUI-plus-EGFP הפכו רגישים בהדרגה לכמות ההולכת וגדלה של Teb. חשוב מכך, טרנספקטנטים pEUI-plus-EGFP שלא טופלו ב-Teb לא עוררו אותות EGFP הניתנים לזיהוי. ANKRD13A מתויג FLAG שימש כדי לאמת עוד יותר את ההיענות של pEUI-plus ל-Teb.

כפי שמוצג בכתם המערבי הזה באמצעות נוגדנים נגד FLAG, תאי HEK 293 שעברו טרנספטציה הראו ביטוי ANKRD13A חזק לאחר טיפול של 24 שעות ב-Teb. בנוסף, דלדול Teb הדגים את ההפיכות של מתג הגן pEUI-plus, מכיוון ש-ANKRD13A כבר לא ניתן היה לזהות בתאים שגודלו ללא Teb. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע כמעט את כל הניסוי בתנאים נטולי חיידקים. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות, כמו מערכת Tet-On או Tet-Off כדי לבטא באופן דיפרנציאלי שני טרנסגנים נפרדים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את הפיזיולוגיה המולקולרית ברמה התאית.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בווקטור מתג הגנים pEUI-plus לצורך גרימת ביטוי טרנסגנים בזמן הרצוי עם חוזק רצוי. אל תשכח שעבודה עם טבופנוזיד עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת חלוק מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.