Microinjection המערבי תירס Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, העוברים Germline טרנספורמציה או לעריכה של הגנום CRISPR/Cas9

המטרה הכוללת של פרוטוקול מיקרו-הזרקה זה היא לשנות את הגנום של תולעי שורש התירס המערביות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הנוגעות לביולוגיה של תולעי שורש התירס המערביות ויכולתן להתגבר במהירות על שיטות הדברה כגון BT Toxin ו-RANI. מלבד תולעי שורש תירס מערביות, ניתן ליישם שיטה זו גם על מינים דומים, כגון תולעי שורש דרומיות וצפוניות.

הרעיון לשיטה זו עלה לי לראשונה כשהתבקשתי לעזור עם RANI מבוסס הזרקה בתולעי שורש תירס מערביות עוד בשנות ה-90. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו. מכיוון שגידול תולעי שורש תירס מערביות במעבדה הוא עתיר עבודה.

ושיעורי ההישרדות נשארים נמוכים באמצעות הטכנולוגיה הנוכחית. השיגו בין 500 ל-1,000 תולעי שורש בוגרות שאינן מגיעות מחברה אמינה או מעבדת מחקר. ולשכן אותם בכלובים של 30 סנטימטר מעוקב.

אחסן את התזונה המלאכותית הסטנדרטית של תולעי שורש במיכלי אחסון מזון בעומק של כסנטימטר אחד. ניתן לאחסן תזונה שאינה בשימוש בארבע מעלות צלזיוס עד חודשיים. כדי להאכיל את תולעת השורש, העמיסו צלחות פטרי בגודל 100 סנטימטר עם 10 עד 15 גרם תזונה.

טען צלחת מזון אחת לכל כלוב תולעי שורש. ולחדש אותו כאשר האספקה אוזלת או שהתזונה מתייבשת. כמו כן, שמור מאגר מים של 300 מיליליטר, מכוסה בצמר גפן, בכל כלוב שישמש כמקור מים.

החלף את המים כשנגמרים. שמרו על תולעת השורש הכלואה ב-26 מעלות צלזיוס עם 60% לחות ומחזור אור של 14/10 באינקובטור לגידול חרקים. כוונו את שעת כיבוי האורות מאוחר יותר ביום, למשל בחצות, כך שהביצים יוטלו לפני שעות העבודה בבוקר.

ראשית, אסוף את העוברים. למשטח איסוף ביצים, טען צלחת פטרי 100 מילימטר עם 30 מיליליטר של 1% אגר ומים. לאחר מכן, הניחו שכבה אחת של נייר פילטר על האגר, ואחריה ארבע שכבות של בד גבינה.

יש לחתוך כל שכבה לגודל. לאחר מכן, מאוחר ככל האפשר, הכניסו את צלחת איסוף הביצים לכלוב תולעי השורש וכסו אותה באוהל נייר כסף. ואז למחרת בבוקר, הסר את תא איסוף הביציות.

השתמש במלקחיים כדי להרים שכבה אחת של בד גבינה בכל פעם ולהניח בכוס של 500 מיליליטר עמוסה במים. שוטפים את הביצים מבד הגבינה על ידי ערבוב במים. לאחר מכן, השתמש בצינור נורה כדי להעביר את הביצים לכוס מים אחרת כשלב שטיפה.

בצע שתיים או שלוש כביסות באופן זה. לאחר מכן, הפקידו את הביצים הנקיות על נייר סינון עם כמה שפחות מים. לאחר מכן, הכן שקופית על ידי הדבקת פיסת נייר סינון שחור שטוח על השקופית כדי לשפר את הניגודיות.

לאחר מכן טפטפו קווים עדינים של דבק לא רעיל על הנייר שישמש לאבטחת הביצים. שמור את הדבק מתחת להיקף הביצה. בזמן שהדבק רטוב, השתמש במברשת דקה כדי להניח את הביצים על קו הדבק.

שמרו על מרחק של ביצה אחת לפחות בין כל ביצה. הכן מספר שורות ביצים לכל שקופית. כעת יש להזריק את הביצים תוך 30 דקות.

כעת, שלב את הפלסמיד העוזר, הפלסמיד התורם והמאגר האדום של פנול. השתמש בפלסמידים איכותיים וסופר מפותלים המיוצרים עם ערכה מסחרית נטולת אנדוטוקסין. פורטקס לזמן קצר לערבב.

ואז מסובבים חלקיקים למשך שלוש דקות במהירות מרבית. לאחר מכן, מילוי חוזר משך מחטי זכוכית בורוסיליקט עם 0.5 עד 1 מיקרוליטר של תמיסת הזרקה. אם נוצרות בועות כלשהן, הקפד להסיר אותן.

לאחר מכן, חבר את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור. כעת, במידת הצורך, תחת המיקרוסקופ, שברו בעדינות את קצה המחט האטום באמצעות זוג מלקחיים עדינים או על ידי נגיעה עדינה בקצה לתוך מחסום זכוכית. נסה ליצור את הפתח הקטן ביותר האפשרי המשחרר תמיסת הזרקה.

לפני הזרקת ביצי תולעי השורש, השתמש במברשת דקה כדי להרטיב בזהירות את פני השטח של ביצה אחת עד שלוש מוכנות במים סטריליים. לאחר מכן, הזריק את העוברים הרטובים. הכנס בעדינות את המחט לאמצע העובר, והזריק נפח קטן של תמיסה.

התחל בשימוש בלחץ של 10 עד 13 psi והתאם את הלחץ לפי הצורך. לעוברים יבשים יש צורה עגולה מובהקת, על ידי הרטבה מוקדמת של כל עובר במים ישנה את צורתו וירכך את קליפת הביצה ובכך יאפשר למחט לחדור בקלות. לעובר שהוזרק בהצלחה תהיה כמות קטנה של צבע אדום.

אם ביצה נפגעה, נראית מוזרה או שלא ניתן להזריק אותה, מועכים אותה או מסירים אותה מהשקופית. לאחר הזרקת כל הביצים, העבירו את נייר הסינון עם הביצים עליו לכלי אגר של 1%. לאחר מכן, אוטמים את המנה בניילון פרפין ודוגרים אותה בחום של 26 מעלות צלזיוס עד לבקיעת הזחלים.

12 יום לאחר ההזרקה, התחל לבדוק אם יש זחלים מדי יום במשך השבועיים הבאים. מעבירים את הזחלים בעזרת מברשת דקה לקופסת גידול עם תירס מונבט ואדמה כדי לגדל אותם בתנאים סטנדרטיים. טרנספורמציה של קו הנבט של תולעת שורש נוסתה על ידי הזרקה משותפת של פלסמיד הנושא טרנספוזאז עם טרנספוזון הנושא פלסמיד לעוברים טרום-תאיים.

ב-26 הניצולים, כל ביטוי EFP שימש לסינון החדרת אלמנט תורם. למרות שזוהו צאצאים של תולעי שורש, בדיקת עוברי תולעי שורש עם מקור האור העז הוכחה כקטלנית. הסיבוב הבא של טרנספורמציה של קו הנבט השתמש בגן חלבון פלואורסצנטי אדום המונע על ידי מקדם פעיל מכונן מ-Drosophila melanogaster.

שיעורי ההישרדות השתפרו, אך רק זחל אחד של DS אדום חיובי נרשם. לאחר מכן, העוברים הוזרקו במיקרו עם בופר לבד או עם פלסמידים של DNA תורם מסייע ומסומן ביסודיות. יחס דומה של עוברים בקעו כאשר הזריקו להם פלסמידים או בופר בלבד.

ומעניין שרק כמחצית מהעוברים שלא הוזרקו בקעו. זה העלה את הקטלניות של מניפולציה של העוברים לזריקה לגבוהה כמו ביצוע ההזרקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להזריק מיקרו עוברי שורש תירס מערבי.

לאחר השליטה ניתן להזריק 200 עד 300 עוברים בשעה בטכניקה זו. שיטה זו חייבת לטכניקות שפותחו לשינוי קו הנבט של Drosophila melanogaster המשמשות כתבניות החלות על מינים רבים אחרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנום של Western Corn Rootwall.

על מנת לענות על שאלות ספציפיות על תפקוד הגנום.