Name: גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד שיטת מוטגנזה אקראית מכוונת לזיהוי מוטציות המפריעות ליציבות הטרוכרומטין בשמרים ביקוע. טכניקה זו מאפשרת מחקר גנים חיוניים ומנגנוני ויסות תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תמיכה עבור פרויקט זה במימון סופק על-ידי התוכנית מחקר מדעי בסיסי דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע ICT (2016R1A2B2006354).

1. הכנת מדיה
<ol><li>להכין תמצית שמרים עם תוספי מזון (כן), כן ללא אדנין (כן נמוך אייד), בינוני הביקוע גלוטמט (PMG12), וכן PMG ללא אדנין (PMG-אייד) על ידי ערבוב המרכיבים כפי שמתואר בטבלה 1. כן-אייד (איד נמוכה) ו לוחות PMG איד יש את כל המרכיבים אותו, אבל אדנין מושמט מן האחרון.<ol>
<li>השתמש המניה מלח (50 x) הבאות: 52.5 g/L MgCl2·6H2O 2 g/L CaCl2·2H2O, 50 גרם/ליטר אשלגן כלורי, 2 g/L נה2כך4 ב מים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>השתמש ויטמין הבאים (1, 000 x) מניות: 1 g/L pantothenate 10 גרם/ליטר nicotinic חומצה, אינוסיטול 10 גרם/ליטר, ביוטין 10 mg/L במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C.</li>
		<li>השתמש המינרל הבאים (10, 000 x) מניות: חומצה בורית 5 g/L, MnSO 4 g/L4,4·7H ZnSO 4 g/L2O, 2 g/L FeCl2·4H2O, MoO 0.4 g/L3, 1 g/L קי, 0.4 g/L CuSO4·5H2O , 10 גרם/ליטר חומצת לימון במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר ולאחסן ב 4 º C. הערה: בינוני נוזלי כן יכולה להיעשות על-ידי השמטת את אגר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אוטוקלב המדיום לקרר אותו אל מתחת 60 ° C תוך כדי ערבוב עם בר stir, בקצב של 200 סל ד.</li>
	<li>עבור לוחות כן + G418 (geneticin), להוסיף 1 מ"ל/L G418 פתרון מניות המדיום. כן.<ol>
<li>להשתמש את G418 הבאים (1, 000 x) מניות: 100 מ"ג/מ"ל G418 במים מזוקקים. מסנן לחטא באמצעות מסנן גודל הנקבוביות 0.22-מיקרומטר, aliquot 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, חנות ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מערבבים עוד 5-10 דקות, aliquot התקשורת 90-מ מ פטרי (1 ליטר של aliquots בינוני עד בערך 40 פטרי. חנות את הלוחיות ב 4 º C.</li>
</ol>2. שיבוט של rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs
<ol><li>לבצע PCR עם תחל p1 ו- p2 (איור 1 א') באמצעות ביקוע שמרים הדנ א (gDNA) כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), ולאחר החלת את מחזורי התגובה המתוארות בטבלה 2 כדי להגביר 3,315-בסיס פרגמנט זוג (bp) הכוללת rpt4 + ו שלה 5' / 3' UTRs. לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות של ערכת טיהור13 לפי הוראות היצרן (איור 1 א').</li>
	<li>לעכל את וקטור KS(-) pBlueScript14 ו את מקטע ה-DNA מוגבר המכיל rpt4 + עם שלה 5' / 3' UTRs עם BamH1 ו Xho1 ב הנפח הכולל של 20 µL (DNA ~ 1 µg, אנזים U 20, 1 x עיכול מאגר) ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים במשך 16-18 h (איור 1B).</li>
	<li>ג'ל לטהר את הווקטור מעוכל (1.2% agarose ג'ל) והכנס את הדנ א על ידי ביצוע מבוסס-טה agarose בג'ל (100 וולט, 1 h), excising הלהקות הדנ א של גודל הרצוי לבודד את ה-DNA עם ערכת חילוץ ג'ל15.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את וקטור והוספה הדנ א באמצעות T4 DNA ליגאז על-ידי ביצוע תגובה מצדו 20-µL המכיל 50-100 ננוגרם של וקטור ה-DNA, ~ 3-fold טוחנת עודף של ה-DNA של הוספה, 400 U T4 DNA ליגאז 1 x מאגר מצדו. דגירה תערובת זו ב 18 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h.</li>
	<li>להפוך את ה-DNA מחוברים µL 100 של e. coli DH5α על-ידי החלת הלם חום עבור 70 s-42 ° C. להוסיף 1 מ"ל של ליברות, תקופת דגירה של h 1 ב 37 מעלות צלזיוס להתאוששות. לבצע צנטריפוגה (13,800 x g), למחוק את הצלחת supernatant, כל טרנספורמציה e. coli תאים על צלחות LB-אמפיצילין (LA), של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות.</li>
	<li>לבחור 4-8 מושבות עם קיסמים ולגדול בן לילה ב 37 ° C 3 מ ל LA בינוני.</li>
	<li>לבודד את פלסמידים עם פלסמיד טיהור ערכת16 בשימוש על פי הפרוטוקול של היצרן ולבצע digestions אנליטית אנזים הגבלה עם 5 µL של פלסמיד מבודד, 5 U של כל אנזים הגבלה (BamH1 , Xho1) ו- 1 x מאגר ההגבלה. דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים עבור 3 ח' אשר השיבוט על-ידי קביעת רצף המועמד פלסמידים.</li>
</ol>3. החדרת מוטציה שקטה (Xho1 הגבלת האתר)
<ol><li>עיצוב זוג תחל 33-bp (p3 ו- p4) המכילים את השינוי הרצוי ברצף אחרת משלימים.</li>
	<li>לבצע PCR עם אמינות גבוהה פולימראז17 (איור 1C) בהנפח הכולל של 25 µL (10 ng של פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר) באמצעות אופניים הפרמטרים המפורטים בטבלה3.</li>
	<li>לעכל את פלסמיד תבנית עם Dpnאני בהנפח הכולל של µL 20 (20 U אנזים, 1 x עיכול מאגר) ב- 37 מעלות צלזיוס ב מים אמבט 1 h.</li>
	<li>לשנות, להפיץ, לבודד, רצף של פלסמיד המכיל את מוטציה שקטה, כמתואר בצעדים 2.5-2.7. הערה: מוטציה שקטה יכולה גם הציג באמצעות שיטת השיבוט המאפשר חיבור שברי DNA מרובים התגובה יחיד18.</li>
</ol>4. אקראי מוטגנזה מכוונת של rpt4 + מאת PCR לשגיאות
<ol><li>לבצע PCR לשגיאות, באמצעות פלסמיד את המוטציה שקט (אתרXho1 ) התבנית, תחל p5 ו- p6, הנפח הכולל של 50 µL (כמות תבנית מוגדרת בשלב 4.1.1, 2 µL 10 pmol פריימר מיקס, אנזים U 2.5, מאגר התגובה x 1) , ואת פולימראז מיוחד אשר נועד ליצור שגיאת גבוה שיעור19 (איור 1D). לבצע PCR כפי שמתואר בטבלה 2.<ol>
<li>השתמש µg 4-5 של תבנית פלסמיד לשלוט תדירות מוטציה ל bp 1/kb (kilobase). הערה: ריכוז גבוה (> 500 ng/µL) של פלסמיד, אשר ניתן לקבל באמצעות ערכת הכנה מיני20, נדרש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשתמש בג'ל כדי לאשר מוצר ה-PCR של 2670 bp (1.2% agarose ג'ל). ג'ל לטהר המוצר PCR כפי שמתואר בשלב 2.5.</li>
</ol>5. הכנה של פיוז'ן PCR קטעים (קאן, 3' UTR)
<ol><li>לבצע PCR באמצעות pFA6a-KANMX621 תבנית, תחל p7 ו p8, התנאים המפורטים בטבלה 4 כדי לקבל השבר סמן (קאן). ג'ל לטהר השבר 1,480-bp וכתוצאה מכך כפי שמתואר בשלב 2.5 (איור 1E).<ol>
<li>בדוק אם stop codon של הגן שמיועד מוטציה ובאזור קידוד של גנים סמוכים שלה מופרדים על-ידי יותר מ-500 bp. לא ניתן להשתמש המחסל אנדוגני כאשר אזור זה הוא פחות מ 500 bp; במקום זאת, המחסל ADH אמור לשמש במקום המחסל אנדוגני. השינויים פרוטוקול נדרש להשתמש המחסל ADH מוצגים בטבלה 5. הערה: שינויים אלה חל רק כאשר המחסל ADH , אשר זמין פלסמיד pFA6a-3HA-KANMX6, משמש במקום המחסל אנדוגני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע PCR עם משובטים rpt4 +-שמכיל וקטור p9 תבנית ואת צבעי בסיס, p10 ב הנפח הכולל של 50 µL (20 ng את פלסמיד משובטים, 2 µL pmol פריימר מיקס 10, אנזים U 2, 1 x תגובת מאגר), להשתמש בתנאים המוצגים טבלה 6. ג'ל לטהר שהושג 506-bp 3' UTR השבר (איור 1E).</li>
</ol>6. דור של הבונה השינוי על ידי היתוך PCR (איור 1E)
<ol><li>להכין את השברים 3 (mutagenized rpt4 +קאן, את 3' UTR) ב- 50 ng/µL.</li>
	<li>לבצע היתוך ש-PCR של השלושה קטעים באמצעות תחל p11 ו- p12, כפי שמתואר בטבלה 7. (הפרוטוקול עבור פיוז'ן PCR הוא שינוי של הפרוטוקול המקורי22). לטהר המוצר העיקרי של ה-PCR 4,398-bp.<ol>
<li>השתמש rpt4 +: KAN:3'UTR קטעים ביחס של 1:3:1 לקבלת תוצאות אופטימליות. הערה: הסכום הכולל של ה-DNA הוספה לא יעלה על 500 ng. הכמות המומלצת של rpt4 +: KAN:3'UTR הוא 50 ng:150 ng:50 ng. האזור mutagenized הוא כ- 1.6 קילו, אז המספר המינימלי של מושבות שמרים זה היה חשבון על כל השילובים האפשריים של כל בסיס להיות מוטציה לשלושה האחרים הוא 1,600 x 3 = 4,800 מושבות. כי התגובה טרנספורמציה אחת מניבה בדרך כלל המושבות 400-500, התגובות לפחות 10 שווה של פיוז'ן PCR לבנות נדרשת. צורך זה יכולים להתקיים על ידי פשוט הגדלת הסכום התגובה (קרי, מספר המבחנות) לפי פקטור של 10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. שינוי של שמרים ביקוע על ידי אלקטרופורציה (איור 1F)
<ol><li>לחסן שמרים עד 10 מ"ל של כן בינוניים עד רוויה מאת המקננת זה עבור יותר מ 16 h.</li>
	<li>לדלל לתאים צפיפות אופטית על 600 nm (OD600) של 0.2 ב 200 מ ל כן בינוני דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ברעידות עבור h 5-6, כדי OD600 = 0.6 - 0.8.</li>
	<li>להתרכז לתאים OD600 = 30, לוותר על ארבעה צינורות חרוט 50-mL ולהירגע על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>לקצור את התאים על ידי ביצוע צנטריפוגה ב 1,050 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינורות, אלקטרו 10-וואקום על קרח. בצע את השלבים 7.3-7.8 על קרח.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע והוסף 15 מ"ל של 1.2 מ' בסורביטול. ללחוץ בעדינות את הצינורות כדי resuspend את התאים.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב- g x 1050 עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חזור על שלבים 7.4 ו- 7.5. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף 500 µL של 1.2 מ' בסורביטול כל שפופרת, resuspend את התאים, וכן לאסוף את כל התאים אחד צינור חרוטי 15-ml.</li>
	<li>להוסיף בסורביטול 1.2 מ' עד 2.4 מ ל (OD600 = 10 0.2 מ"ל). שמור את הצינורית על קרח.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של תאים בסורביטול-הושעתה (ודא שהם מושעים באופן מלא) צניעותו EP המכיל הפיוז'ן PCR לבנות, מערבבים היטב, להעביר את הדגימה אלקטרו-cuvette.</li>
	<li>Electroporate התאים עם האפשרויות הבאות: פטריות, ShS (2.00kV, הדופק 1).</li>
	<li>להוסיף µL 600 של 1.2 מ' בסורביטול כל אלקטרו-cuvette עבור הנפח הכולל של 800 µL, ופרש לאחר מכן התאים על כן ארבעה לוחות (µL 200/צלחת). אלקטרו עשר-וואקום אחלק ל-40 כן צלחות.</li>
	<li>דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לבצע ציפוי משוכפל כדי כן + G418, דגירה הלוחות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.</li>
</ol>8. מבחר של יציב הטרוכרומטין מוטציות, בדיקת תוצאות חיוביות שגויות
<ol><li>על כל צלחת כן + G418, לבצע ציפוי משוכפל כן-אייד (איד נמוך), צלחות PMG-אייד (לא אייד). תקופת דגירה הלוחות עותק משוכפל של 1-2 ימים ב- 30 מעלות צלזיוס, עד הופעה כלשהי של המושבות על לוחות כן-אייד צבע אדום (איור 1 ג'י).</li>
	<li>להשוות לוחות כן-אייד ואייד PMG ותאים בחר להראות ורוד או לבן על הצלחת. איד. כן, גם לגדול על הצלחת PMG-אייד. אל תבחר מושבות ללא גידול על PMG-אייד, כפי שהם תוצאות חיוביות שגויות (למשל, המשקף הקלטת קאן משולב באתר-יעד בחלקים אחרים של הגנום).</li>
	<li>לאסוף כ עונה 1 פרק 105 תאים מהמושבה לכל, דגירה ב 10 µL של SPZ, לאודנום zymolyase 2.5 mg/mL 100 T ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות שימוש 1 µL של פתרון זה לבצע כתבנית המוצא המושבה PCR (איור 1 H).<ol>
<li>להפוך SPZ (50 מ"ל) על ידי ערבוב 30 מ של 2 מ' בסורביטול, 4.05 מ של 1 מ ' נה2HPO4, mL 0.95 NaH2PO4 ו-15 מיליליטר מים מזוקקים (pH הסופי, 7.5). (5 מ"ל) יכול להיות בתוספת zymolyase ודוגמאות המאוחסן ב- 500-µL aliquots ב-20 ° C עד השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע בג'ל (1.2% agarose ג'ל, 180V, 20 דקות) כדי להמחיש את התוצאות של + המושבה ה-PCR. בחר תגובות תערוכת ה-PCR להקות של גודל תקין ולעכל 5 µL של כל מוצר התגובה עם Xhoאני (4 U אנזים 1 x עיכול מאגר, תנורים 37 ° C, 1 h) לסנן תוצאות חיוביות שגויות (איור 1 H).</li>
	<li>לבצע בג'ל להמחיש את מעכל XhoI (1.2% Agarose ג'ל, 180 V, 20 דקות). סמן את המושבות שמוצריהן PCR נחתכים על ידי XhoI, לרפא אותם ללוחות כן + G418 (איור 1I).</li>
	<li>לבודד gDNA מתאי שמרים ביקוע ולבצע רצף של מוצרי ה-PCR23. להשוות את הרצף שהושג עם הרצף פראי-סוג כדי לזהות מוטציות (איור 1I).</li>
	<li>ישירות מחדש מציגים את mutation(s) פראי-סוג תאים על-ידי הפיכתם עם בונה פיוז'ן מוגבר על ידי ה-PCR של תאים מוטציה23. כדי לאשר את פנוטיפ בתאים מוטציה עשה לאחרונה (איור 1J) לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט הבחינה.<ol>
<li>פיוז'ן שינוי המבנה יכול להיות בקלות מוגבר על ידי PCR עם תחל p1, p10 באמצעות ה-DNA גנומי של מוטציות כמו התבנית הנפח הכולל של 50 µL (~ 1 µg ה-DNA, האנזים U 20, 1 x תגובת מאגר), וליישם את מחזורי התגובה המתוארים בטבלה 2 . טרנספורמציה של הבונה יכול להיעשות על-ידי ביצוע השלבים הבאים 7.1-7.13.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+model+of+error-prone+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">A general model of error-prone PCR.</a> J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+analysis+of+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).</li>
<li>Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+evolution+of+novel+traits+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid evolution of novel traits in microorganisms.</a> Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).</li>
<li>Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+shuffling+works%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How DNA shuffling works.</a> Science. 293 (5528), 237(2001).</li>
<li>Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+26S+Proteasome+subunit+RPT4a+regulates+ToLCNDV+transcription+and+activates+hypersensitive+response+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato.</a> Sci Rep. 6, 27078(2016).</li>
<li>Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sug1+modulates+yeast+transcription+activation+by+Cdc68%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68.</a> Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).</li>
<li>Bhat, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+ATPase+Sug1+plays+a+critical+role+in+regulating+MHC+class+II+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription.</a> Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).</li>
<li>Chang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Gal4+activation+domain+binds+Sug2+protein%2C+a+proteasome+component%2C+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro.</a> J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).</li>
<li>Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+yeast+mutants+that+alleviate+transcriptional+silencing+in+centromeric+flanking+repeats+and+disrupt+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation.</a> Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).</li>
<li>Grewal, S. I., Jia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin revisited.</a> Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForsburg%2C+SL+%22Forsburg+Lab+Recipes%3A+Fission+Yeast+Media%22">Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html">http://www-bcf.usc.edu/~forsburg/media.html</a> (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+PCR+Purification+Kit%22">QIAquick PCR Purification Kit</a>. , Qiagem. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-pcr-purification-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22pBlueScript+II+Vector%22">pBlueScript II Vector</a>. , Aglint. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&">http://www.genomics.agilent.com/en/Cloning-Vectors/pBlueScript-II-Vectors/?cid=AG-PT-115&</a> (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QIAquick+Gel+Extraction+Kit%22">QIAquick Gel Extraction Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation">https://www.qiagen.com/kr/shop/sample-technologies/dna/dna-clean-up/qiaquick-gel-extraction-kit/#orderinginformation</a> (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22QuickGene+SP+Kit+Plasmid+Kit+II+%28SP-PL2%29%22">QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2)</a>. , Wako Chemicals GmbH. Fuggerstraße 12 41468 Neuss, Germany. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2">https://www.wako-chemicals.de/en/product/quickgene-sp-kit-plasmid-kit-ii-sp-pl2</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PfuUltra+High-fidelity+DNA+Polymerase%22">PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase</a>. , Aglient. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136">http://www.genomics.agilent.com/en/High-Fidelity-PCR-Enzymes/PfuUltra-II-Fusion-HS-DNA-Polymerase/?cid=AG-PT-136</a> (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gibson+Assembly+Master+Mix%22">Gibson Assembly Master Mix</a>. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information">https://www.neb.com/products/e2611-gibson-assembly-master-mix#Product%20Information</a> (2017).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22GeneMorph+II+Random+Mutagenesis+Kits%22">GeneMorph II Random Mutagenesis Kits</a>. , Agilent. Santa Clara, CA. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057">http://www.genomics.agilent.com/en/Random-Mutagenesis/GeneMorph-II/?cid=AG-PT-171&tabId=AG-PR-1057</a> (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plasmid+Plus+Midi+Kit%22">Plasmid Plus Midi Kit</a>. , Qiagen. Venlo, Netherlands. Available from
 <a target="_blank" href="http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/">http://www.biocompare.com/9956-Assay-Kit/4640391-QIAGEN-Plasmid-Plus-Midi-Kit-25/</a> (1999).</li>
<li>Bahler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+modules+for+efficient+and+versatile+PCR-based+gene+targeting+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe.</a> Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).</li>
<li>Szewczyk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+PCR+and+gene+targeting+in+Aspergillus+nidulans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).</li>
<li>Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNurse%2C+P+%22Fission+Yeast+Handbook%22">Fission Yeast Handbook</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx">https://wolflab.squarespace.com/s/Fission-Yeast-Handbook-Nurse-Lab.docx</a> (2000).</li>
<li>Seo, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+19S+proteasome+is+directly+involved+in+the+regulation+of+heterochromatin+spreading+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast.</a> J Biol Chem. , (2017).</li>
<li>Tang, N. H., et al. <a target="_blank" href="https://peerj.com/preprints/3377/">Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body.</a> PeerJ Preprints. 5, e3377v3371(2017).</li>
<li>Rasooly, A., Weisz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antibacterial+activities+of+phloxine+B+and+other+halogenated+fluoresceins+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+mutagenesis+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random mutagenesis by PCR.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 8. Unit 8 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מוטגנזה מכוונת אקראית באמצעות PCR לשגיאות הוא כלי רב עוצמה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות באזור נתון. טכניקה זו שימושית במיוחד עבור מחקרים אשר מבקשים להעריך את הפונקציה של חלבון תחת נסיבות מסוימות. לדוגמה, במסמך זה השתמשנו PCR לשגיאות כדי להעריך את תפקוד 19 פרוטאוזום יחידה משנית, Rpt4, בתחזוקת הטרוכרומטין. על ידי שינוי האזור ממוקד על ידי ה-PCR לשגיאות, התאמת התנאים ההקרנה, הצלחנו להפוך למוטציות תאים על האזור גנומית של עניין המסך פנוטיפ הרצוי. לאחרונה, שיטה דומה שימשה כדי לבודד תאי שמרים ביקוע מחסה מוטציות בגן רכיב<sup clas...

גנטיקה קדימה היא שיטה קלאסית שבה חוקרים לחפש מוטנטים המתרחשים באופן טבעי המציגים פנוטיפ מסוים, ואת לבצע ניתוח גנטי. גנטיקה הפוכה, מוטציות יוכנסו הגן עניין, פנוטיפ נבדק. במקרה האחרון, מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים יעד משמש לעתים קרובות כדי ליצור מאגר של מוטציות נבחרו לאחר מכן עבור פנוטיפים הרצויה, כגון רגישות טמפרטורה או שינו את פעילות אנזימטיות. ניתן להשתמש בשיטות שונות כדי להשיג מוטגנזה מכוונת אקראי, כולל PCR לשגיאות1; הקרנה UV2; מוטגנים כימיים, כגון אתיל methanesulfonate (EMS) או חומצה חנקיתית3; השימוש של זנים הנתונים זמניים, כגון אלה יתר לבטא mutD5 4; וסדר דנ א5.
כאן, אנו מתארים אסטרטגיה הפוכה-גנטיקה שבו אנו מנצלים PCR לשגיאות לייצר בריכות מוטציה גן המטרה שמרים ביקוע. כפי שאפשר לנחש מהשם שלו, שיטה זו יוצר מוטציות על ידי בכוונה הצגת שגיאות במהלך ה-PCR. בניגוד לשיטות אחרות מוטגנזה מכוונת, PCR לשגיאות מאפשר למשתמש להגדיר את האזור כדי להיות mutagenized. זה עושה את זה שימושי במיוחד המאמצים לחקור את הפונקציה של חלבון/תחום עניין.
כדי להדגים את הפרוצדורה מוטגנזה מכוונת אקראית זו, אנו בזאת השתמש rpt4 +, שמקודד את יחידת משנה פרוטאוזום 19, כדוגמה. Rpt4 הוכח יש פונקציות proteolysis תלויית אורגניזמים שאינם ביקוע שמרים6,7,8,9, פגם proteolysis עלול לגרום השפעות עקיפות על ידי שינוי חלבונים רמות. לפיכך, אנו, איבחון מוטציות שהפעיל שינויים proteolysis עצמאית, במטרה לחקור את תפקוד פרוטאוזום על הטרוכרומטין.
PCR לשגיאות ניתן ליישם בכל אזור הגן על-ידי כוונון המיקום שבו לאגד צבעי יסוד. ניתן לזהות מוטנטים כי התערוכה פנוטיפי לשינוי המיוחל עם כתבים המתאים. כאן, אנחנו מנוצל של הכתב ade6 + הוספת תאים 1 החיצוני חוזרים על עצמם (otr) אזור10. הטרוכרומטין מכוננת נוצר ב אזור זה11, אז הכתב ade6 + מושתק במצב פראי-סוג; זה מסומן על ידי מושבות אדום10. מוטציה אשר שיערער את הטרוכרומטין מכוננת על תאים יוביל הביטוי של ade6 + הכתב, אשר הוא מדמיין בתור מושבות לבן.

<table><tbody><tr><td><חזק>1. מדיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G8270-10 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>BD Biosciences</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td></td></tr><tr><td>אדנין סולפט</td><td>ACR</td><td>16363-0250</td><td></td></tr><tr><td>אורציל&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-היסטידין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.05108.0050</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JUNSEI</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12095</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פתלט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6758-500g</td><td></td></tr><tr><td>אינוזיטול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508-50G</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M7634-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 ש'<תת>2</תת>O&nbsp;</td><td>JUNSEI</td><td>83060-031</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2&bull; 4H2O</td><td>KANTO</td><td>CB8943686</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מוליבדט דיהידראט</td><td>YAKURI</td><td>31621</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>JUNSEI</td><td>80090-0301</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5H2O</td><td>YAKURI</td><td>09605</td><td></td></tr><tr><td>D-myo-inositol</td><td>MP biomedicals</td><td>102052</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate</td><td>YAKURI</td><td>26003</td><td></td></tr><tr><td>חומצה ניקוטינית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4126-500G</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>ביובייסיק</td><td>D0012</td><td></td></tr><tr><td>G418, גנטיצין</td><td>LPS</td><td>G41805</td><td></td></tr><tr><td><חזק>2. תגובות אנזים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PfuUltra II היתוך HS DNA פולימראז</td><td>Aglient</td><td>600380</td><td>למוטגנזה מכוונת אתר</td></tr><tr><td>GeneMorphII ערכת מוטגנזה אקראית</td><td>Aglient</td><td>200500</td><td>עבור PCR נוטה לשגיאות</td></tr><tr><td>נאמנות גבוהה DNA פולימראז</td><td>תרמו פישר</td><td>F-530L</td><td>עבור היתוך PCR</td></tr><tr><td>Ex Taq&nbsp; DNA פולימראז</td><td>Takara</td><td>RR001b</td><td>עבור PCR כללי</td></tr><tr><td>BamH1</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Xho1</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td><חזק>3. ציוד< / חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מרובע, שחור</td><td>VWR</td><td>89033-116</td><td>עבור העתק</td></tr><tr><td>כלי ציפוי העתק</td><td>VWR</td><td>25395-380</td><td>עבור העתק</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>Biorad</td><td>1652100&nbsp;</td><td>לטרנספורמציה של שמרי ביקוע</td></tr><tr><td>קוביות אלקטרופורציה, מרווח של 0.2 ס"מ</td><td>Biorad</td><td>1652086&nbsp;</td><td>לטרנספורמציה של שמרי ביקוע</td></tr><tr><td>Cycler</td><td>Bioer</td><td>תרמי BYQ6078</td><td>לתגובת רמפת PCR היתוך&nbsp;</td></tr></tbody></table>

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

מוטגנזה מכוונת אקראי של גנים היעד משמשת לזיהוי מוטציות תשואה של פנוטיפ הרצוי. שיטות העשויות לשמש להשגת מוטגנזה מכוונת אקראי, PCR לשגיאות היא אסטרטגיה נוחה ויעילה ליצירת מאגר מגוון של מוטציות (כלומר., ספרייה מוטציה). PCR לשגיאות הוא שיטת הבחירה כאשר חוקר מבקש להפוך למוטציות אזור מוגדרים מראש, כגון האזור קידוד של הגן תוך השארת אזורים אחרים גנומית מעושה. לאחר ספריית מוטנטים מוגבר על-ידי ה-PCR לשגיאות, זה חייב להיות משובטים לתוך פלסמיד מתאים. הגודל של הספרייה שנוצר על ידי ה-PCR לשגיאות מוגבל בשל היעילות של השלב שיבוט. עם זאת, בשמרים ביקוע, שמר הביקוע, הצעד השיבוט יכול להיות מוחלף על ידי שימוש יעילים ביותר בשלב אחד פיוז'ן PCR כדי ליצור מבנים לשינוי. מוטציות של פנוטיפים הרצוי ייתכן ואז שנבחר באמצעות עיתונאים המתאים. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיה הזאת בפירוט, לוקחים כדוגמה, כתב להוסיפה אצל הטרוכרומטין centromeric.

המוטציות Rpt4 שנרכש על-ידי ביצוע ההליכים המתוארים באיור 1 ניתן לנתח אותם על-ידי הערכת את הצבעים של המושבות. הצבעים של המושבות הם הבחינו על גבי הלוחות הרלוונטיים ומקטין את המספר באיור2. הכתב ade6 + להוסיפה אצל באזור הטרוכרומטין מושתק בפראי-סוג ומראה מושבות אדום בצלחת כן-אייד. ברגע הטרוכרומטין הוא גרם אולי לפגיעה ביציבות הכתב ade6 + מתבטא, מושבות לבן יכול להיות שנצפו בצלחת כן-איד כמו מוטציה clr4Δ . המוטצי...

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

המטרה הכוללת של מוטגנזה אקראית זו היא לסנן מוטציות המערערות את יציבות ההטרוכרומטין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההטרוכרומטין, כגון גורמים המווסתים את היווצרות ותחזוקת ההטרוכרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לכוון ספציפית לגן רצוי למוטגנזה, גם אם הגן חיוני.כדי להתחיל, הכינו תמצית שמרים עם תוספי מזון, או כן, ללא אדנין, פומבה גלוטמט מדיום, או PMG, ו-PMG ללא אדנין, על ידי ערבוב הרכיבים כפי שמוצג בטבלה זו. לאחר חיטוי והוספת G418 במידת הצורך, מערבבים את המדיום עוד חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, הכניסו את המדיה לצלחות פטרי של 90 מיליליטר ואחסנו את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס.באמצעות ה-rpt4 החיובי המשובט שלו, עם חמשת ה-UTRs הראשוניים ושלושת הראשוניים והמוטציה השקטה, כמו גם פריימרים p5 ו-p6 ופולימראז מיוחד, שנועד לייצר שיעור שגיאות גבוה, מבצעים PCR מועד לשגיאות בנפח כולל של 50 מיקרוליטר. לאחר יצירת מבנה טרנספורמציה-היתוך, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחסן עשרה מיליליטר של מדיום YES בשמרים, ולדגור אותו במשך יותר מ -16 שעות לרוויה. השתמש ב-200 מיליליטר של מדיום YES כדי לדלל את התאים ל-OD600 של 0.2, ולדגור את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך חמש עד שש שעות ל-OD600 של 0.6 עד 0.8.חשב את נפח התאים שמסתכמים ב- OD600 מתוך 30. לאחר מכן, הוציאו את התאים לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצננו אותם על קרח למשך 10 דקות. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1050 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.לאחר מכן, הניחו את צינורות המיקרופוגה עם DNA קלטת ו -10 אלקטרו קובטות על קרח. בעודכם על הקרח, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 15 מיליליטר של סורביטול 1.2 מולארי, נערו בעדינות את הצינורות כדי להשהות מחדש את התאים, ואז צנטריפוגה את התאים ב-1050 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנטנט ובצעו שטיפת סורביטול שנייה.לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ואספו את כולם בצינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1.2 סורביטול מולארי עד 2.4 מיליליטר.שמור את צינור התאים על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תאים תלויים בסורביטול לצינור המכיל את מבנה ה-PCR ההיתוך, ערבב היטב והעביר את הדגימה לקובט אלקטרו. חשוב לא להשתמש בכמות עודפת של קלטת PCR, מכיוון שהיא תיתן שגיאות פריקה.אלקטרופורציה של התאים באמצעות האפשרויות הבאות:הוסף 600 מיקרוליטר של סורביטול 1.2 מולארי לכל קובטה אלקטרו לנפח כולל של 800 מיקרוליטר. לאחר מכן, מורחים את התאים על ארבע צלחות כן. דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.לאחר מכן, בצע ציפוי העתק ב-YES plus G418 לפני דגירה של הצלחות למשך שלושה ימים נוספים. עבור כל צלחת YES פלוס G418, בצע ציפוי העתק ל- YES ללא אדנין ו- PMG ללא לוחות אדנין. דגרו את לוחות ההעתק בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד שחלק מהמושבות ב-YES ללא לוחות אדנין יראו צבע לבן.השווה כן ללא אדנין ו-PMG ללא לוחות אדנין ובחר תאים המראים ורוד או לבן על כן ללא צלחת אדנין, וגם גדלים על ה-PMG ללא צלחת אדנין. אל תבחר מושבות ללא גידול ב-PMG ללא אדנין, מכיוון שהן חיוביות כוזבות. בחרו כל מושבה והוסיפו אותה ל-10 מיקרוליטר של תמיסת SPZ המכילה 2.5 מיליגרם למיליליטר זימוליאז 100T.לאחר מכן, דגרו על המושבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. לאחר הדגירה, השתמש במיקרוליטר אחד של תמיסה זו כתבנית ההתחלה ל-PCR של המושבה. לאחר עיכול מושבות נבחרות וביצוע אלקטרופורזה של ג'ל על פי פרוטוקול הטקסט, סמנו את המושבות שמוצרי ה-PCR שלהן נחתכו על ידי XHO1 והדביקו אותן ללוחות YES plus G418.לאחר בידוד ה-gDNA מתאי שמרי ביקוע, וריצוף תוצרי ה-PCR על פי פרוטוקול הטקסט, השווה את הרצף שהתקבל לרצף מסוג הבר כדי לזהות מוטציות. לאחר שהמוטציות מוכנסות מחדש לתאים מסוג בר, השתמש באיתור כדי לאשר את הפנוטיפ בתאים המוטנטיים החדשים שנוצרו. ניתן לנתח את המוטציות rpt4 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול המודגם בסרטון זה על ידי הערכת צבעי המושבות.כפי שמוצג באיור זה, המושבות נצפו על הלוחות הרלוונטיים במספר תאים יורד. מדווח האדנין המוחדר לאזור ההטרוכרומטין מושתק בתאים מסוג בר ומייצר מושבות אדומות על כן ללא לוחות אדנין. ברגע שההטרוכרומטין מתערער ומדווח האדנין מתבטא, ניתן לצפות במושבות לבנות ב-YES ללא לוחות אדנין כפי שניתן לראות עם מוטנט clr4-delta.מוטציות ה-rpt4 המוקרנות הן כפי שמוצג עם מוטנט rpt4-1 המציג את חוסר היציבות ההטרוכרומטין החמור ביותר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים כדי להשיג את המוטאנטים הרצויים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבטל את התוצאות החיוביות השגויות מכיוון שהן תכופות מהצפוי.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיהור חלבונים ובדיקות פעילות אנזימים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו אופי החלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מוטציות בגן מטרה עם הפנוטיפ הרצוי.

gene-targeted-random-mutagenesis-to-select-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כאן אנו להדגים פרוטוקול פשוט ליצור ספריה מוטציה אקראית על רצף יעד נתון. אנו מראים כיצד שיטה זו, אשר מבוצעת in vivo של Escherichia coli, יכול להיות יחד עם בחירות פונקציונלי להתפתח פעילות אנזימטית חדשה.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבנייה וסינון של ספריות מוטנטיות עבור מסעות אבולוציה מכוונים ב-Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

אנו מציגים פרוטוקול עבור ההערכה התפקודית של ספריות mutagenesis רווי אתר יחיד המקיפות של חלבוני ניצול רצף תפוקה גבוהה. חשוב לציין, גישה זו משתמשת זוגות פריימר מאונכים לבצע ריבוב בניית רצף ספרייה. תוצאות נציג באמצעות TEM-1 β-lactamase שנבחר במינון רלוונטי קליני של אמפיצילין מסופקות.

פרוטוקול והערכה תפקודית של ספריות mutagenesis רווית Whole-חלבון ניצול רצף תפוקה גבוהה

גנטי בקידוד היסטון-miniSOG גורם מוטציות תורשתי הגנום כולו באופן אור תלוי כחול. שיטת mutagenesis זה היא פשוטה, מהירה, ללא כימיקלים רעילים, מתאים היטב סריקה גנטית קדימה ואינטגרציה transgene.

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מאמר זה מציג שיטה מבוססת על הזיווג כדי להקל על הקרנת ביטוי ניצני שמרים באמצעות ספריה פלסמיד ערוכים.

ביטוי ההזדווגות מבוססי ספריית הקרנה שמרים

אנו מציגים את פרוטוקול מסך משתיק קול פשוט בהתכה שמרים. שיטה זו היא יעילה ללא מוטגן, סלקטיבי מוטציות מתרחשות לעיתים קרובות באתר גנומית יחיד.  הפרוטוקול מתאים לבידוד מדכאי על פגמים צמיחה בתרבות נוזלי שנגרמות על ידי מוטציה או תרופה.

מסך משתיק קול עמוק רצף-בסיוע, ספונטני ב ביקוע שמרים שמר הביקוע

מוטציות קטלניות רגישות לטמפרטורה (ts) הן כלים רבי ערך לזיהוי וניתוח פונקציות חיוניות. כאן אנו מתארים שיטות ליצירה וסיווג של מוטציות קטלניות בתפוקה גבוהה.

תפוקה גבוהה בידוד Assisted רובוטית של מוטאנטים קטלניים רגישים-טמפרטורה<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

למד שיטת מוטגנזה אקראית מכוונת לזיהוי מוטציות המפריעות ליציבות הטרוכרומטין בשמרים ביקוע. טכניקה זו מאפשרת מחקר גנים חיוניים ומנגנוני ויסות תאיים.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

גלה סרטונים נוספים