מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

המטרה הכוללת של מודל עור ספרואיד מלנומה אורגנוטיפית תלת מימדית זו היא לסכם הן את הארכיטקטורה והן את המורכבות הרב-תאית של איבר או גידול in vivo תוך התאמה להתערבות ניסויית שיטתית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר המלנומה כגון אינטראקציה בין גידול למארח והתערבות טיפולית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לחקות את הארכיטקטורה התלת מימדית של גרורות שאינן כלי דם in vivo.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על איזה טיפול במלנומה מכיוון שהיא משקפת את ההטרוגניות של הגידול. באופן כללי, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק מכיוון שאיכות התאים הראשוניים מכריעה ולא נעשה שימוש באנטיביוטיקה במהלך תהליך התא. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על איזה טיפול במלנומה מכיוון שהיא משקפת הטרוגניות של הגידול.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שטיפול נכון במודל עור המלנומה התלת מימדי חשוב מאוד. כדי להתחיל, תרבית תאי מלנומה 451LU באמצעות מדיום RPMI המכיל 10% FCS, על פי פרוטוקולי תרבית תאים כלליים. כדי ליצור ספרואידים של מלנומה, שטפו את תאי המלנומה המתורבתים ב-PBS.

לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA פעם אחת ב- PBS. יש לדגור במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוסף חמישה מיליליטר RPMI המכילים 10% FCS כדי לנטרל את הטריפסין.

לאחר מכן העבירו את מתלה התאים לצינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב -200 פעמים גרם למשך חמש דקות לקצירת התאים. השעו מחדש את כדור התא ב-RPMI המכיל 10% FCS.

לאחר מכן, ספרו את התאים, ודללו את תרחיף התאים לריכוז סופי של 10,000 תאים למיליליטר. השתמש ברב פיפטה אלקטרונית כדי ליצור 40 25 מיקרוליטר כתמים של תרחיף תאים על המשטח הפנימי של המכסה של צלחת תרבית תאים סטרילית שאינה דביקה בגודל 10 סנטימטר. לאחר מכן, הפוך את המכסה בתנועה מהירה וחלקה והניח אותו על צלחת תרבית התאים המכילה חמישה מיליליטר PBS.

תרבית את הכלים התלויים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 10 עד 14 ימים. חמישה ימים לאחר איתור הטיפה הראשוני, השתמש במתקן אלקטרוני כדי להוסיף 10 מיקרוליטר של RPMI המכיל 10% FCS לכל טיפה. לאחר 10 עד 15 יום, קצרו את הספרואידים על ידי שטיפה עדינה מהמכסה בעזרת PBS.

אוספים את הספרואידים בכלי תרבית תאים טרי שאינו דביק. כדי ליצור את המקבילה העורית של העור משחזר, הנח שמונה תוספות ממברנה בגודל מיקרומטר בצלחת תרבית תאים של 24 בארות. עבור כל תוספת, השעו מחדש 100,000 פיברובלסטים בתמיסת נטרול ג'ל.

לאחר מכן, ערבבו במהירות את תרחיף הפיברובלסטים עם קולגן מסוג אחד ביחס של אחד לשלושה בנפח סופי של 500 מיקרוליטר מבלי ליצור בועות. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להוסיף את המתלה לכל תוספת. בתוך מכסה מנוע סטרילי, הניחו את התוספות בטמפרטורת החדר ללא מדיום למשך 30 דקות כדי לאפשר לג'לים העוריים להתייצב.

לאחר מכן, מכסים את הג'לים ב- DMEM ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה של הלילה, הסר את ה-DMEM מהג'לים העוריים ושטף אותם ב-EGM למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס כדי ליצור את המקבילה האפידרמיסית של העור המשחזר. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להסיר את ה-EGM מהג'לים.

לאחר מכן זרעו בזהירות 100,000 קרטינוציטים, מושעים מחדש ב-100 מיקרוליטר EGM על גבי כל ג'ל. דגרו את השחזורים למשך שעה וחצי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לקרטינוציטים להיצמד לג'ל העור. בעזרת קצה פיפטה, הסר בזהירות את שאריות הג'ל מקיר ההכנסה.

לאחר מכן, כסו כל שחזור ב-800 מיקרוליטר של EGM ותרבית למשך שבעה ימים ב-37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. הסר בזהירות שאריות ג'ל מהקיר הפנימי בעזרת קצה פיפטה קטן ורחב. ביום השמיני, הניחו את התוספות לבארות נפרדות של צלחת שש בארות.

לאחר מכן, הוסף 1.2 עד 1.4 של מדיום מלנומה גרורתי לכל באר כדי לכסות רק את בסיס העור המשחזר. לאחר מכן, דגרו במשך 10 עד 17 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני. הוסף רק 1.2 עד 1.4 מ"ל של מדיום מלנומה גרורתי לכל באר כך ששחזור העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך הוא אינו מכוסה במדיום.

כדי לשלב ספרואידים מלנומה במקביל העורי של שחזורי העור המלא, השתמש ב-PBS כדי לשטוף בזהירות את הספרואידים מהמכסה של צלחת תרבית תאי טיפה תלויה. עבור כל שחזור עור מלא, יש לאסוף 10 עד 20 ספרואידים בכלי תרבית תאים סטרילי שאינו דביק. השתמש בפיפטה של פסטר כדי להסיר בזהירות עודפי PBS.

לאחר מכן, שאפו את הספרואידים בנפח מינימלי של EGM. לאחר מכן העבירו אותם לנפח הנדרש של תמיסת נטרול ג'ל, המכילה 100,000 פיברובלסטים. עבור כל תוספת, מערבבים את התרחיף הספרואיד עם קולגן מסוג אחד ביחס של אחד לשלושה בנפח סופי של 500 מיקרוליטר.

לבסוף, צור שחזורי עור אורגנוטיפיים מלאים כמתואר בפרוטוקול שתואר קודם לכן. עור אנושי רגיל מושווה לשחזור העור כדי לאמת את שחזור העור האורגנוטיפי התלת-ממדי. צביעת המטוקסילין אאוזין של קטעי הפרפין מראה כי הדרמיס והאפידרמיס של שחזור העור דומים לאלה שבעור רגיל.

עור אנושי רגיל ושחזור עור מנותחים אימונוהיסטוכימית כדי להשוות את התמיינות האפידרמיס. צביעה חיסונית כנגד סמני ריבוד אפידרמיס, כלומר קרטין 14, קרטין 10 ואינבולוקרין ופילגרין מצביעה על רמות דומות של הבחנה בקרטינסייד בין שחזור העור לעור רגיל. צביעה חיסונית נגד למינין חמש מצביעה על כך שהלמינה הבסיסית נוצרת כדי לחבר פיזיולוגית את עמיתיהם האפידרמיסיים והדרמליים של העור המשחזר, בדומה לעור רגיל.

צביעת המטוקסילין אאוזין של קטע הפרפין של שחזור עור מלנומה ספרואיד מצביעה על כך שההתפלגות התאית של ספרואידים מלנומה דומה לזו של גרורות עור מלנומה אנושיות שאינן כלי דם in vivo. בדיקה היסטולוגית מגלה נוכחות של תת-אוכלוסייה מתפשטת היקפית ותת-אוכלוסייה נמקית מרכזית של תאי המלנומה. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך כ-40 יום, אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש בתאים ראשוניים באיכות הטובה ביותר. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרי מלנומה לחקור את ההיענות במבחנה בסביבה מחקה in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור מודל עור מלנומה אורגנוטיפית תלת מימדית אנושית.