השימוש בג'ל מימדי Agarose דטרגנט למחצה denaturing שני לאשר גודל הטרוגניות של סיבי עמילואיד או עמילואיד דמוי
26 באפריל 2018
כאן נשתמש agarose למחצה denaturing דו-ממדית בג'ל כדי לאשר הנוכחות של סיבי עמילואיד כמו גודל הטרוגניות או לא לכלול את האפשרות הטרוגניות גודל נובע דיסוציאציה של סיבי עמילואיד במהלך הג'ל התהליך פועל.
המטרה הכוללת של אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז דו-ממדי זה היא לאשר הטרוגניות בגודל של סיבים דמויי עמילואיד או דמויי עמילואיד שנראו במהלך SDD-AGE מסורתי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי צבירת העמילואיד או החלבון, כגון האם הטרוגניות בגודל הנראית במהלך SDD-AGE מסורתי היא המצב המקורי של הסיבים in vivo או תוצאה של פירוק חלבון או דיסוציאציה במהלך אלקטרופורזה של ג'ל. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותה בקלות במעבדה ללא ציוד מיוחד.
אין צורך בציוד נוסף מעבר למה שמשמש ב-SDD-AGE המסורתי. ראשית, זרעו את תאי סרטן המעי הגס HT-29 המייצרים עמילואיד בצלחת תרבית רקמה בגודל 10 סנטימטרים. לאחר מכן, דגרו על התאים למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, השתמש במי מלח עם חוצץ פוספט כדי לשטוף את התאים. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר טריפסין לתאים, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר שהתאים התנתקו מצלחת התרבות, הוסיפו לצלחת 10 מיליליטר מדיום תרבית.
לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא ב -1, 000 פעמים גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את המדיום והשעו מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר של מדיום תרבית.
ספור את התאים באמצעות מונה תאים. לאחר מכן, השאירו שתי צלחות תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, הוסף ריאגנטים TSZ לאחת ממנות התרבות כטיפול.
לאחר כשש שעות קוצרים את התאים באמצעות מגרד פלסטיק. לאחר מכן, העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה ב -1, 000 פעמים גרם למשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את כדור התא פעמיים עם 10 מיליליטר של מי מלח עם פוספט קר כקרח, וחזרו על תהליך הצנטריפוגה.
לאחר מכן, שאפו את תמיסת ה-PBS, והעבירו את גלולת התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 0.3 מיליליטר של מאגר ליזה לכדור התא, ודגירה על קרח למשך 30 דקות. שוב, צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
הסופרנטנט המתקבל הוא ליזאט התא כולו. לסופרנטנט, הוסף מאגר 4X SDD-AGE להכנת 20 מיקרוליטר של שלושה מיקרוגרם למיקרוליטר דגימה. דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
להכנת הג'ל מוסיפים שני גרם אבקת אגרוז ל -200 מיליליטר מאגר TAE בכוס זכוכית. לאחר מכן, מחממים את הכוס במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של 20% SDS לריכוז סופי של 0.1%סובב בעדינות את הכוס.
לאחר מכן, שפכו את האגרוז הנוזלי על לוח ג'ל בגודל 15 על 14 סנטימטר. כדי להסיר בועות אוויר, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, הניחו מסרק של 20 באר על גבי הג'ל.
לאחר מכן, הוסף כ-60 מיקרוגרם של ליזאט תא שלם בנתיב הימני הקיצוני של הג'ל. הפעל את הג'ל ב-60 וולט למשך כארבע שעות באמצעות מאגר TAE המכיל 0.1% SDS כמאגר הפועל. כדי להפעיל את הג'ל בממד השני, סובב בזהירות את הג'ל ב-90 מעלות נגד כיוון השעון.
לאחר מכן, הפעל את הג'ל ב 60 וולט למשך כארבע שעות. במיכל של 20 על 20 סנטימטר, הוסף 500 מיליליטר של מאגר העברה. ממש ליד המיכל, הכינו ערימה של מגבות נייר בגובה חמישה סנטימטרים.
לאחר מכן, השרו שני ניירות סינון, כל אחד במידות 14 על 15 סנטימטרים, במאגר העברה, והניחו על גבי ערימת מגבות הנייר. הפעל קרום PVDF בגודל 14 על 15 ס"מ במתנול למשך 30 שניות. לאחר ההפעלה, הנח את הממברנה על גבי ניירות הסינון, והשתמש ברולר כדי להסיר את כל הבועות.
החלק החשוב ביותר בהעברה הוא לוודא שלא נוצרות בועות אוויר בין הג'ל לממברנה. שוטפים את הג'ל עם מאגר העברה, ומניחים אותו על גבי הממברנה. מרדדים את כל הבועות שנוצרו.
לאחר מכן, השתמש בניילון נצמד כדי לכסות את קצה מגבות הנייר הקרובות ביותר למיכל מאגר ההעברה. לאחר מכן, השרו פיסת נייר סינון במידות 15 על 35 סנטימטר במאגר ההעברה. הנח את נייר הסינון כך שקצה אחד יכסה את החלק העליון של הג'ל והקצה השני נמצא במיכל מאגר ההעברה.
מכסים את המיכל בניילון נצמד ומשאירים למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת יש לשטוף את הממברנה עם 50 מיליליטר PBST במיכל בגודל 20 על 20 סנטימטר. לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר חלב 5% ב- PBST על הממברנה.
לאחר מכן, השאירו את הממברנה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לחסימה. פיפטה 10 מיקרוליטר של נוגדן ארנב נגד MLKL לתוך 20 מיליליטר של 5% חלב ב-PBST. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת הנוגדנים על הממברנה.
דגרו את הממברנה על נדנדה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את הממברנה עם 20 מיליליטר PBST למשך חמש דקות. שטיפה זו חוזרת על עצמה חמש פעמים.
לאחר מכן, פיפטה ארבעה מיקרוליטרים של נוגדן נגד ארנב-HRP ל-20 מיליליטר של 5% חלב ב-PBST. הוסף את הנוגדן על הממברנה. השאירו את המיכל עם הממברנה על הנדנדה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
לאחר שעתיים יש לשטוף את הממברנה חמש פעמים ב -20 מיליליטר PBST למשך חמש דקות כל אחת. לבסוף, הוסף מצע כימילומינסנציה משופר על הממברנה. לאחר מכן, חשוף את הממברנה לסרט רנטגן בהתאם להוראות היצרן.
מחקר זה נעשה כדי להדגים את נוכחותם של סיבים דמויי עמילואיד עמידים ל-SDS בליזטים של תאים שלמים המתקבלים מתאים שטופלו בגורם נמק גידול. זה מראה כאן ש-RIPK1 ו-RIPK3 מראים דפוסים זהים דמויי עמילואיד דומים. מעניין שסיבי MLKL נראים הטרוגניים עם דפוס נדידה שונה מהאחרים.
תמונה זו מציגה את דפוס הנדידה האפשרי של סיבים עמילואידים או דמויי עמילואיד. בממד הראשון SDD-AGE, סיבים עמילואידים או דמויי עמילואיד מציגים מריחה אופיינית. בתמונה זו, הסיבים נודדים באופן זהה בריצה השנייה ומציגים דפוס אלכסוני של נדידה על הממברנה ב-45 מעלות.
זה מראה שהסיבים אינם עוברים פירוק או דיסוציאציה במהלך תהליך ריצת הג'ל. נהפוך הוא, אם הסיבים אכן מתנתקים, יש פסים אנכיים מתחת לקו האלכסוני, מה שמעיד על נדידה מהירה יותר של הסיבים הקטנים יותר במהלך האלקטרופורזה השנייה. הן הממד הראשון והן הממד השני של SDD-AGE מראים כי סיבי ה-MLKL אינם מתנתקים במהלך תהליך ה-SDD-AGE ואכן נבדלים מסיבי RIPK1 ו-RIPK3.
בתמונה זו, סיבי MLKL מראים מריחה אופיינית במהלך הממד הראשון. עם זאת, אותם סיבים מראים קו אלכסוני חד ללא פסים אנכיים בממד השני SDD-AGE. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור שכל התנאים, כגון מתח ואורך הריצה, נשארים זהים בין הממד הראשון לשני כדי להבטיח קו חד בזווית של 45 מעלות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הפשטת הממברנה ובדיקה חוזרת עם נוגדנים אחרים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אם הסיב מכיל חלבונים אחרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לאשר כי לא מתרחשת פירוק או דיסוציאציה של סיבים עמילואידים או דמויי עמילואיד במהלך SDD-AGE מסורתי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עושה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל אגרוז דו-ממדי חצי-דנטורבי (two-dimensional semi-denaturing agarose gel electrophoresis) כדי לבחון את השונות בגודל של סיבים דמויי עמילואיד. מטרת השיטה היא לקבוע האם הווריאציות הנצפות בגודל הן תכונה מובנית של הסיבים או תוצאה של דיסוסיאציה במהלך תהליך האלקטרופורזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- אגרגציה של חלבונים
רקע
- סיבים דמויי עמילואיד קשורים למחלות נוירודגנרטיביות שונות.
- הבנת גודלם ויציבותם חיונית להבהרת תפקידם במנגנוני המחלה.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לשקף במדויק את המצב הטבעי של סיבים אלו.
- הטרוגניות בגודל עלולה לסבך את פרשנות התוצאות הניסיוניות.
מטרת המחקר
- לאישור נוכחותם של סיבים דמויי עמילואיד בגדלים שונים.
- לקביעה האם ההטרוגניות בגודל נובעת ממאפיינים טבעיים או מארטפקטים ניסיוניים.
- לספק שיטה מהימנה לחקר סיבי עמילואיד במעבדה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוזה בחצי-דנטורציה.
- זריעה של תאי סרטן מעי HT-29 המייצרים עמילואיד.
- דגירה של תאים ב-37 °C עם 5% carbon dioxide.
- ניתוח תוצאות הג'ל להערכת גודל ויציבות הסיבים.
תוצאות עיקריות
- אישור של הטרוגניות בגודל של סיבים דמויי עמילואיד.
- שלילת הדיסוציאציה כגורם לווריאציות המהודות בגודל.
- תיקוף של השיטה כגישה מהימנה לחקר סיבי עמילואיד.
- תובנות לגבי המצב הטבעי של סיבי עמילואיד in vivo.
מסקנות
- אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז דו-ממדיית חצי-דנטורית יעילה לחקר סיבים דמויי עמילואיד.
- הטרוגניות בגודל היא מאפיין של הסיבים ולא תוצר לוואי של השיטה.
- טכניקה זו יכולה לקדם את המחקר בתחומי העמילואיד ואגרגציה של חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אישור המצב הטבעי של סיבים דמויי עמילואיד הוא קריטי לתיקוף המטרה במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות, שבהן חלבונים הנוטים לאגרגציה מהווים מטרות בעלות ערך גבוה אך בעלות סיכון גבוה. שיטת SDD-AGE דו-ממדית זו מספקת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין הטרוגניות אמיתית של סיבים לבין ארטיפקטים שנגרמו כתוצאה מהאלקטרופורזה, ובכך מעלה את הביטחון החזוי במבחני מעורבות המטרה. על ידי אפשור הערכה איכותית וישירה של יציבות הסיבים בליזאטים של תאים ללא צורך בטיהור, הגישה תומכת בתהליכי גילוי מוקדמים ומפחיתה את ההסתמכות על טכניקות ייעודיות בעלות תפוקה נמוכה, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי אימות השאלה האם התפלגויות גודל הסיבים שנצפו משקפות מבני עמילואיד טבעיים in vivo.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות תפקודיות ללא צורך בטיהור חלבונים, ובכך מאיץ את לוחות הזמנים של שלב ה-hit-to-lead בתוכניות העוסקות במטרות הנוטות לאגרגציה.
- ביטחון ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות הפחתת סיכונים במטרות שהתנהגות האגרגציה שלהן עלולה להיות מפרשת באופן שגוי עקב ארטיפקטים מתודולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקה המשך, על ידי אישור שלמות הסיבים בתנאים דנטורטיים.
- פלט כמותי: יצירת נתוני דפוסי נדידה שניתן להקרין אותם לשינויים ביציבות או בגודל הסיב המושרים על ידי תרכובות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניצול תשתית SDD-AGE קיימת, ללא צורך בציוד מיוחד מעבר לכלי אלקטרופורזה של ג'ל ובלוטינג סטנדרטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: רלוונטי למסלולים הקשורים לאמילואיד באונקולוגיה ובניוון עצבי, שבהם השונות של הסיבים עשויה להשפיע על האיתות או על הרעילות.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ממצאים in vitro לאישור במצב טבעי, ובכך תומך בהלימה של סמנים ביולוגיים במודלים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר האם השונות בסיבים נובעת ממורכבות ביולוגית או מארטיפקט ניסויי, ובכך מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי החל מאימות המטרה ועד לזיהוי מוביל, במיוחד עבור תוכניות המתמקדות במסלולי אגרגציה של חלבונים שבהם יציבות הסיבים משפיעה על מנגנון הפעולה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי הבחנה בין הטרוגניות של סיבים טבעיים לבין ארטיפקטים של דיסוציאציה במהלך אנליזה אלקטרופורטית.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות על ידי אישור שתבניות הסיבים שנצפו הן ניתנות לשחזור ואינן נובעות מדיסוציאציה מושרית ג'ל.
- אנליטיקה: מספקת פלטי מיגראציה איכותיים (למשל, תבניות של פסי גרירה אלכסוניים) המסייעים להשוות את יציבות הסיבים בין תנאים שונים או הפרעות גנטיות.
- מחקר תרגומי: מקשרת פנוטיפים של אגרגציה מבוססי תאים לאימות המצב הטבעי, ובכך מסייעת בקידום מותאם סיכונים במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה בעלת יכולת שימוש חוזר עבור מספר מטרות הנוטות לאמילואיד, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי אישור לכך שהטרוגניות גודל הסיבים היא בעלת משמעות ביולוגית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה בין מעבדות על ידי ביטול מקור מרכזי לשונות בניתוח סיבים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי הפחתת הובלות שגויות הנובעות מארטיפקטים מתודולוגיים במבחני אגרגציה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, המבוסס על נתונים מהימנים של יציבות סיבים.
שיקולים ביישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של חלבונים ובטכניקות של אלקטרופורזה של ג'ל.
- תלוי בציוד אלקטרופורזה סטנדרטי, agarose, SDS, באפר TAE וחומרי blotting.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של המתח, זמן ההרצה והטיפול בג'ל כדי להבטיח דפוסי נדידה אלכסוניים הניתנים לשחזור.
- התאמה למקבצי חלבון שאינם amyloid עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הליזיס והאלקטרופורזה.
- מוגבל להערכה איכותנית; אינו מחליף שיטות מדידה כמותיות כאשר נדרשת קביעה מדויקת של המסה.
