Name: מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: למדו ליצור מודל עור תלת-ממדי אורגנוטיפי לספירואידים של מלנומה המחקה את מבנה הגידול והמורכבות התאית של מלנומה אנושית. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין גידול למארח ובדיקת טיפולים תרופתיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים חנה Voersmann על הקמת 3D organotypic מלנומה-ספרואיד-העור-הדגם ומספקת פרוטוקולים מעולה. המחברים גם תודה שערותיו ארוכות ואפורות בוש לתמיכה טכנית יקרי ערך. העבודה נתמכה על ידי BMBF e: תוכנית לרפואה 031A423A "מלנומה רגישות".

כל רקמה אנושית העבודה בוצעה באמצעות פרוטוקולי המוסדי שאושר.
1. הפרדה בין דרמיס לאפידרמיס של העור האנושי (ילדותי עורלה ברית מילה)
<ol><li>למקם את העורלה (בדרך כלל 1-2 ס מ2) לתוך תבשיל תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 10 ס מ), לכסות את זה עם 10-12 מ ל תמיסת באגירה פוספט+ (pH 7.2 מ מ CaCl2, 0.5 מ מ MgCl2, PBS = PBS+). הסר את כל הרקמות (אדיפוז) עודף באמצעות אזמל סטרילי וחדים.</li>
	<li>לחתוך את העור לחתיכות 3 מ מ x 5 מ מ, לשטוף אותם עם PBS, מעבירים לצלחת תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 6 ס מ). מכסים את חתיכות רקמה עם 5-7 מ של dispase פתרון (2 U/mL ב- PBS). לאטום את המנה התרבות תאים עם סרט פרפין, תקופת דגירה של 16 h-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>. משכי את עוריות מן החלק עורי עם מלקחיים סטרילי שני להעביר את חתיכות רקמה גזור תא בודד ללא דבק תרבות מנות (Ø 6 ס מ), לכסות את כל אחד מהם עם PBS+.</li>
</ol>2. בידוד של ראשי Keratinocytes מכל האפידרמיס
<ol><li>בזהירות להסיר את PBS+ המנה התרבות התא באמצעות פיפטה פסטר ולשטוף את חתיכות רקמות עוריות (סעיף 1.3) עם PBS. לחתוך את האפידרמיס לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ2) ולאסוף אותם צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל 1 x טריפסין-EDTA (טרופה עד 37 ° C), תקופת דגירה של 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º C מערבולת המתלה רקמות כל 2 דקות.</li>
	<li>לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת סרום עגל עוברי 1 מ"ל (FCS). Resuspend התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה פלסטיק 10-mL עבור 4 דק לנסות להימנע בועות וקצף היווצרות.</li>
	<li>Pipet התליה תא לתוך מסננת תא (נקבוביות בגודל 100 מיקרומטר), הממוקמת מעל צינור חרוטי מ"ל, ולשטוף 3 x 5 מ ל PBS. Centrifuge התאים ב g 200 x עבור 5 דק Resuspend בגדר תא 2-6 מ"ל תרבות בינוני המכיל 1% (v/v) gentamycin. לקבוע את מספר התא באופן ידני על ידי תאים ספירה תאים 6 x 105 hemocytometer וזרע לתוך בקבוקון תרבות T75 התא.</li>
</ol>3. טיפוח Keratinocytes ראשי
<ol><li>דגירה keratinocytes העיקרי מבודד בשלב 2.3 בחממה תא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בינוני תקין ללא FCS, כדי confluency 50-70%.</li>
	<li>את המעבר של keratinocytes בזהירות להסיר את המדיום, הוסף 5 מ ל PBS-EDTA, דגירה התאים 10 דקות ב 37 º C. לבדוק אם התאים החלו להתנתק מן הבקבוק תרבות תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה: תאים יופיע מעוגל אך עדיין מחוברים!). אם לא, להחליף PBS הישן-EDTA PBS טריים-EDTA, מחדש תקופת דגירה של עוד 10 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA לתאים מעוגל עדיין מכוסה 10 מ"ל PBS-EDTA ו מחדש דגירה אותם למשך 1-3 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 1 מ"ל FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר תקין בינונית, ואת הזרעים 6 x 105 תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא. הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, keratinocytes העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר ממעבר 3-4.</li>
</ol>4. בידוד של Fibroblasts העיקרי של הדרמיס
<ol><li>לחתוך את הרקמה עורי (סעיף 1.3) לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ2) ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל collagenase-פתרון (5 U/mL ב- PBS+), תקופת דגירה של 45 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c Centrifuge התערובת של חתיכות רקמות ותאים ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את צניפה תא פעמיים עם 10 מ"ל DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין, אך ללא L-פירובט. סוף סוף resuspend את חתיכות רקמה ב 2 מ של DMEM המכיל 1% (v/v) gentamycin ו- 10% FCS. להעביר אותם לתוך בקבוקון תרבות תא T25, דגירה אותם בתוך חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה. הערה: אמצעי האחסון קטן מאפשר את fibroblasts להגר ההריסות הרקמות, מכריח אותם כדי לצרף הבקבוקון תרבות.</li>
	<li>למחרת בבוקר, להוסיף עוד 6 מ ל DMEM/Gentamycin/FCS, תקופת דגירה של 2-3 ימים ב 37 ° C עד התאים הגיעו 80-90% confluency.</li>
</ol>5. טיפוח Fibroblasts ראשי
<ol><li>המעבר של fibroblasts, להסיר את המדיום ולשטוף תאים חסיד עם PBS. הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA דגירה למשך 3 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 5 מ"ל DMEM/FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר DMEM בינוני, זרע 6 x 105 תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא. הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, fibroblasts העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר מעבר 4-6.</li>
</ol>6. דור של מלנומה 3D Spheroids באמצעות שיטת טיפה תלוי
<ol><li>תרבות בתאי מלנומה (למשל, 451-לו או כל קו תא מלנומה עניין) על פי כללי פרוטוקולים, באמצעות RPMI המכיל 10% FCS15.<ol>
<li>כדי להפיק מלנומה spheroids של גודל ואיכות דומים, לשטוף את תאי מלנומה PBS, הוסף 5 מ של 1 x טריפסין-EDTA ב- PBS תאים T175 תא תרבות הבקבוק ולאחר תקופת דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 5 מ"ל RPMI/10% FCS. קציר שהתאים על ידי צנטריפוגה-g 200 x עבור 5 דק להשעות מחדש בגדר תא ב RPMI/FCS-ריכוז סופי של תאים למ"ל 10,000 כפי שנקבע על ידי בבניינים של hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום 40 x 25 µL (= 250 תאים) של התליה תא על גבי המשטח הפנימי של המכסה לצלחת תרבות תא ללא דבק סטרילי (Ø 10 ס מ) בעזרת פיפטה מרובה אלקטרונית. עם תנועה מהירה אך חלקה, תסובב את המכסה ומניחים אותו על המנה התרבות תאים המתאימים המכיל 5 מ"ל PBS.<ol>
<li>תרבות "מחזיקה טיפה מנות" חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-2 10-14 ימים, בהתאם לסוג התא המשמש. הערה: התאים משלב הצמיחה MM בדרך כלל לגדול מהר יותר, בצורה יותר חזקה spheroids הטיפה לתלייה לעומת בתאי מלנומה נגזר על RGP או VGP. להערכת בודדים, להתבונן ספרואיד צמיחה תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). בדרך כלל, spheroids הופכים לזיהוי לאחר 48 שעות תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). אחרי 10-14 ימים, הם גלויים ללא כל מכשיר ההגדלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 ימים לאחר סיכוייכם טיפה הראשונית, להוסיף 10 µL בינוני RPMI/10% FCS טריים כל טיפה. לאחר מכן, חילופי µL 10 בינוני בכל יום אחר. השימוש של מתקן אלקטרוני שימושי מאוד בשלב זה.</li>
	<li>בהתאם לסוג התא, לקצור את spheroids (ראה סעיף 10 לפרטים) לאחר 10-15 ימים בהדחה בעדינות המכסה תא תרבות צלחת עם PBS. לאסוף אותם בקערה התרבות התא ללא דבק טריים. הערה: תקופת טיפוח-תרגול תלוי שלב הצמיחה גידול של תאי מלנומה כאשר הם נשאבו בתחילה, למשל, spheroids שמקורם תאים 451-לו לגדול כ-500 מיקרומטר בקוטר בתוך 12 ימים culturing בתיבה הנפתחת תלויה15 .</li>
</ol>7. דור של תא עורי עור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>ליצור מודלים העור באמצעות 24-ובכן תא נקבובי ממברנה מוסיף (הנקבוביות גודל 8 מיקרומטר) להציב לוחות 24-. טוב. הערה: ודא שלא לעשות שימוש תלוי אבל עומד מוסיף, כי הם ימוקמו על פלטה 6-ובכן לטיפוח אוויר נוזלי בשלב מאוחר יותר.</li>
	<li>הכינו את הפתרון (GNL) ניטרול ג'ל15, כמו גם התקשורת תרבות המכונה מ"מ ו16,צמיחה אנדותל מדיה (EGM)17. כדי למנוע קרישת דם, חנות הקולגן מסוג I (בדרך כלל מזנב החולדה, 3.5-4 מ ג/מ ל חומצה אצטית N 0.02 נקודות) על הקרח עד השימוש, כי זה מתחיל להתחבר ב- RT.</li>
	<li>להשעות מחדש עונה 1 פרק 10 fibroblasts5 לכל הוספה ב GNL ומערבבים במהירות התליה תא עם קולגן ביחס של 1:3 באמצעי אחסון הסופי של µL 500/הוספה. מיקס על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות בועה כמו בועות עשוי לפגום באיכות העור לשחזר.</li>
	<li>לאפשר את ג'לים עורי בודדים להתיישב על ידי שמירה אותם בלי בינוני ב RT למשך 30 דקות בשכונה סטרילי. לאחר מכן מכסים כל ג'ל עם DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L, 1%-גלוטמין, 10% FCS, וללא L-פירובט, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
</ol>8. דור של התא באפידרמיס של עור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>למחרת להסיר את המדיום ג'לים עורי, equilibrate אותם עם המדיה EGM (FCS 10%, 1% PenStrep, גנטמיצין 10 מ"ג/מ"ל) עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למשוך את המדיום, בזהירות זרע keratinocytes5 עונה 1 פרק 10 resuspended ב 100 µL EGM על גבי הג'ל עורי.</li>
	<li>דגירה של בנייה עבור 1.5 h ב 37 ° C כדי לאפשר את keratinocytes לדבוק תא עורי. הערה: במהלך תקופה זו דגירה, ג'לים יתחילו להתכווץ עקב התכווצות פיברובלסט-induced, לפיכך, לפחות באופן חלקי ניתוק מהקירות הוספה.</li>
	<li>מכסה את העור מקבילות עם 800 µL EGM, הסר בזהירות את הג'ל שיורית מהקיר הוספה עם טיפ קטן פיפטה (לבן). תרבות של מקבילות העור שקועים EGM למשך 7 ימים חממה תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ולשנות את המדיום בכל יום אחר. הערה: במהלך תקופה זו העור מקבילות יתכווץ באופן משמעותי.</li>
</ol>9. אוויר נוזלי טיפוח העור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>יום 8, העברת כל הכנס טוב בודדים של צלחת 6-. טוב. רק להוסיף מ ל 1.2-1.4 מ מ בינוני כל טוב, כך בנייה מחדש העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך אינו מכוסה בינונית. הערה: את הטיפוח הממשק אוויר נוזלי מאפשר ריבוד של חלק באפידרמיס, הקמת שכבה cornified מלא (הקרנית).</li>
	<li>במהלך הימים 10-17, לשנות את המדיום כאמור בסעיף 9.1 בכל יום אחר. במהלך תקופה זו, להוסיף תרופות או גירויים אחרים לפי הצורך כדי המדיום. הסר בזהירות את בנייה מחדש של העור מלא מהמכסה נקבובי ממברנה בעזרת פינצטה מעוקל לניתוח נוסף, למשל, ניתוח immunohistochemical (איור 1).</li>
</ol>10. דור של הדגמים העור מלנומה Organotypic ספרואיד
<ol><li>כדי לשלב את spheroids מלנומה לתוך תא עורי של בנייה מחדש העור מלא organotypic, בזהירות לשטוף את spheroids (לאחר שלב 6.4) המכסה של התליה טיפה תא תרבות תבשיל עם PBS. לאסוף 10-20 spheroids/להוסיף לצלחת תרבות עקרה תא ללא דבק. הסר בזהירות PBS מוגזמת עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>מחוק לגמרי את spheroids ביותר האפשרי הקטן ביותר של אמצעי האחסון של EGM. בשלב הזה לצפות ולספור את spheroids בעין בלתי מזוינת, ללא מכשיר ההגדלה נוספות. לקחת 10-20 spheroids לכל עור דגם/ג'ל, כאמור בשלב 10.1.</li>
	<li>העברתם לאמצעי האחסון הרצויה של GNL המכילה fibroblasts (במהלך שלב 7.3), מערבבים עם סוג הקולגן. מהשלב הזה על המשך כמתואר בסעיפים 7.3-9.1. הערה: גידול spheroids לנראה הג'ל עורי כמו כתמים לבנים (איור 2)</li>
</ol>

<ol><li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermis%3A+a+sensory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+homeostasis%3A+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li>
<li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+melanocytes+to+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li>
<li>Clark, W. H. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li>
<li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+development+and+progression%3A+a+conspiracy+between+tumor+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li>
<li>Miller, A. J., Mihm, M. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra052166">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li>
<li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li>
<li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma%3A+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li>
<li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li>
<li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li>
<li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mutated%2C+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li>
<li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dtsch.+Dermatol.+Ges%22%5BJournal%5D)">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death.+Dis%22%5BJournal%5D)">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719(2013).</li>
<li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+%3A+biological+significance+of+bFGF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li>
<li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li>
<li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li>
<li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Organotypic מלנומה ספרואיד עור דגם הציג כאן צווי תובנות חדשות על הבנה עמוקה יותר של אינטרה-tumoral ואינטראקציה הגידול-מארח, ואשר עשוי לספק פלטפורמה סינון מתקדם כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התפתחות גידולים, ההתנגדות טיפול בעתיד.
כדי להבטיח את הטוב ביותר הפיזיולוגיות ויוו לחקות תנאי העור משחזר, האיכות של התאים הראשי הוא בעל חשיבות עליונה. כאמור לעיל, תאי העור קטין או טרום לידתית להראות בכיתה התמיינות הנמוכה ביותר, לכן המתאימים ביותר ליצור מקבילות מלא-עובי העור. בקרת האיכות אפשרי הראשון הוא מידת התכווצות עורי-יום 2 לאחר זריעה של keratinocytes, equilibrating את הג'ל על EGM (פרוטוקול סעיפים 8.2 ו- 8.3). ג'לים עורי יתכווץ ביותר עם האיכות הטובה ביותר של fibroblasts. כמו כן, השילוב של fibroblasts מעט מדי או יותר מדי עשוי לפגום עורי להתכווצות כתוצאה מכך הקובץ המצורף באפידרמיס תא עורי. זה בתורו תסכן את הבידול באפידרמיס, כי תהליך זה דורש מקיף צולבות לדבר בין עורי וכן תאים.
האיכות של ראשי תאים תלויה גם באופן ביקורתי את confluency תא, כמו גם המעבר של התאים. אם keratinocytes הם מגדלים כדי ≥80% confluency הם מיד להפסיק מתרבים ולהתחיל להבחין. לכן חשוב תרבות אותם כדי confluency 40-70% במהלך passaging, ולהשתמש בהם לא יאוחר מעבר 3-4. Fibroblasts פחות רגישים, אך אין להשתמש מאוחר יותר מאשר מעבר 4-6. אנא שימו לב כי כל ראשי תאים, שורות תאים המשמשת ליצירת organotypic מלנומה ספרואיד העור מודלים מתורבתים בחינם של אנטיביוטיקה, ולכן הסיכון לזיהום הוא גבוה. עם זאת, התוספת של אנטיביוטיקה משנה את הפיזיולוגיה של תאים נפרדים, ולפיכך מפחית את טיב המקבילים העור.
באופן כללי, הגידול ספרואיד היווצרות אפשרי מפני כמעט כל מיני שורות תאים סרטניים וגם מתאי הגידול מבודד טריים מן החומר המטופל. תא הראשונית מספר ו/או טיפוח הזמן להשגת גדלים ספרואיד אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש. עד גודל של 150-200 מיקרומטר, כל התאים הכלולים ספרואיד יכול עדיין מספיק להנתן עם חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה פשוטה. רק spheroids עם גדלי ≥500 מיקרומטר להראות דרגת התמיינות גבוהה ומייצגים תכונות אופייניות של רקמת הגידול הלא-vascularized22.
Organotypic מלנומה-ספרואיד-העור-המודל פותח כאן זה מתאים במיוחד ללמוד אינטראקציות הגידול-פונדקאי ועבור בדיקות תחת in vivoסמים מלנומה-כמו תנאים15. . עדיין, הסביבה של מלנומה ויוו הוא אפילו יותר מורכב, מחסה מגוון רחב של סוגי תאים סרטניים הקשורים, כולל תאים חיסוניים ותאי אנדותל. מאז התוספת של נאות תאים חיסוניים הראשי פונה בעיות histocompatibility, מודלים אלה עדיין אינם מסוגלים לעקוב כראוי אחר גישות טיפוליות-החיסון.
ובכל זאת, מלנומה spheroids יכול להיווצר מחומר מבודד טרי החולה, ברגע כלול בתוך בנייה מחדש עור מלא, עשוי לשמש סמים בודדים הקרנת פלטפורמות. גם השילוב של חתיכות של גרורות סרטן העור לתוך העור בנייה הוא מתקבל על הדעת לנסות שילובים תרופתיים בגישה טיפולית מותאמת. כולל דגם העור מלנומה organotypic התלת-ממד בבדיקת פרה סביר להבטיח כי רק המבטיחים ביותר הרומן טיפולית המושגים נלקחים קדימה ניסויים קליניים, ובכך להקטין את השחיקה של טיפולים פוטנציאליים חדשים בשביל זה המחלה, הגדלת שיעור ההצלחה הטיפולית בניסויים קליניים.

העור האנושי מורכב שני תאים נפרדים לשרת פונקציות שונות בהגנה על הגוף מפני השפעות סביבתיות שליליות1. תא עורי התחתון מורכב רקמת חיבור fibro-אלסטי. הוא מורכב של סיבי קולגן ואלסטין מחוברים באופן רופף מסונתז על ידי fibroblasts, משרת פונקציה מחסום מכני. הדרמיס מופרד האפידרמיס העליון על ידי הנדן הבזליים אשר מופק כמו מטריצה חוץ-תאית בשל תקשורת מתמדת בין שני תאי העור. בניגוד הדרמיס, האפידרמיס אפיתל קשקשיים אשר מורכב בעיקר keratinocytes, יכול להיות מובחן ארבע שכבות. הרובד basale מורכב מובחן keratinocytes הבזליים אשר נובעות כל הזמן העור ובתאים stratifying דרך השלבים של הרובד קוצנית , הרובד granulosum לתוך stratum corneum כדי להגן על הגוף מפני התייבשות וזיהומים2. מלנוציטים מיושרים של קרום הבסיס, ולתקשר באמצעות הרחבות דנדריטי עם keratinocytes מרובים. הם מייצרים מלנין הפיגמנט כדי להגן על רקמות העור מפני ההשפעות השליליות של קרינת UV, כמו הזדקנות העור, החיסוני, דלקת, אינדוקציה של סרטן עור שאינו מלנומה. התרומה קרינה UV הטרנספורמציה של מלנוציטים כדי מלנומה ממאירה, אולם הוא עדיין תחת הדיון3.
התפתחות מלנומה הבדיל לשלבים התקדמות הגידול שונים, המאופיינת על ידי שינויים גנטיים, מורפולוגיות, היסטולוגיים מסויימים4. הם מקורם גם דה נובו או של נקודת חן מולדת או נרכשת עקב מקומי עלייה של התפשטות מלנוציט גורם neoplasia שפיר. את הפציעה קודמן עשוי להמיר לתוך רקמות dysplastic מבנית ששונה המכיל תאים atypic, אשר עלולה להמשיך ממאיר בשלב הראשון, שלב הצמיחה רדיאלי (RGP). בשלב מוקדם זה התקדמות הגידול מאופיין על ידי תאים מתרבים בצורה רדיאלית בתוך האפידרמיס, מציג כמה תאים באופן מקומי פולשנית בתוך הדרמיס papillary. במהלך מלנומה שלב (VGP) עוקבות גדילה אנכי תאים הצגה כבר הפנוטיפ גרורתי ופולשני לעבור דרך הנדן הבזליים לחדור בחלק העמוק של הדרמיס, כמו גם את הרקמה התת עורית5. לבסוף, מלנומה גרורתית (MM) מייצג את הבמה התקדמות האגרסיביים ביותר עם תאים גרורתי מערכתית מתפשטת ברחבי מערכת הדם והלימפה לפלוש יש איברים כמו הכבד, הריאות, המוח6.
עד כה, אבחון מוקדם ולאחריו ניתוח נשאר עדיין הטיפול היעיל ביותר של מלנומה ממאירה. הפרוגנוזה של חולים עם גרורות רחוקות, עם זאת, עדיין גרועות במיוחד7, כי משטרי כימותרפיה קלאסית להתייעץ רק קצת הישרדות תועלת8,9. עם זאת, לאחר עשרות שנים של קיפאון, התפתחויות אחרונות טיפולים ממוקדים במידה ניכרת שיפרו את סיכויי ההחלמה של מלנומה ממאירה.
Dysregulation של שני מסלולים עיקריים mitogen מופעל, את ראס-RAF-MEK-טיפשה, את PI3K-AKT-PTEN איתות המסלולים, להציג את מניעי מפתח של מלנומה התקדמות, במיוחד כאשר צורונים הפעלת נקודת מוטציות של BRAFV600 proto-oncogenes, NRAS הם מתנה10. בהתאם לכך, ההמצאה של מעכבי קינאז יישוב הבטיח תועלת טיפולית לחולים הסובלים מלנומה גרורתית. מספר רב של ניסויים קליניים שנערכו לנקודה זו לא השיגה יתרון משמעותי עבור חולים עם מלנומה גרורתית. כמעט כל התגובות הן חלקיות, עם subpopulation של חולים מציג התנגדות ראשי. יתר על כן, הרכישה של התנגדות משני המובילים שמפסיק נצפתה ברוב המכריע של חולים11,12.
מתברר כי ניתוח של המצב מוטציה לבד אינה מספיקה כדי לפתח את האסטרטגיה הטיפולית החזק ביותר. כלי אבחון חדשים מהירה ואמינה נחוצים לתעד ולנתח באופן שיטתי את יכולת התגובה של התאים הסרטניים בודדים. הרוב המכריע של נתונים זמין כרגע על מלנומה אנושית הושגו מתרבויות תא מלנומה (2D) דו מימדי. תאים סרטניים, עם זאת, גדל ב- 3D לאפשר crosstalk המערכת בין סרטן הבדיל תא subpopulations, כמו גם בין תאים סרטניים ואת הרקמה הלא-טרנספורמציה מארח שמסביב. לכן, זה יהיה הכי טוב לשחזר את סביבת 3D שבו פותח מלנומה, כדי לשמש הקרנה פרה דגם13,14.

<table><tbody><tr><td>אלבומין בסרום עוברי (FCS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td>להוסיף 10% למדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td>1X לדלל ב-PBS</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific 61870010</td><td>לגידול קווי תאי מלנומה</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965062</td><td>לגידול פיברובלסטים ראשוניים</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>17105041</td><td>2U/ml, ממיסים ב-PBS</td></tr><tr><td>קולגן סוג I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>בדרך כלל מזנב חולדה, הריכוז צריך להיות 3.5-4 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>24 בארות מוסיף Nunclon&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>140629</td><td>8 ומיקרו; גודל נקבוביות m; השתמש בתוספות עומדות, לא תלויות!</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>צהוב</td></tr><tr><td>Gentamycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750060</td><td>להתמוסס ב-PBS</td></tr><tr><td>Keralife קרטינצייט בינוני</td><td>מערכות</td><td></td> תאים <td>אין להוסיף FCS או אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>קולגנאז</td><td>SERVA</td><td>17454</td> NB4 קרטינוציטים אנושיים <td>לנוער בדרגה סטנדרטית</td></tr><tr><td></td><td>מערכות תאים</td><td>FC-0007</td><td>חלופה להכנה עצמית</td></tr><tr><td>מפיברובלסטים אנושיים צעירים</td> של עורלה צעירה <td>מערכות תאים</td><td>FC-0001</td><td>חלופה להכנה עצמית מערלה צעירה</td></tr><tr><td>DMEM [+] 4,5 גרם/ליטר גלוקוז, [+] L- גלוטמין, [-] L- פירובט</td><td>גיבקו טכנולוגיות חיים</td><td>41965</td><td>מערבבים 1:1 עם בשר חזיר; s F-12 עבור MM בינוני; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; מערבבים 3:1 עם בשר חזיר; s F-12 עבור EGM בינוני</td></tr><tr><td>Ham&acute; s F-12 [+] L-גלוטמין</td><td>Gibco טכנולוגיות חיים</td><td>&nbsp; 21765-029</td><td>הוסף ל-DMEM ליצירת מדיום EGM ו-MM (ראה נתיב 15)</td></tr><tr><td>EGF&nbsp;</td><td>ג'יבקו טכנולוגיות חיים</td><td>&nbsp; 13247-051</td><td>הוסף 10 ננוגרם/מ"ל רק לדור EGM בינוני</td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Merck Chemicals</td><td>2381</td><td>הוסף 1.9 מ"מ לייצור EGM ו-3.8 מ"מ לדור MM בינוני</td></tr><tr><td>חומצה סלנית</td><td>Alfa Aesar</td><td>18851</td><td>הוסף 53 ננומטר לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Lilly</td><td>HI0219 Hum Pen 3 מ"ל 100 E.I./ml</td><td>הוסף 5 ומיקרו; גרם/מ"ל לייצור</td></tr><tr><td>אתנולמין</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' בינוני EGM ו-MM&nbsp;<td>E-0135</td><td>מוסיף 0.1 מ"מ לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>P-אתנולמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P-0503</td><td>מוסיף 0.1 מ"מ לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>Holo-Transferrine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T-0665</td><td>הוסף 5 ומיקרו; גרם/מ"ל לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>Triiodthyronine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-6397</td><td>הוסף 20 pM לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-088816</td><td>הוסף 0.4 ומיקרו; גרם/מ"ל לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>הוסף 10 ננומטר רק לדור מדיום EGM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3784</td><td>הוסף 15 מ"מ לדור EGM ו-MM מדיום</td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td>הוסף 1 מ"מ לדור EGM ו-MM מדיום</td></tr><tr><td>כולינכלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>C-7017</td><td>מוסיף 0.64 מ"מ לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>dFCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-0392 Lot 086K0361</td><td>מוסיף 2% לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A-9795</td><td>מוסיף 0.18 מ"מ ליצירת EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PromoCell</td><td>C-42209</td><td>מוסיף 7.25 מ"מ לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>סטרונציום-כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>255521</td><td>להוסיף 1 מ"מ לדור EGM ו-MM בינוני</td></tr><tr><td>אנטי ציטוקרטין 10 נוגדן</td><td>Dako</td><td>M7002</td><td>1:50</td></tr><tr><td>אנטי ציטוקרטין 14 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-53253</td><td>1:200</td></tr><tr><td>&nbsp; נוגדן אנטי למינין 5 סנטה</td><td>קרוז</td><td>SC-32794</td><td>1:50</td></tr><tr><td>נוגדן נגד פילגרין</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>MA5-13440</td><td>1:50</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי אינוולוקרין</td><td>נוגדנים אקריס</td><td>AM33368PU</td><td>1:50</td></tr><tr><td>עז פוליקלונלית משנית נגד עכבר IgG FITC שכותרתו</td><td>LifeSpan Biosciences</td><td>LS-C153907</td><td>1:50</td></tr><tr><td>עז פוליקלונלית משנית נגד עכבר IgG Cy3 מסומן</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-003</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>10236276001</td><td>1:100</td></tr></tbody></table>

מודל העור מלנומה organotypic 3d ספרואיד

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

שינוי ממאיר של מלנוציטים, תאי פיגמנט העור האנושי, גורם להיווצרות מלנומה, סרטן אגרסיבי ביותר עם פוטנציאל גרורתי מוגברת. לאחרונה, מונו-chemotherapies להמשיך לשפר על ידי טיפולים שילוב ספציפי מלנומה עם מעכבי קינאז יישוב. . עדיין, מלנומה גרורתית נשאר מחלה מסכנת חיים בגלל גידולים להפגין התנגדות ראשי או לפתח עמידות לטיפולים חדשניים, ובכך החזרת יכולת tumorigenic. על מנת לשפר את ההצלחה הטיפולית של מלנומה ממאירה, הקביעה של המנגנונים המולקולריים היוועצות עמידות נגד גישות הטיפול הקונבנציונלי הוא נחוץ; עם זאת, זה דורש מודלים חדשניים הסלולר במבחנה . . כאן, אנחנו מציגים במבחנה organotypic תלת מימד (3D) מלנומה ספרואיד מודל יכולים להתחזות הארכיטקטורה ויוו של מלנומה ממאירה, עשוי להצדיק תובנות חדשות אינטרה-tumoral כמו גם הגידול-פונדקאי אינטראקציות. המודל משלב מספר מוגדר של הבדיל ובוגרת מלנומה spheroids במודל לשיקום עור תלת-ממד מלא המורכב של תאי העור העיקרי. המצב הרכב ובידול הסלולר של spheroids מלנומה מוטבע הוא דומה לזה של מלנומה עורית גרורות vivo בתוך. באמצעות מודל ספרואיד מלנומה זה organotypic כמו תרופה הקרנת פלטפורמה עשויים לתמוך הזיהוי המגיבים נבחר טיפולים משולבים, בעוד חוסך את הנטל טיפול מיותר עבור הלא-המגיבים, ובכך מגדיל את היתרון של התערבויות טיפוליות.

טיפול מוצלח של מלנומה גרורות שיכול להיות מושפע קרוס-השיחה בין תאים סרטניים, כמו גם בין גידול התאים המארחים שאינו משתנה. המטרה של פיתוח מודלים organotypic של סרטן במבחנה היא לספק מערכות פרה למבחן מסכם את הדברים את הארגון 3D והמורכבות של מלנומה אנושיים ויוו. דבר זה מאפשר חקר ההשפעה הטיפולית על הגידול בתוך סביבה organotypic ואת ההשפעות השליליות על הרקמה שמסביב הראשי במקביל.
כדי לפתח את הדגמים הטובים ביותר של עור organotypic, האיכות של התאים הראשי היא קריטית. זה יתרון לשימוש fibroblasts העיקרי לנוער keratinocytes, כי הם בדרך כלל פחות מובחנים בהשוואה לתאי העור העיקרי למבוגרים. לעור נעורים תאים באפשרותך להיות מבודד העורלה לנוער, כפי שמתואר בסעיפים פרוטוקול 1-5, אך ניתן גם לרכוש מחברות fibroblasts העיקרי טרום לידתית, keratinocytes. אם רכישת, יש צורך סדר התאים מתורמים שונים כדי להימנע מתוצאות תורם ספציפי, למשל, רגישות סמים. פרוטוקול כל מוצג כערכת באיור3.
בקרת איכות של תלת-ממד מלא-עור מקבילות דורש ניתוח immunohistochemical. ניתן לקבל רושם ראשוני Hematoxylin-אאוזין (H &amp; E) צביעת פרפין משובצים קטעים (3 מיקרומטר). ניתוח מפורט של האיכות של בידול אפידרמיס ועל היווצרות הנדן הבזליים בין דרמיס לאפידרמיס דורש ניתוח immunohistochemical באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד סמן ריבוד באפידרמיס. דבר זה מאפשר הבחנה בין מובחן, מאוד שגשוג תאים ממוקם קרוב קרום הבסיס מאוד הבדיל ואת keratinized תאים בחלק הקרנית דרך היווצרות של שכבות עוריות ברורים בין . כפי שמוצג על ידי צביעת החיסון-היסטולוגית (איור 4), התמיינות keratinocytes ברחבי האפידרמיס של יכולה להיות מושגת הדומה לעור רגיל: בעיקר את התאים מובחן מהשכבות אפידרמיס תחתון (הרובד basale , הרובד קוצנית) כתם חיובי עבור קרטין 14, בעוד תאים הבדיל יותר מן הרבדים העל הבזליים (שכבה granulosum ו הקרנית) כתם חיובי עבור קרטין 10 ו- involucrin. בהתאם לכך, filaggrin מכתים יכול רק להיות שנצפו בתאים מאוד הבדיל של הקרנית. והכי חשוב, laminin 5 צביעת מגלה כי פרופריה הבזליים נוצר להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי של בנייה מחדש עור מלאכותי. זה מוכיח כי microenvironment organotypic בתקשורת נוצר בתאי מלנומה מארח או spheroids עבור הפיזיולוגיות וניתוח pathophysiologic.
לצורך מלנומה והתרופות הקרנה, בתאי מלנומה יחיד גם ניתן לשלב לתוך הדרמיס של העור מלא מקבילות כדי לאפשר דה נובו מלנומה הקן היווצרות18,19. לכן, בתאי מלנומה בשילוב עם ראשי fibroblasts ביחס של 5:1, centrifuged ביחד ב 200 גרם x במשך 5 דקות, resuspended, GNL לפני ערבוב עם קולגן. כתוצאה מכך, קינים תא מלנומה יהוו באופן ספונטני בתוך התא עורי. הניסיון שלנו רק תאים של הגידול גרורתי שלב קינים נאותה הטופס, בהשוואה בתאי מלנומה של RGP או VGP15. אחד החיסרון העיקרי של סוגים אלה של המודלים היא העובדה כי המספר והגודל של מלנומה קנים שנוצר לא ניתן לחזות, והם עשויים להשתנות בין בודדות העור בנייה מחדש, ללא תלות כל טיפול. לדוגמה, תאים 1,000 נזרע לתוך תא עורי עלול לקבל 10 קינים המורכב תאים 100 או 100 קנים בהיקף של 10 תאים כל (איור 5). משתנים ביולוגיים אלה מציגים שלושה ליקויים: ראשית, המספר והגודל של מלנומה קנים יצרו צפויות; שנית, גרורות ויוו בדרך כלל גדולים יותר מלנומה קינים ולהציג מגוון אינטרה-tumoral מורכבים יותר; שלישית, בשל מוגבלות תוחלת החיים של הגידול-קן מודלים, וטיפול מאותחלת מוקדם, כתוצאה מכך אלא מעכב גידול תוצר במקום לגרום רגרסיה של קנים הגידול הקיימים.
כדי להתגבר על מודלים אלה-העור ספרואיד מלנומה organotypic מגבלות ניתן להפיק. מאת culturing מלנומה גרורתית 250 תאים בתלייה ירידה של 14 ימים20, spheroids reproducibly נוצרות המורכב של מלנומה קיימא תאים עם קוטר הסופי של-500 מיקרומטר מחקה ללא הצגת מבנה קומפקטי vascularized הגידול צמתים, מיקרו-גרורות, או בין-נימי מיקרו אזורים של גידולים מוצקים21,22. באופן כללי, כל קו תא מלנומה מתאימה לדור של spheroids באמצעות התליה בשיטת; עם זאת, תאים שמקורם מתקדם יותר גידול גרורתי שלבים טופס spheroids מוצק יותר בהשוואה שורות תאים שמקורם התקדמות בשלבים המוקדמים, למשל, RGP.
עבור כמה תאים, זה יתרון על היווצרות ספרואיד הנכונה להגברת צמיגות של התליה ירידה בינונית תרבות. זו יכולה להיות מושגת על ידי התוספת של 10-50% מתיל-תאית למדיום תרבות. לפתרון מתיל-תאית מניות, החיטוי 1.2 g מתיל-תאית יחד עם פס מגנטי מערבבים בבקבוק זכוכית 100 מ. להוסיף 100 מ ל טרופה (60 ° C) בינונית ומערבבים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ו- h עוד 1-2-4 מעלות צלזיוס. Centrifuge הפתרון מניות עבור 2 h ב 5,000 x g ולאחסן את תגובת שיקוע צמיגה ב 4 ° C עד השימוש.
אימות תקינה של העור מלא מלנומה ספרואיד מודלים מסופק על ידי העובדה כי מספר מוגדר של מלנומה יכול spheroids - לפחות מבחינה סטטיסטית - ניתן לשלב פיברובלסט עורי/הקולגן אני לגרדום-יום 1 של הבנייה דגם העור, המאפשר אותם לפתח במשותף במהלך התמיינות עוריות לעוד 25-27 ימים. ניתן לנתח את התשואה של spheroids ישירות לאחר זריעה, מכיוון spheroids מופיעים כתמים לבנים בתוך שקופים עורי ג'ל, ניתן לראות ללא כל מכשיר ההגדלה (איור 2). כתוצאה מכך, דגם תלת-ממד העור נוצר נמלים מלנומה בוגרת spheroids, שהיה בתרבית במבחנה עבור סכום כולל של-42 ימים, מציג את הרמה הגבוהה ביותר של אינטרה-tumoral תא בידול15.
H &amp; E מכתים של המודל ספרואיד העור מלנומה חושף את המראה היסטולוגית ואת חלוקת תאי מלנומה spheroids דומה מאוד, לאחת vascularized שאינם מלנומה אנושית העור גרורות ויוו15 (איור 6 ). Subpopulations שני תאי מלנומה הם ניתן להבחנה ברורה בתנאים האלה: subpopulation proliferating היקפיים, subpopulation המרכזית בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מה שנקרא "נמק" מרכז. Immunohistochemically חי, מתרבים subpopulations ניתן להבחין באמצעות נוגדנים נגד דה מרקר התפשטות KI-67, ואילו תאים של המרכז נמק, ניתן לאבחן על ידי מכתים TUNEL15. הפיזור המסוים של הגידול תא subpopulations יש הצדקה לפי גודל ספרואיד (≥500 מיקרומטר), כתוצאה מחוסר חומרים מזינים וחמצן בחלק המרכזי שבו מצטברת פסולת קטבולי. בעקבות הפרוטוקול בתנאי כאן יאפשר את הדור של organotypic לשחזור ואמין עור בעובי מלא דגם עם מוטבע spheroids מלנומה אנושית המחקים גרורות העור מלנומה אנושית. יישומים של זה הדגם כלול בדיקות סמים, הקרנת רעלים, להשפיע על חומרים קוסמטיים או לייזר בטיפול על תוצר מלנומה, וטיפול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> איור 1 : טיפוח של בנייה מחדש של העור 3D organotypic שקוע בינונית ו- הממשק אוויר נוזלי. ביום 0 keratinocytes הראשי הם נזרע על גבי תא עורי המורכב fibroblasts הראשית מוטבע לתוך סוג הקולגן אני מטריקס. בנייה מחדש של העור 3D מעובד להישאר מתחת למים עם EGM למשך 7 ימים, ניתוק מהקיר הוספה והתחל מתכווץ. ביום 8 התוספות הן הועבר 6-ולס וטיפח בכל הממשק אוויר נוזלי כדי לאפשר ריבוד באפידרמיס. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> איור 2 : מלנומה spheroids מוטבע לתוך תא עורי מופיעים כתמים לבנים. בזמן הכנת תא עורי של בנייה מחדש העור תלת-ממד, מספר מוגדר של מלנומה spheroids ניתן להוסיף את סוג הקולגן פיברובלסט מערבבים. ברגע הג'ל עורי יש מלנומה spheroids הופכים לגלויים כמו כתמים לבנים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> איור 3 : ערכת בניית דגם organotypic תלת-ממד העור. הסרת רקמת שומן דוגמית העור וחותכים אותו לחתיכות קטנות יותר. הדגירה עם פתרון dispase בין לילה ב 4 ° C מקלה את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס. מבודד fibroblasts העיקרי keratinocytes צריך להיות מעובד בנפרד, שימוש בין המעבר 4-6 ו- 3-4, בהתאמה. לאחר מכן, הדור של דגם תלת-ממד העור ניתן להמשיך כמפורט בפרוטוקול. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> איור 4 : בנייה מחדש של העור 3D organotypic הראה רמה בידול דומה לעור רגיל האנושית. שעוות פרפין קטעי עור מקבילות (א) העור האנושי בהשוואה נורמלי (B) היו מוכתמים עבור הביטוי של keratins 14 (אדום: λ nmex 554; λem 568 nm) ו- 10, involucrin (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm), ו- laminin 5 (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm), וניתח עם מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. גרעין התא היו דמיינו מאת דאפי מכתים (כחול: λex 340 ננומטר; λem 488 ננומטר). Immunohistochemical בחינת תלת-ממד המלא-עובי העור מקבילות חשף נאות עוריות ריבוד ויוצרים שכבות נפרדות של האפידרמיס, כפי שניתן לראות עור אנושי רגיל. בעוד תאים באפידרמיס בשכבות הנמוכות צבעונית חיובי עבור קרטין 14, יותר הבדיל התאים משכבת הבסיס העל-הראה קרטין 10 involucrin מכתים. תאים מאוד קרוב הקרנית בא לידי ביטוי filaggrin. Laminin 5 מכתים מראה כי פרופריה הבזליים נוצרת להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי (לוח הנמוך). איור זה נלקח Voersmann. et al. 15 בעלי הרשאה. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> איור 5 : לא ניתן לחזות את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קנים. היווצרות הקן מלנומה דה נובו בתא עורי עור מלא מקבילות יכולה להיות מושגת על ידי ערבוב מספר מוגדר של מלנומה תאים עם fibroblasts הראשי כדי להטביע את שני סוגי תאים בסוג הקולגן אני מטריקס. ניתן רק לנתח את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קינים של בנייה מחדש עור תלת-ממד מבוגר לאחר כ 21 ימים. כמו שתוארו של שני מדגמים (A) ו- (B), המספרים והגדלים של מלנומה קינים עשויים להשתנות בין בנייה בודדות העור. כתוצאה מכך, זה קשה כדי לאמת את המודלים האלה וגם כדי לחזות את ההשפעה הטיפולית. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> איור 6 : מלנומה spheroids משולב לתוך העור מקבילות לסכם תכונות מפתח של מלנומה עורית האנושי גרורות. H &amp; E צבעונית פרפין מקטעים של גידול spheroids מוטבע לתוך העור מקבילות חשף spheroids לחלוק תכונות מפתח עם vascularized שאינם מלנומה עורית האנושי גרורות ויוו. Subpopulations שני תאים ניכרים בבירור: subpopulation ההיקפיים מגורים וחדר מרכזי subpopulation בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מרכז "נמק". הפיזור של הגידול תא subpopulations מובטחת על ידי גודל ספרואיד. דמות זו שונתה מ. Voersmann et al. 15 בעלי הרשאה. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

המטרה הכוללת של מודל עור ספרואיד מלנומה אורגנוטיפית תלת מימדית זו היא לסכם הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איבר או גידול in vivo תוך התאמה להתערבות ניסויית שיטתית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר המלנומה כגון אינטראקציה בין גידול למארח והתערבות טיפולית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקות את הארכיטקטורה התלת מימדית של גרורות שאינן כלי דם in vivo.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על איזה טיפול במלנומה מכיוון שהיא משקפת את ההטרוגניות של הגידול. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שאיכות התאים הראשוניים מכריעה ולא נעשה שימוש באנטיביוטיקה במהלך תהליך התא. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על איזה טיפול במלנומה מכיוון שהיא משקפת הטרוגניות של הגידול.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שטיפול נכון במודל עור המלנומה התלת מימדי חשוב מאוד. כדי להתחיל, תרבית תאי מלנומה 451LU באמצעות מדיום RPMI המכיל 10% FCS, על פי פרוטוקולי תרבית תאים כלליים. כדי ליצור ספרואידים של מלנומה, שטפו את תאי המלנומה המתורבתים ב-PBS.לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA פעם אחת ב- PBS. יש לדגור במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף חמישה מיליליטר RPMI המכילים 10% FCS כדי לנטרל את הטריפסין.לאחר מכן העבירו את מתלה התאים לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות לקצירת התאים. השעו מחדש את כדור התא ב-RPMI המכיל 10% FCS.לאחר מכן, ספרו את התאים, ודללו את תרחיף התאים לריכוז סופי של 10,000 תאים למיליליטר. השתמש ברב פיפטה אלקטרונית כדי ליצור 40 25 מיקרוליטר כתמים של תרחיף תאים על המשטח הפנימי של המכסה של צלחת תרבית תאים סטרילית שאינה דביקה בגודל 10 סנטימטר. לאחר מכן, הפוך את המכסה בתנועה מהירה וחלקה והניח אותו על צלחת תרבית התאים המכילה חמישה מיליליטר PBS.תרבית את הכלים התלויים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 14 ימים. חמישה ימים לאחר איתור הטיפה הראשוני, השתמש במתקן אלקטרוני כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של RPMI המכיל 10% FCS לכל טיפה. לאחר 10 עד 15 יום, קצרו את הספרואידים על ידי שטיפה עדינה מהמכסה בעזרת PBS.אוספים את הספרואידים בכלי תרבית תאים טרי שאינו דביק. כדי ליצור את המקבילה העורית של העור משחזר, הנח שמונה תוספות ממברנה בגודל מיקרומטר בצלחת תרבית תאים של 24 בארות. עבור כל תוספת, השעו מחדש 100,000 פיברובלסטים בתמיסת נטרול ג'ל.לאחר מכן, ערבבו במהירות את תרחיף הפיברובלסטים עם קולגן מסוג אחד ביחס של אחד לשלושה בנפח סופי של 500 מיקרוליטר מבלי ליצור בועות. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להוסיף את המתלה לכל תוספת. בתוך מכסה מנוע סטרילי, הניחו את התוספות בטמפרטורת החדר ללא מדיום למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'לים העוריים להתייצב.לאחר מכן, מכסים את הג'לים ב- DMEM ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של הלילה, הסר את ה-DMEM מהג'לים העוריים ושטף אותם ב-EGM למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס כדי ליצור את המקבילה האפידרמיסית של העור המשחזר. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להסיר את ה-EGM מהג'לים.לאחר מכן זרעו בזהירות 100,000 קרטינוציטים, מושעים מחדש ב-100 מיקרוליטר EGM על גבי כל ג'ל. דגרו את השחזורים למשך שעה וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לקרטינוציטים להיצמד לג'ל העור. בעזרת קצה פיפטה, הסר בזהירות את שאריות הג'ל מקיר ההכנסה.לאחר מכן, כסו כל שחזור ב-800 מיקרוליטר של EGM ותרבית למשך שבעה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. הסר בזהירות שאריות ג'ל מהקיר הפנימי בעזרת קצה פיפטה קטן ורחב. ביום השמיני, הניחו את התוספות לבארות נפרדות של צלחת שש בארות.לאחר מכן, הוסף 1.2 עד 1.4 של מדיום מלנומה גרורתי לכל באר כדי לכסות רק את בסיס העור המשחזר. לאחר מכן, דגרו במשך 10 עד 17 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. הוסף רק 1.2 עד 1.4 מ"ל של מדיום מלנומה גרורתי לכל באר כך ששחזור העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך הוא אינו מכוסה במדיום.כדי לשלב ספרואידים מלנומה במקביל העורי של שחזורי העור המלא, השתמש ב-PBS כדי לשטוף בזהירות את הספרואידים מהמכסה של צלחת תרבית תאי טיפה תלויה. עבור כל שחזור עור מלא, יש לאסוף 10 עד 20 ספרואידים בכלי תרבית תאים סטרילי שאינו דביק. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להסיר בזהירות עודפי PBS.לאחר מכן, שאפו את הספרואידים בנפח מינימלי של EGM. לאחר מכן העבירו אותם לנפח הנדרש של תמיסת נטרול ג'ל, המכילה 100,000 פיברובלסטים. עבור כל תוספת, מערבבים את התרחיף הספרואיד עם קולגן מסוג אחד ביחס של אחד לשלושה בנפח סופי של 500 מיקרוליטר.לבסוף, צור שחזורי עור אורגנוטיפיים מלאים כמתואר בפרוטוקול שתואר קודם לכן. עור אנושי רגיל מושווה לשחזור העור כדי לאמת את שחזור העור האורגנוטיפי התלת-ממדי. צביעת המטוקסילין אאוזין של קטעי הפרפין מראה כי הדרמיס והאפידרמיס של שחזור העור דומים לאלה שבעור רגיל.עור אנושי רגיל ושחזור עור מנותחים אימונוהיסטוכימית כדי להשוות את התמיינות האפידרמיס. צביעה חיסונית כנגד סמני ריבוד אפידרמיס, כלומר קרטין 14, קרטין 10 ואינבולוקרין ופילגרין מצביעה על רמות דומות של הבחנה בקרטינסייד בין שחזור העור לעור רגיל. צביעה חיסונית נגד למינין חמש מצביעה על כך שהלמינה הבסיסית נוצרת כדי לחבר פיזיולוגית את עמיתיהם האפידרמיסיים והדרמליים של העור המשחזר, בדומה לעור רגיל.צביעת המטוקסילין אאוזין של קטע הפרפין של שחזור עור מלנומה ספרואיד מצביעה על כך שההתפלגות התאית של ספרואידים מלנומה דומה לזו של גרורות עור מלנומה אנושיות שאינן כלי דם in vivo. בדיקה היסטולוגית מגלה נוכחות של תת-אוכלוסייה מתפשטת היקפית ותת-אוכלוסייה נמקית מרכזית של תאי המלנומה. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כ-40 יום, אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתאים ראשוניים באיכות הטובה ביותר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרי מלנומה לחקור את ההיענות במבחנה בסביבה מחקה in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מודל עור מלנומה אורגנוטיפית תלת מימדית אנושית.

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בדו"ח זה, אנו מתארים את העור תלת ממדי לשחזר מודל אשר מחקה העור האנושי באדריכלות הרכב. הפיזיולוגיה מלנוציט, התקדמות מלנומה גורל בתאי גזע עורי נחקרו באמצעות העור לשחזר מודל. המודל שימושית גם ככלי קליני להערכת תרופות.

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

בסרטון זה, תאי מלנומה שמקורם בבני אדם מושתלים באופן תת-עורי באזור האגף של עכבר מדוכא חיסון. מודל PDX מאפשר חקירה פרה-קלינית של תאי מלנומה המשחזרים טוב יותר את ההטרוגניות של הגידול ואת אגרסיביות המלנומה שנצפתה בתנאי in vivo.

מידול Xenograft הנגזר מהמטופל: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי מלנומה

סרטון זה מתאר את הטכניקה של יצירת ספרואידים תלת מימדיים בשיטת הטיפה התלויה באמצעות תאי מלנומה. המודל התלת-ממדי של מלנומה ספרואידית אורגנוטיפית (3D) שנוצר במבחנה יכול לתאר את ארכיטקטורת in vivo של מלנומה ממאירה ועשוי לספק תובנות לגבי אינטראקציות תוך-גידוליות.

שיטת Hanging Drop: טכניקה ליצירת ספרואידים תלת ממדיים למלנומה

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול המפורט ליצירת שחזורי עור אורגנוטיפיים תלת-ממדיים במבחנה לחקר התקדמות המלנומה. מודל עור זה מחקה הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איברים in vivo.

יצירת שחזורי עור מלא אורגנוטיפיים: הליך לביסוס מודל עור תלת ממדי באמצעות דגימות עור אנושיות

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

אנו מתארים שתי שיטות משלימות המשתמשות באינדיקטור מחזור התא של הפלואורסצנציה (FUCCI) וניתוח תמונה או ציטומטריית זרימה כדי לזהות ולבודד תאים באזורי העצירה הפנימיים של G1 ובאזורים החיצוניים המתפשטים של ספרואידים תלת מימדיים.

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

המטופל נגזר מבע (pdx) דגמים נוספים ביותר בסדר מלנומה מולקולרית תכונות ביולוגיות, הם ניבוי יותר של תגובת הטיפול לעומת רקמה פלסטית מסורתית התרבות מבוסס assays. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטית שלנו להקמת דגמי PDX חדשים ואפיון/ניסויים של דגמי PDX קיימים.

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

המודל הרומן תלת מימדי המבוסס על האינטראקציה הטרולימית של תאי הגידול והריטרותקיעות מסטרומה. כאן, אנו מציגים התרבות הcoculture של תאים סרטניים מסטרומה, הדמיה של הזמן, ו מיקרוסקופ קונפוקלית כדי להמחיש את היווצרות של spheroids. זה מודל תלת מימדי מציע פלטפורמה רלוונטית ללמוד אינטראקציות הגידול משתית ולבדוק therapeutics סרטן.

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים שמקורם בחולי מלנומה על ידי תרבית תרחיפים של תאים מנותקים מרקמות מלנומה טרייה. אורגנואידים אלה משחזרים בנאמנות גידולים ספציפיים למטופל במבחנה, ומציעים גישה חדשנית לחקר מנגנוני דיכוי החיסון של הגידול, בדיקות סקר לתרופות, מנגנוני עמידות לתרופות וגישות מעקב אחר סרטן.

חשיפת הזדמנויות טיפוליות עם מודלים אורגנואידים שמקורם בחולה מלנומה

למדו ליצור מודל עור תלת-ממדי אורגנוטיפי לספירואידים של מלנומה המחקה את מבנה הגידול והמורכבות התאית של מלנומה אנושית. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין גידול למארח ובדיקת טיפולים תרופתיים.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

גלה סרטונים נוספים