Name: Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: למד פרוטוקול מיקרו-הזרקה לעריכת גנום ב-Diabrotica virgifera virgifera באמצעות CRISPR/Cas9. שיטה זו מאפשרת מחקר פונקציונלי של מנגנוני עמידות מזיקים בחקלאות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק של התוכנית מחקר מונסנטו ידע Rootworm תירס, מעניק מספר AG/1005 (ל MDL, שיקו לוי) וקרנות סטארט-אפ ל MDL מן NCSU. FC נתמכה על ידי מענקים של מונסנטו תירס Rootworm ידע תכנית המחקר (AG/1005), הקרן הלאומית למדע, להעניק מספר MCB-1244772 (MDL). המחברים מצהירים אין אינטרסים מתחרים. FC ו- MDL נוצר ועוצב הניסויים; FC, PW ו- SP לבצע את הניסויים; FC ו- MDL ניתח את התוצאות; FC, נג ו- MDL כתב היד. אנו מודים תרזה אולירי, ויליאם Klobasa, סטפני גורסקי על סיוע מומחה שלהם הקרנה WCR. אנו מודים גם ד ר צרפתי וייד (USDA-ARS, צפון מעבדת המחקר החקלאי המרכזי, ברוקינגס, SD) עבור משלוחים ביצים להקים מושבות מעבדה, מתן פרוטוקולי גידול.

1. המושבה ברמת לגידול של מבוגרים WCR
<ol><li>בכמות ובאיכות של מבוגרים WCR (500-1000) ממעבדת החברה או מחקר אמין (ראו טבלה של חומרים לדוגמה) ומניחים בתוך כלוב3 30 ס מ. הערה: השימוש זן הלא-diapausing מומלץ בחום.</li>
	<li>הכנת מזון מלאכותי WCR ע פ הפרוטוקול של היצרן ויוצקים שכבה בעובי של ס מ 1 לתוך מיכל עוז 38 (ראה טבלה של חומרים). לאחר ערבוב, לאחסן דיאטה בשימוש ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	<li>לשים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם דיאטה למבוגרים (10-15 גרם) לתוך כלוב3 30 ס מ. הוסף עוד דיאטה כאשר המזון הוא נמוך או יבש.</li>
	<li>לשים בקבוקון (300 מ ל) עם מים, מכוסה עם כדור צמר גפן, אשר משמש כדי להחזיק במקום גליל כותנה (6 "x" 3/8), כדי לשמש כמקור מים. להחליף את המים כאשר הוא פועל נמוכה.</li>
	<li>לשמור על WCR בטמפרטורה 26 ° C עם 60% לחות, מחזור 14:10 אור חרק חממה לגידול.</li>
</ol>2. העובר אוסף ויישור
<ol><li>להפוך תא איסוף ביצים באמצעות אגר 1% במים סטריליים 100 x 15 מ"מ2 פטרי. לאחסן ב 4 ° C לאחר עפור אגר.</li>
	<li>לאסוף ביצים הניח שזה עתה, מניחים שכבה אחת של נייר סינון, ואחריו 4 שכבות של גזה (כל חתך לגודל) על פני השטח של אגר (איור 1 א'). הערה: גזה הניתנים לשימוש חוזר, לאחר שטף של אקונומיקה, בלוק, אבל זה לא הכרחי כדי לעשות את זה עבור השימוש הראשון. נייר סינון לא חוזר, אינו צריך להיות מעוקר.</li>
	<li>מניחים ביצה וספרייט לכלוב WCR מאוחר ביום ככל האפשר (בסוף יום העבודה) ולכסות עם אוהל נייר כסף. להשאיר למשך הלילה. הערה: נתקל האורות השעות 10:00 לביצה עיכובים 12 בבוקר (14 h) הנחת, למוצא האוסף של הצעיר ביצים עבור microinjection ללא צורך אנשי המעבדה למקם את האוסף קאמרית כלוב מאוחר בלילה.</li>
	<li>להסיר תא איסוף ביצים בסביבות 8 או 9 בבוקר</li>
	<li>להשתמש מלקחיים לאסוף שכבה 1 של גזה זמן ומקום ב גביע (500 מ"ל) מים. לשטוף ביצים ממני אריג מרושת על ידי בעדינות ערבוב (איור 1B וג 1).</li>
	<li>להשתמש על פיפטה הנורה כדי להעביר ביצים עוד גביע (500 מ"ל) מים. חזור על x 2-3 כדי לנקות את הביצים.</li>
	<li>להשתמש את הנורה פיפטה להעביר ביצים על גבי נייר סינון (איור 1D) תוך צמצום כמות המים carry-over.</li>
	<li>חתוך שחור מסנן נייר לרצועות רחב כמו שקופיות זכוכית ואת הסרט בחוזקה אל השקופית כדי לוודא הנייר מניח שטוח (איור 2 א). הערה: נייר סינון שחור מסייע לשפר את הראות תחת המיקרוסקופ על-ידי הפחתת כמות האור המוחזר.</li>
	<li>החלת דבק רעיל (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ) על נייר הסינון של קווים עדינים (איור 2B). שמור את הקווים דבק דק יותר הקוטר של ביצה. כדי להימנע מקבלת את הביצים מצופה דבק.</li>
	<li>השתמש במברשת בסדר כדי להניע בעדינות WCR ביצים אחת של נייר סינון שלהם לקו דבק. נסו להניח את הביצים על הדבק לפני וזה מייבש ולשמור על ביצה אחת לפחות של המרחק בין כל ביצה.</li>
	<li>למקסם יעילות הזרקת על ידי הצבת מספר שורות של ביצים בשקופית אחת נייר סינון (איור 3).</li>
	<li>לאחר כל הביצים נפרסות על נייר הסינון, המתן עד כל שהדבק מתייבש לפני microinjection. הערה: שינוי germline ולקבלת הגנום CRISPR/Cas9-מתווכת, עריכה, להזריק כל העוברים עד הצהריים (12 P.M.) כך העובר הבכור הוא בן יותר מ- 19 h. עם זאת, עבור RNAi, יש ללא מגבלה של זמן, כי ב- WCR, dsRNA יכול לעבור בין תאים. למעשה, עבור RNAi, העוברים יישון עשוי להתבטא טוב יותר שיעורי ההישרדות.</li>
</ol>3. הכנת פלסמיד DNAs, מחטים הזרקת
<ol><li>להכין דנ א פלסמיד supercoiled באיכות גבוהה תוך שימוש מסחרי ללא אנדוטוקסין קיט (לקבלת דוגמה, ראה טבלה של חומרים ).</li>
	<li>כדי להכין את הפתרון הזרקה, לבדוק את ריכוז כל פלסמיד ולאחר מכן לשלב המסייע פלסמיד (250 ריכוז סופי ng/µL), תורם פלסמיד (750 ריכוז סופי ng/µL), מאגר פנול אדום (ריכוז סופי של 20%). מערבולת הפתרון בקצרה, צנטריפוגה במשך 3 דקות במהירות המרבית, כדי לזרז חלקיקים יכול לסתום את המחט.</li>
	<li>משוך זכוכית בורוסיליקט מחטים (יתר 1 מ"מ, זיהוי 0.58 מ"מ, 10 ס מ אורך) באמצעות פולר micropipette סוג של חום/הבוערים. לאחסון, לאבטח מחטים משך דו-צדדית קלטת דביק צלחת פטרי או אחרים מיכל ברורה. הערה: עבור מערכת פולר micropipette, ההגדרות המשמשות היו: חום = 335, FIL = 4, ול = 40, דל = 200, דופק = 100.</li>
	<li>מילוי המחט הזרקת באמצעות מיקרו-העובדים עצה (ראה טבלה של חומרים) כדי pipet 0.5 - 1.0 µL למטה בתוך המחט, ליד הקצה מחודדות. הסר בועות קצה המחט אם כל להתרחש.</li>
	<li>הכנס את המחט הזרקה בעל מחט.</li>
	<li>פתח את קצה המחט על-ידי שבירת בעדינות עם זוג נאה מלקחיים, או בעדינות לגעת/גרירת הקצה בשקופית coverslip או זכוכית. הערה: המטרה היא המזח הקטן ביותר שמאפשר את התמהיל הזרקת לצאת החוצה (פתחים קטנים יותר בדרך כלל דורשות הזרקה בלחץ גבוה יותר). מחטים משופעים ואינם דורשים שלב זה מאז הם כבר פתוחים.</li>
</ol>4. microinjection והטיפול שלאחר הזרקה
<ol><li>שימוש במכחול בסדר, בזהירות רטוב המשטח של 1-3 ביצים עם מים סטריליים את המחט, להזריק את הפתרון. להזריק כל ביצה לפני השטח מתייבש. חפשו את המראה כמות קטנה של צבע אדום בתוך ביצים במהלך ההזרקה כדי לציין את microinjection מוצלח. לרסק או להסיר את כל הביצים נראה פגוע, ריק, או אחרת לא יכול להיות מוזרק. הערה: למרות הזרקה בלחץ משתנה בהתבסס על גודל נשא מחט, 10-13 psi הוא נקודת התחלה טובה.</li>
	<li>לאחר כל הביצים מוזרקים, להסיר את נייר סינון השקופית זכוכית.</li>
	<li>מניחים נייר הסינון על פני השטח של צלחת אגר 1% (המתואר לעיל).</li>
	<li>השתמש פרפין פלסטיק הסרט החותם את המנה, ותשים חרק 26 ° C לגידול חממה במשך 12 יום. הערה: הסרט פרפין תסייע למנוע זיהום עובש בין הצלחות. עם זאת, כל טיפול אחר למניעת התפתחות חיידקים ולעצב יכול להפחית את ההישרדות של העוברים מוזרק.</li>
</ol>5. culturing וגדלים של עוברי
<ol><li>הפעלת בדיקת העוברים 12 ימים שלאחר הזרקת עבור הזחלים שזה עתה בקעו ולהמשיך מדי יום במשך השבועיים.</li>
	<li>להעביר את הזחלים, בעזרת מברשת בסדר, לתיבת rearing עם נבט התירס ואדמה. הערה: עובש יכול לגדול לתוך המנה אגר, אך הזחלים יבקעו עדיין ברוב המקרים. חפשו את הזחלים בזהירות בתוך כייר לתפוס את כולם. הזחלים קצת אולי להעביר המכסה של המנה, אולי נתקע עיבוי.</li>
	<li>אחורי הזחלים בטמפרטורה 26 ° C בעקבות תקן WCR לגידול בשיטות25.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות microinjection של WCR עם dsRNAs לצורך RNAi כבר דווח על9, זהו הפרוטוקול הראשון להקים מומלצות microinjecting precellular WCR עוברי, תהליך קריטי עבור ניצוח germline שינוי ו/או הגנום CRISPR/Cas9 עריכה של מין זה. Microinjection מוצלחת של WCR עוברי הוא תלוי בגורמים רבים, וכן יעילות טרנספורמציה. בהמשך הם בחלק מן הנושאים העיקריים להשפיע על התוצאה של שימוש בפרוטוקול זה לשינוי germline לחיפושית הזאת.
קבלת עוברי precellular כפי שהוזכר לעיל, ה-DNA לא עובר ...

תירס המערבית rootworm (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, היא הדברה חשובים של תירס1. מעניין, WCR מופיע כדי להתגבר על שליטה מודד במהירות רבה יותר מאשר מזיקים החקלאי ביותר מאז הם לא רק להתאים מבחינה פיזיולוגית, אלא גם בהתנהגותו2,3,4,5, 6. בעשור האחרון, RNA הפרעה (RNAi), כלי רב-עוצמה פונקציונלי גנומית נחקר כשיטה בקרה פוטנציאליים עבור7,WCR8, ו גם שימש כאמצעי ללמוד ג'ין פונקציה9. אולם, בעוד RNAi מבוצע לעתים קרובות על ידי microinjection של זוגיות גדילי RNA (dsRNA) בחיות אחרות, מבוססת על הזרקת RNAi הוא נדיר WCR. למעשה, ישנם רק כמה דיווחים של RNAi באמצעות microinjection של dsRNA לתוך WCR9. הסיבה היא כי WCR יכולים להשיג גבוהה-רמות של ג'ין תמונות ציפורים באמצעות בליעה של dsRNA7,10, אפילו המתיר את חקר תופעות עובריים מאכילים dsRNA אמא11. בעוד ששיטה זו עושה WCR נושא מצוין עבור אנליזה גנומית פונקציונלית ויה RNAi, זה הואטה ההתקדמות על פיתוח מתודולוגיות עובריים microinjection במין זה.
למרות כוחו של RNAi, ישנם כמה חסרונות. לדוגמה, לא כל הגנים להגיב באותה מידה RNAi. ההשתנות יכול להפוך לפרש את התוצאות של לסיבי assay קשה יותר. בנוסף, RNAi הוא חולף, אינו יוצר מוטציות heritable. מצד שני, germline טרנספורמציה, עוד כלי גנומית תפקודית, ניתן ליצור מוטציות heritable באמצעות החדרת טרנספוזון מסומן לתוך הגנום12,13. זה עושה את השינוי germline כלי מצוין ליצירת זנים מוטציה לשימוש במחקרים גנטיים לטווח ארוך. השינוי יכול לשמש גם כדי להציל מוטציה על ידי מסירת עותק פונקציונלי של הגן הגנום מוטציה14. יתר על כן, השינוי germline היא אבן הפינה של מגוון רחב של טכניקות גנטיות מולקולריות. בנוסף לדפוק ו/או הצלת תפקוד הגן, טרנספורמציה germline יכול לשמש משפר השמנה15, ג'ין השמנה16, המבוסס על Gal4 ביטוי חוץ רחמי17של הגנום כולו מוטגנזה מכוונת18.
לאחרונה, פותחו כלים המאפשרים עריכה מתוחכמת הגנום. כלים אלה כוללים שעתוק Activator-Like אפקטור Nucleases (TALEN), CRISPR/Cas9-נוקלאז מערכת19,20. היתרון של כלים חדשים אלה הוא בכך שהם מציעים החוקרים את היכולת לגרום להפסקה DNA גדילי כפול כמעט בכל מקום בתוך כמעט בכל הגנום. ברגע המושרה, הפסקות אלה ניתן לתקן באמצעות אחד מהקצוות שאינם הומולוגיים הצטרפות, אשר יכול להציג מחיקות או הוספות בגן יישוב, או באמצעות תיקון מכוון הומולוגיה, אשר בנוכחות לבנות מהונדסים, יכולים לעודד החלפה של גנים כולו או אזורים גנטיים21,22. עם זאת, שיטות אלה דורשים microinjection של ה-DNA, RNA או החלבון לתוך עוברי צעיר מאוד.
חשוב, בניגוד dsRNAs המשמש RNAi, חומצות גרעין וחלבונים המשמשים germline שינוי ועריכה הגנום לא יכול בקלות לחצות קרום התא. לכן, microinjection של פלסמיד DNAs, mRNAs, ו/או חלבונים חייב להתבצע במהלך השלב syncytial blastoderm (דהיינו לפני העובר חרקים cellularizes). זה הופך התזמון של זריקות גורם קריטי. לדוגמה, ב- דרוזופילה melanogaster, העוברים צריך להיות מוזרק בתוך שעתיים אחרי ביצה שכבה12. לפיכך, פיתוח פרוטוקול microinjection עובריים מוצלח עבור WCR חייב לקחת בחשבון את התנאים הטובים ביותר להטלת הביצית, כמו גם השיטה הטובה ביותר לאיסוף כמויות מספיקות של עוברי precellular.
מאמץ להביא מגוון רחב של כלים גנטיים על ביולוגיה WCR דורש פיתוח שיטות איסוף של microinjecting precellular WCR עוברי. כאן אנו מספקים הוראות מפורטות, יחד עם טיפים וטריקים, לעזור לאחרים להשתמש בטכניקות מבוססות-טרנספורמציה במחקר WCR. ומאריכים הטרנסגניים טכנולוגיות כדי WCR לשימוש פונקציונלי גנומית מחקרים, טכניקות אלו מאפשרים גם עוצמה אסטרטגיות שליטה חדשות המזיק כגון גנים נסיעה23,24 ייבדק בזה כלכלית המזיק.

<table><tbody><tr><td>נייר סינון איכותי (שחור)</td> <td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>עבור הזרקת מיקרו ביצה</td></tr><tr><td>1 oz מיכלים&nbsp;</td><td>כלי שולחן מפלסטיק של אנני</td><td>ASET101</td><td>מיכל ביצים</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>מצע לכלי הטלת ביצים WCR</td></tr><tr><td>מלקחיים במשקל נוצה&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>טיפול בזחלים וגלמים&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>לשטוף תירס וכלים</td></tr><tr><td>האהוב על נהג משאית Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>תירס להאכלת</td></tr><tr><td>מערכת מיקרו-הזרקה WCR (תוצרת בית)</td><td></td> <td>NA חלקים והוראות זמינים על פי בקשה</td><td>שולט בלחץ ההזרקה (0-20 psi)</td></tr> <tr><td>הדבק הלא רעיל של Elmer's</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>דבק ביצים על נייר סינון</td></tr><tr><td>epTIPS טיפים למיקרו-טוען</td><td>אפנדורף</td><td>C2554691</td><td>מילוי חוזר טיפים לטעינת מחט</td></tr><tr><td>פלקון כלי תרבית רקמות</td><td>פלקון</td><td>25383-103</td><td>הנבטת תירס /150 x 25 מ"מ</td></tr><tr><td>פישרברנד&nbsp; מעגלי נייר סינון בדרגה כמותית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S47576C</td><td>הכנת צלחת אגר להטלת ביצים/9 ס"מ</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>לשטוף כלים</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ רגיל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-549-3</td><td>החזקת נייר סינון וביצים למיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>תולעת שורש תירס מערבית עם תחליף אבקה</td> גבול <td>מדעי החקלאות&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR תזונה מלאכותית למבוגרים</td></tr><tr><td>כדורי צמר גפן, גדול</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>סגור את הבקבוק</td></tr><tr><td>גלובוס מדעי 3.0 מ"ל פיפטות העברת נורה קטנה</td><td>גלובוס מדעי</td><td>137035</td><td>איסוף והעברת ביצים</td></tr><tr><td>Leica M165 FC סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>הקרנת WCR</td></tr><tr><td>סט מסננים DsRed לסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>מסנן עירור: 510-560 ננומטר, מסנן פליטה: 590-650 ננומטר</td></tr><tr><td>מסנן EGFP</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>מסנן עירור: 440&ndash; 520 ננומטר, מסנן פליטה: 510 ננומטר</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>כלוב למושבה למבוגרים</td></tr><tr><td>מברשת צבע מיניאטורית</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ג'ויסטיק</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>מיקרומניפולטור ומחזיק מחט</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ XY שלב</td><td>אולימפוס</td><td>265515</td><td>מיקרוסקופ שלב (מותאם לשימוש עם סטריאוסקופ)</td></tr> <tr><td>כיתה 90 בד גבינה</td><td>חנות בדים מקוונת</td><td>CHEE90</td><td>להטלת</td></tr><tr><td>ביצה סרט פרפין מפלסטיק&nbsp;</td><td>אריזות פלסטיק Pechiney</td><td>PM-996</td><td>צלחת אגר חותם לאחר מיקרו-הזרקה/גודל גליל 4 אינץ' x 125 רגל</td></tr><tr><td>חממת</td><td>Percival Percival&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>תא גידול WCR (אינקובטור לגידול חרקים)</td></tr><tr><td>צלוחיות Erlenmeyer צרות פה</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>מיכל מים למושבה בוגרת&nbsp;</td></tr><tr><td>כוסות גריפין בצורה נמוכה</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>לשטיפת ביצים</td></tr><tr><td>לחמניות כותנה קלועות</td><td>ריצ'מונד כותנה שיניים ושות'.</td><td>605-3599</td><td>שימוש באספקת מים למושבה בוגרת&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות פטרי (35x10 מ"מ)</td> <td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>לצלחות דיאטה</td></tr><tr><td>פנול אדום</td><td>סיגמא</td><td>143-78-8</td><td>מאגר מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפיט מבוסס לייזר</td><td>מכשיר סאטר</td><td>P-2000/G</td><td>מושך מחט / חום = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>קרקע עליונה פרימיום</td><td>חברת סקוטס</td><td>71130758</td><td>אדמה לגידול</td></tr> <tr><td>קרוניםReloc Zippit 2 מיל שקיות רוכסן</td><td>תאגיד הפלסטיק של ארצות הברית</td><td>48342</td><td>שקית צלחת אגר לאחר מיקרו הזרקה/5x7</td></tr><tr><td>צלחות פטרי (100x15 מ')</td> <td>VWR</td><td>89038-968</td><td>הכנת צלחת אגר להטלת ביצים / 100 x 15 מ"מ</td></tr><tr><td>6 אונקיות מיכלים</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR תא הזדווגות זוג יחיד&nbsp;</td></tr><tr><td>38 אונקיות מיכלים</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>קופסת גידול זחלים/38 אונקיות</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 אונקיות מיכל מעדנייה מפלסטיק שקוף למיקרוגל</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>קופסת גידול זחלים/16 אונקיות</td></tr><tr><td>מיקרו הזרקה היקף&nbsp;</td><td>היקף מיקרו-הזרקה</td> <td>של Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td> מצויד בשלב XY</tr><tr><td>נימי זכוכית סטנדרטיים</td><td>מכשירים מדויקים בעולם</td><td>1B100F-4</td><td>מחטי מיקרו-הזרקה</td></tr><tr><td>תולעי שורש תירס מערביות בוגרות צפון</td><td>מרכז מחקר מחקר מעבדה</td><td>זן שאינו דיאפאאז</td><td>בקשה מהמעבדה של ד"ר בריאן ווייד פרנץ'</td></tr><tr><td>ערכת מידי DNA פלסמיד</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>טיהור DNA פלסמיד מוכן להזרקה</td></tr></tbody></table>

microinjection המערבי תירס rootworm, diabrotica virgifera virgifera, העוברים germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום crispr/cas9

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Rootworm תירס המערבי (WCR) המזיק חשוב של תירס והיא ידועה בשל יכולתו להסתגל במהירות אסטרטגיות ניהול בפשט. למרות התערבות ב RNA (RNAi) הוכיח להיות כלי רב עוצמה עבור לימוד הביולוגיה WCR, יש המגבלות. באופן ספציפי, RNAi עצמו הוא חולף (כלומר לא תגרום לטווח ארוך התורשה של פנוטיפ המשויך), וזה דורש לדעת את רצף ה-DNA של הגן היעד. האחרון יכול להיות הגבלת אם פנוטיפ עניין נשלטת על ידי גנים שנשמרת לקוי, או אפילו רומן, כי זיהוי מטרות שימושי להיות מאתגר, אם לא בלתי אפשרי. לכן, מספר כלים בארגז גנומית של WCR צריך ניתן להרחיב באמצעות פיתוח שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי ליצור זנים מוטציה יציב ולאפשר סקרים עצמאית רצף הגנום WCR. במסמך זה, אנחנו פירוט האמצעים שננקטו כדי לאסוף microinject precellular WCR עוברי עם חומצות גרעין. בעוד הפרוטוקולים המתוארים בזאת מכוונים היצירה של WCR מהונדס, עריכה CRISPR/Cas9-הגנום יכול גם להתבצע תוך שימוש באותם הפרוטוקולים, כאשר ההבדל היחיד הוא ההרכב של הפתרון מוזרק העוברים.

שיקול חשוב בעת פיתוח פרוטוקול זה היה השלב של התפתחות בזמנו של microinjection. באופן ספציפי, טרנספורמציה germline דורש microinjection של DNAs לפני cellularization עובריים. זה בגלל DNAs לא יכול בקלות לחצות את קרום התא. ניסיונות כדי להמחיש את שלבי ההתפתחות עובריים WCR בעזרת כתם גרעיני היו לא מוצלח כי dechorionation של העוברים WCR במהותה מתמוסס כל בקרום מגן אחראי השלמות של העובר. עם זאת, קו חקירה זה היה הללו על ידי קושי נוסף – רכישת כמויות מספיקות של עוברי מבעוד. בשדה, WCR הנקבות מטילות את בי...

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור איסוף, microinjecting תירס המערבי precellular rootworm עוברי לצורך ביצוע מבחני פונקציונלי-גנומית כגון germline שינוי ועריכה CRISPR/Cas9-הגנום.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרו-הזרקה זה היא לשנות את הגנום של תולעי שורש התירס המערביות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לביולוגיה של תולעי שורש התירס המערביות ויכולתן להתגבר במהירות על שיטות הדברה כגון BT Toxin ו-RANI. מלבד תולעי שורש תירס מערביות, ניתן ליישם שיטה זו גם על מינים דומים, כגון תולעי שורש דרומיות וצפוניות.הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשהתבקשתי לעזור עם RANI מבוסס הזרקה בתולעי שורש תירס מערביות עוד בשנות ה-90. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו. מכיוון שגידול תולעי שורש תירס מערביות במעבדה הוא עתיר עבודה.ושיעורי ההישרדות נשארים נמוכים באמצעות הטכנולוגיה הנוכחית. השיגו בין 500 ל-1,000 תולעי שורש בוגרות שאינן מגיעות מחברה אמינה או מעבדת מחקר. ולשכן אותם בכלובים של 30 סנטימטר מעוקב.אחסן את התזונה המלאכותית הסטנדרטית של תולעי שורש במיכלי אחסון מזון בעומק של כסנטימטר אחד. ניתן לאחסן תזונה שאינה בשימוש בארבע מעלות צלזיוס עד חודשיים. כדי להאכיל את תולעת השורש, העמיסו צלחות פטרי בגודל 100 סנטימטר עם 10 עד 15 גרם תזונה.טען צלחת מזון אחת לכל כלוב תולעי שורש. ולחדש אותו כאשר האספקה אוזלת או שהתזונה מתייבשת. כמו כן, שמור מאגר מים של 300 מיליליטר, מכוסה בצמר גפן, בכל כלוב שישמש כמקור מים.החלף את המים כשנגמרים. שמרו על תולעת השורש הכלואה ב-26 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ומחזור אור של 14/10 באינקובטור לגידול חרקים. כוונו את שעת כיבוי האורות מאוחר יותר ביום, למשל בחצות, כך שהביצים יוטלו לפני שעות העבודה בבוקר.ראשית, אסוף את העוברים. למשטח איסוף ביצים, טען צלחת פטרי 100 מילימטר עם 30 מיליליטר של 1% אגר ומים. לאחר מכן, הניחו שכבה אחת של נייר פילטר על האגר, ואחריה ארבע שכבות של בד גבינה.יש לחתוך כל שכבה לגודל. לאחר מכן, מאוחר ככל האפשר, הכניסו את צלחת איסוף הביצים לכלוב תולעי השורש וכסו אותה באוהל נייר כסף. ואז למחרת בבוקר, הסר את תא איסוף הביציות.השתמש במלקחיים כדי להרים שכבה אחת של בד גבינה בכל פעם ולהניח בכוס של 500 מיליליטר עמוסה במים. שוטפים את הביצים מבד הגבינה על ידי ערבוב במים. לאחר מכן, השתמש בצינור נורה כדי להעביר את הביצים לכוס מים אחרת כשלב שטיפה.בצע שתיים או שלוש כביסות באופן זה. לאחר מכן, הפקידו את הביצים הנקיות על נייר סינון עם כמה שפחות מים. לאחר מכן, הכן שקופית על ידי הדבקת פיסת נייר סינון שחור שטוח על השקופית כדי לשפר את הניגודיות.לאחר מכן טפטפו קווים עדינים של דבק לא רעיל על הנייר שישמש לאבטחת הביצים. שמור את הדבק מתחת להיקף הביצה. בזמן שהדבק רטוב, השתמש במברשת דקה כדי להניח את הביצים על קו הדבק.שמרו על מרחק של ביצה אחת לפחות בין כל ביצה. הכן מספר שורות ביצים לכל שקופית. כעת יש להזריק את הביצים תוך 30 דקות.כעת, שלב את הפלסמיד העוזר, הפלסמיד התורם והמאגר האדום של פנול. השתמש בפלסמידים איכותיים וסופר מפותלים המיוצרים עם ערכה מסחרית נטולת אנדוטוקסין. פורטקס לזמן קצר לערבב.ואז מסובבים חלקיקים למשך שלוש דקות במהירות מרבית. לאחר מכן, מילוי חוזר משך מחטי זכוכית בורוסיליקט עם 0.5 עד 1 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה. אם נוצרות בועות כלשהן, הקפד להסיר אותן.לאחר מכן, חבר את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור. כעת, במידת הצורך, תחת המיקרוסקופ, שברו בעדינות את קצה המחט האטום באמצעות זוג מלקחיים עדינים או על ידי נגיעה עדינה בקצה לתוך מחסום זכוכית. נסה ליצור את הפתח הקטן ביותר האפשרי המשחרר תמיסת הזרקה.לפני הזרקת ביצי תולעי השורש, השתמש במברשת דקה כדי להרטיב בזהירות את פני השטח של ביצה אחת עד שלוש מוכנות במים סטריליים. לאחר מכן, הזריק את העוברים הרטובים. הכנס בעדינות את המחט לאמצע העובר, והזריק נפח קטן של תמיסה.התחל בשימוש בלחץ של 10 עד 13 psi והתאם את הלחץ לפי הצורך. לעוברים יבשים יש צורה עגולה מובהקת, על ידי הרטבה מוקדמת של כל עובר במים ישנה את צורתו וירכך את קליפת הביצה ובכך יאפשר למחט לחדור בקלות. לעובר שהוזרק בהצלחה תהיה כמות קטנה של צבע אדום.אם ביצה נפגעה, נראית מוזרה או שלא ניתן להזריק אותה, מועכים אותה או מסירים אותה מהשקופית. לאחר הזרקת כל הביצים, העבירו את נייר הסינון עם הביצים עליו לכלי אגר של 1%. לאחר מכן, אוטמים את המנה בניילון פרפין ודוגרים אותה בחום של 26 מעלות צלזיוס עד לבקיעת הזחלים.12 יום לאחר ההזרקה, התחל לבדוק אם יש זחלים מדי יום במשך השבועיים הבאים. מעבירים את הזחלים בעזרת מברשת דקה לקופסת גידול עם תירס מונבט ואדמה כדי לגדל אותם בתנאים סטנדרטיים. טרנספורמציה של קו הנבט של תולעת שורש נוסתה על ידי הזרקה משותפת של פלסמיד הנושא טרנספוזאז עם טרנספוזון הנושא פלסמיד לעוברים טרום-תאיים.ב-26 הניצולים, כל ביטוי EFP שימש לסינון החדרת אלמנט תורם. למרות שזוהו צאצאים של תולעי שורש, בדיקת עוברי תולעי שורש עם מקור האור העז הוכחה כקטלנית. הסיבוב הבא של טרנספורמציה של קו הנבט השתמש בגן חלבון פלואורסצנטי אדום המונע על ידי מקדם פעיל מכונן מ-Drosophila melanogaster.שיעורי ההישרדות השתפרו, אך רק זחל אחד של DS אדום חיובי נרשם. לאחר מכן, העוברים הוזרקו במיקרו עם בופר לבד או עם פלסמידים של DNA תורם מסייע ומסומן ביסודיות. יחס דומה של עוברים בקעו כאשר הזריקו להם פלסמידים או בופר בלבד.ומעניין שרק כמחצית מהעוברים שלא הוזרקו בקעו. זה העלה את הקטלניות של מניפולציה של העוברים לזריקה לגבוהה כמו ביצוע ההזרקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו עוברי שורש תירס מערבי.לאחר השליטה ניתן להזריק 200 עד 300 עוברים בשעה בטכניקה זו. שיטה זו חייבת לטכניקות שפותחו לשינוי קו הנבט של Drosophila melanogaster המשמשות כתבניות החלות על מינים רבים אחרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנום של Western Corn Rootwall.על מנת לענות על שאלות ספציפיות על תפקוד הגנום.

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

זבוב הפירות הים תיכוני (Diptera: Tephritidae) הוא מזיק חקלאי עולמי. הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה שלו היא המפתח לשליטה באוכלוסיות הזבוב הים-תיכוני ובכך להפחית את ההשפעה הכלכלית. מיקרו-הזרקת עובר היא כלי בסיסי המאפשר הן טרנספורמציה של קו הנבט והן מחקרי גנטיקה הפוכה במין זה.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

Microinjection Nasonia vitripennis העובר היא שיטה חיוני ליצירת שינויים heritable הגנום. המתוארים כאן היא הליך מפורט עבור microinjection והשתלת העובר Nasonia vitripennis , אשר יקל מאוד הגנום בעתיד מניפולציה של האורגניזם.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

פרוטוקול זה מתאר הליכי מיקרו-אינצ'ק עבור עוברים Culex quinquefasciatus הממוטבים לעבודה עם כלי עריכת גנים CRISPR/Cas9. טכניקה זו יכולה ליצור ביעילות מוטציות ספציפיות לאתר, תורשתיות, נבטים שניתן להשתמש בהן לבניית טכנולוגיות גנטיות בווקטור המחלה המאופק הזה.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

אנו מספקים פרוטוקול מפורט לגידול, microinjection של ביצים עבור הזדווגות יעילה של האש Thermobia domestica כדי ליצור ולתחזק זנים מוטנטים לאחר עריכת הגנום.

מיקרו-ג'יג'יטציה של ביצים והזדווגות יעילה לעריכת גנום בבית הכבאות תרמוביה

כאן, אנו מתארים שיטות להזרקות יעילות של פופלים ומבוגרים בנסוניה ויטריפניס כחלופות נגישות למיקרו-אינטרנציקציה של עוברים, המאפשרות ניתוח פונקציונלי של גנים בעלי עניין באמצעות השתקת RNA באמצעות הפרעת RNA (RNAi) או נוקאאוט גנים באמצעות עריכת גנום CRISPR/Cas9.

זריקות פואפאל ומבוגרים לעריכת גנים RNAi ו- CRISPR בנסוניה ויטריפניס

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מוצג כאן פרוטוקול של Helicoverpa armigera (Hübner) עובר microinjection וזיהוי מוטציה נוקאאוט שנוצר על ידי עריכת הגנום CRISPR / Cas9. חרקים מוטנטיים מאפשרים מחקר נוסף של תפקוד הגנים ואינטראקציה בין גנים שונים ב- vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

למד פרוטוקול מיקרו-הזרקה לעריכת גנום ב-Diabrotica virgifera virgifera באמצעות CRISPR/Cas9. שיטה זו מאפשרת מחקר פונקציונלי של מנגנוני עמידות מזיקים בחקלאות.

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9 (וידאו) | JoVE Journal

Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

גלה סרטונים נוספים