גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

המטרה הכוללת של מוטגנזה אקראית זו היא לסנן מוטציות המערערות את יציבות ההטרוכרומטין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההטרוכרומטין, כגון גורמים המווסתים את היווצרות ותחזוקת ההטרוכרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לכוון ספציפית לגן רצוי למוטגנזה, גם אם הגן חיוני.

כדי להתחיל, הכינו תמצית שמרים עם תוספי מזון, או כן, ללא אדנין, פומבה גלוטמט מדיום, או PMG, ו-PMG ללא אדנין, על ידי ערבוב הרכיבים כפי שמוצג בטבלה זו. לאחר חיטוי והוספת G418 במידת הצורך, מערבבים את המדיום עוד חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, הכניסו את המדיה לצלחות פטרי של 90 מיליליטר ואחסנו את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס.

באמצעות ה-rpt4 החיובי המשובט שלו, עם חמשת ה-UTRs הראשוניים ושלושת הראשוניים והמוטציה השקטה, כמו גם פריימרים p5 ו-p6 ופולימראז מיוחד, שנועד לייצר שיעור שגיאות גבוה, מבצעים PCR מועד לשגיאות בנפח כולל של 50 מיקרוליטר. לאחר יצירת מבנה טרנספורמציה-היתוך, על פי פרוטוקול הטקסט, יש לחסן עשרה מיליליטר של מדיום YES בשמרים, ולדגור אותו במשך יותר מ -16 שעות לרוויה. השתמש ב-200 מיליליטר של מדיום YES כדי לדלל את התאים ל-OD600 של 0.2, ולדגור את התרבית ב-30 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך חמש עד שש שעות ל-OD600 של 0.6 עד 0.8.

חשב את נפח התאים שמסתכמים ב- OD600 מתוך 30. לאחר מכן, הוציאו את התאים לארבעה צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר וצננו אותם על קרח למשך 10 דקות. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 1050 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, הניחו את צינורות המיקרופוגה עם DNA קלטת ו -10 אלקטרו קובטות על קרח. בעודכם על הקרח, השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 15 מיליליטר של סורביטול 1.2 מולארי, נערו בעדינות את הצינורות כדי להשהות מחדש את התאים, ואז צנטריפוגה את התאים ב-1050 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. השליכו את הסופרנטנט ובצעו שטיפת סורביטול שנייה.

לאחר הצנטריפוגה, השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את התאים ואספו את כולם בצינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 1.2 סורביטול מולארי עד 2.4 מיליליטר.

שמור את צינור התאים על קרח. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של תאים תלויים בסורביטול לצינור המכיל את מבנה ה-PCR ההיתוך, ערבב היטב והעביר את הדגימה לקובט אלקטרו. חשוב לא להשתמש בכמות עודפת של קלטת PCR, מכיוון שהיא תיתן שגיאות פריקה.

אלקטרופורציה של התאים באמצעות האפשרויות הבאות:הוסף 600 מיקרוליטר של סורביטול 1.2 מולארי לכל קובטה אלקטרו לנפח כולל של 800 מיקרוליטר. לאחר מכן, מורחים את התאים על ארבע צלחות כן. דגרו את הצלחות בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

לאחר מכן, בצע ציפוי העתק ב-YES plus G418 לפני דגירה של הצלחות למשך שלושה ימים נוספים. עבור כל צלחת YES פלוס G418, בצע ציפוי העתק ל- YES ללא אדנין ו- PMG ללא לוחות אדנין. דגרו את לוחות ההעתק בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים עד שחלק מהמושבות ב-YES ללא לוחות אדנין יראו צבע לבן.

השווה כן ללא אדנין ו-PMG ללא לוחות אדנין ובחר תאים המראים ורוד או לבן על כן ללא צלחת אדנין, וגם גדלים על ה-PMG ללא צלחת אדנין. אל תבחר מושבות ללא גידול ב-PMG ללא אדנין, מכיוון שהן חיוביות כוזבות. בחרו כל מושבה והוסיפו אותה ל-10 מיקרוליטר של תמיסת SPZ המכילה 2.5 מיליגרם למיליליטר זימוליאז 100T.

לאחר מכן, דגרו על המושבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. לאחר הדגירה, השתמש במיקרוליטר אחד של תמיסה זו כתבנית ההתחלה ל-PCR של המושבה. לאחר עיכול מושבות נבחרות וביצוע אלקטרופורזה של ג'ל על פי פרוטוקול הטקסט, סמנו את המושבות שמוצרי ה-PCR שלהן נחתכו על ידי XHO1 והדביקו אותן ללוחות YES plus G418.

לאחר בידוד ה-gDNA מתאי שמרי ביקוע, וריצוף תוצרי ה-PCR על פי פרוטוקול הטקסט, השווה את הרצף שהתקבל לרצף מסוג הבר כדי לזהות מוטציות. לאחר שהמוטציות מוכנסות מחדש לתאים מסוג בר, השתמש באיתור כדי לאשר את הפנוטיפ בתאים המוטנטיים החדשים שנוצרו. ניתן לנתח את המוטציות rpt4 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול המודגם בסרטון זה על ידי הערכת צבעי המושבות.

כפי שמוצג באיור זה, המושבות נצפו על הלוחות הרלוונטיים במספר תאים יורד. מדווח האדנין המוחדר לאזור ההטרוכרומטין מושתק בתאים מסוג בר ומייצר מושבות אדומות על כן ללא לוחות אדנין. ברגע שההטרוכרומטין מתערער ומדווח האדנין מתבטא, ניתן לצפות במושבות לבנות ב-YES ללא לוחות אדנין כפי שניתן לראות עם מוטנט clr4-delta.

מוטציות ה-rpt4 המוקרנות הן כפי שמוצג עם מוטנט rpt4-1 המציג את חוסר היציבות ההטרוכרומטין החמור ביותר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים כדי להשיג את המוטאנטים הרצויים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לבטל את התוצאות החיוביות השגויות מכיוון שהן תכופות מהצפוי.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו טיהור חלבונים ובדיקות פעילות אנזימים על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו אופי החלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מוטציות בגן מטרה עם הפנוטיפ הרצוי.