אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף
3 באוגוסט 2018
הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה שאלות מפתח בתחומי מחקר שונים, כגון איתור שיבוטים טרום סרטניים, הערכה פרוגנוסטית של חולי לוקמיה לאחר טיפול וזיהוי מוטציות פתוגניות פוטנציאליות בתורמי מח עצם. מי שידגים את ההליך הזה איתי יהיה ספנסר, הוא טכנאי במעבדה. סרטון זה מתאר כיצד לשלב את פרוטוקול הריצוף המתוקן בשגיאות עם כימיה של Illumina ופאנלים גנים זמינים מסחרית כדי לזהות וריאנטים חד-נוקלאוטידים משובטים ואינדלים קטנים ברגישות של אחד ל-10,000.
כדי לשלב את המזהים המולקולריים הייחודיים הנדרשים, מתאמי 16N i5 ו-i7 מותאמים אישית משתמשים ב-PCR. ראשית, הכינו את ה-Q5 Master Mix, המשתמש בפולימראז בעל נאמנות גבוהה יותר מהחלופה הזמינה מסחרית. לאחר מכן, עבור כל תגובה, שלב 37.5 מיקרוליטר של Q5 Master Mix, שישה מיקרוליטר של חמישה מתאמי 16N i5 מיקרומולריים, שהם המזהים המולקולריים הייחודיים, ושישה מיקרוליטר של מתאמי i7.
אם המטרה היא ריבוב, השתמש במתאמי i7 שונים בדוגמאות נפרדות. כעת, הפעל את ה-PCR באמצעות הפרמטרים הבאים: שלושים שניות ב-98 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ארבעה עד שישה מחזורים של עשר שניות ב-98 מעלות צלזיוס, שלושים שניות ב-66 מעלות צלזיוס ושלושים שניות ב-72 מעלות צלזיוס. סיים את התגובה בהארכה של שתי דקות ב-72 מעלות צלזיוס והחזק בארבע מעלות צלזיוס.
אז שני מחזורי ה-PCR שאתה צריך לעשות עליהם תלויים ככל הנראה בגודל של פאנל הגנים שבו אתה משתמש, מניסיוננו, PCR של ארבעה מחזורים מספיק אם לפאנל הגנים יש כ-1500 מסלולים שונים של אוליגואים ספציפיים לגנים, בעוד שפאנל עם כ-5 עד 600 זוגות אוליגוס דורש כשישה מחזורים של PCR. לאחר מכן, נקו את תגובות ה-PCR באמצעות חרוזים מגנטיים, הוסיפו 56.25 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים מגנטיים לכל מוצר PCR של 75 מיקרוליטר, ולאחר מכן העבירו כל תגובה לצינור נפרד של 1.5 מיליליטר בעל קשירה נמוכה, מעורבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות עשר פעמים, והמתינו חמש דקות. לאחר מכן, העבירו את התערובות למחזיק מגנטי, ותנו לסופרנטנטים להתנקות למשך שתי דקות.
לאחר מכן, הסר והשליך את הסופרנטנטים. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של 70% אתנול, המתן שלושים שניות ואז הסר את האתנול. חזור על שלב שטיפת אתנול זה פעם אחת, ולאחר מכן תן לחרוזים להתייבש באוויר למשך חמש דקות.
לבסוף, הסירו את הספריות ששונו מהחרוזים בעשרים מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, הנח את הצינורות על מתלה מגנטי כדי להפריד את החרוזים המגנטיים מהנוזל. ראשית, בצע דילול סדרתי פי עשרה של ספריות ECS מהשלב הקודם, עד לחלק אחד לכל 1,000 ברצועות PCR.
לאחר מכן, הכינו מאסטר מיקס בצינור של 1.5 מיליליטר. לכל תגובה, שלבו 10 מיקרוליטר של ddPCR EvaGreen Mix, 0.2 מיקרוליטר פריימר P5, 0.2 מיקרוליטר פריימר P7 ו-4.6 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן, הכניסו 15 מיקרוליטר של EvaGreen Master Mix לסט צינורות חדש, ולבסוף הוסיפו חמישה מיקרוליטר של מוצר נקי אחד עד 1,000 ECS ל-Master Mix.
לאחר מכן, הכינו טיפות PCR באמצעות מחולל הטיפות. ראשית, טען את הקסטה, צנרת 70 מיקרוליטר של שמן ליצירת טיפות לבאר הקסטה, שמן מסומן, ופיפט 20 מיקרוליטר מתערובת התגובה ddPCR לתוך הדגימה המסומנת היטב. לאחר מכן, כסו את הקסטה באטם גומי, והעמיסו אותה לתוך מחולל הטיפות, וכל יצירת הטיפות כדי להמשיך.
כעת, באמצעות פיפט רב-ערוצי, לאט, במשך חמש שניות, טען 45 מיקרוליטר של טיפות שנלקחו מכל באר קלטת, על לוחית PCR חדשה. לאחר מכן, אטום את לוחית ה-PCR בנייר אלומיניום. כעת, הגבירו את האות בטיפות באמצעות התנאים הבאים: חמש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 40 מחזורים של שלושים שניות ב-95 מעלות צלזיוס, ודקה אחת ב-63 מעלות צלזיוס, לאחר מכן, קררו את התגובה לארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות לפני שהעלו אותה ל-90 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ואז להחזיק בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכן את מכונת קורא הטיפות של תבנית ddPCR. בחר את הפרמטרים לכימות מוחלט, והשימוש ב-QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. לאחר מכן, העבירו את התגובות דרך קורא הטיפות.
לאחר השלמת ניתוח ddPCR, החל את אותם ספים מפלגים על כל דגימה. לאחר מכן, נרמל כל ספרייה למספר המולקולות הרצוי. התחל בביצוע תגובות של 50 מיקרוליטר, המורכבות מ-25 מיקרוליטר של Q5 Master Mix, שני מיקרוליטר של פריימר מיקרו-מולרי P5 אחד, שני מיקרוליטרים של פריימר מיקרו-מולרי P7 אחד ו-21 מיקרוליטר של ספריית DNA מנורמלת.
לאחר מכן, הפעל את ה-PCR באמצעות הפרמטרים הבאים:30 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 16 מחזורים של 10 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, שלושים שניות ב-66 מעלות צלזיוס, ושלושים שניות ב-72 מעלות צלזיוס, ואז שתי דקות ב-72 מעלות צלזיוס, והחזק בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, כמת את ריכוז ה-DNA בספריות, ואגד את הספריות בכמויות מולאריות שוות לריצוף, התמקד בערך בארבע ננו-מולר. כעת, רצף את ספריית ה-ECS המאגרת באמצעות פלטפורמת הרצף של Illumina, עם הגדרות הרצף הבאות:פעמיים 144 קריאות קצה זוגיות, שמונה מחזורים של אינדקס אחד ו-16 מחזורים של אינדקס שני.
ה-DNA של חולה עם מוטציה ב-GATA1, דולל ב-DNA גנומי מסחרי ב-VAF המקורי של 0.19. באמצעות הפרוטוקול המתואר, ECS הוכיח את עצמו כמותי לרמה של 1 עד 10,000 עבור וריאנט נוקלאוטיד בודד. לאחר מכן, דגימות פרווה של באפי מעשרים אנשים בריאים נותחו באמצעות פאנל ריצוף מסחרי המורכב מ-568 אמפליקונים.
לסיכום, 109 מוטציות סומטיות משובטות היו קיימות בשני השכפולים של נקודת זמן איסוף אחת לפחות עם שברי אלל וריאנטים הנעים בין 0.0003 ל-0.1451.21 מהמוטציות עם ייצוגים קוסמיים ידועים נבחרו וכל אחת מהן אומתה באמצעות PCR טיפתי דיגיטלי. כדי להדגים את רמת הביטוי המתוקנת של הפרוטוקול, נעשה שימוש בפאנל גנים מותאם אישית המורכב מ-415 גנים הידועים כקשורים לסוגי סרטן שונים, כדי לייצר ספרייה הבנויה מהאקסון הנפוץ ביותר של כל גן. רמת הביטוי של תעתיק בשפע נמוך הייתה ניתנת לשחזור בין שכפולים.
לאחר מכן נעשה שימוש ב-PCR טיפתי דיגיטלי כדי לאמת שישה גנים נבחרים עם ביטוי משתנה. השוואה מראה שרמת הביטוי של הגנים נלכדה בצורה נכונה על ידי פרוטוקול ECS, ללא צורך בנורמליזציה. לאחר ששלטת בטכניקה, ניתן לבצע טכניקה זו בנוחות תוך יום וחצי.
עיקר הזמן יהיה דגירה, וטיפול ידני גוזל כ-30-40% מהזמן הכולל הנדרש, תלוי בכמה דגימות החוקרים מעבדים בו זמנית. בעת ניסיון הליך זה, חשוב מאוד שתהיה ספריית ריצוף משוכפלת עבור אותה מדגם. זה ייתן לך יותר ביטחון שמוטציה בתדר נמוך היא חיובית אמיתית אם המוטציה עצמה היא ליבה עצמאית בשני השכפולים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע עניינים אחרים כגון ECS RNA על מנת לענות על שאלות כגון זיהוי תעתיק בשפע נמוך, או תעתיק היתוך. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בעיקר בתחום הממאירות המטולוגית, ואנו משתמשים בטכניקה זו כדי לחקור שיבוטים טרום-לוקמיים באנשים בריאים וכן כדי לזהות מחלה מינימלית שיורית בחולי לוקמיה שנמצאים בהפוגה.
סקירה
מאמר זה דן בשיטה לרצף מתוקן שגיאות המשפר את הדיוק של רצף דור הבא (NGS) על ידי הפחתת שיעור השגיאות שלו. הטכניקה מאפשרת זיהוי של מוטציות בשיעורי אלל משתנה נמוכים מאוד, מה שהופך אותה לחיונית עבור יישומים שונים במחקר.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- גנומיקה
- טכנולוגיות רצף
- זיהוי מוטציות
רקע
- לרצף דור הבא (NGS) יש שיעור שגיאות גבוה של בערך 0.5–2.0%.
- שיטות רצף מתוקן שגיאות יכולות להפחית את שיעור השגיאות הזה.
- זיהוי מוטציות נדירות הוא קריטי בתחומים כמו אונקולוגיה וגנטיקה.
- מזהי מולקולריים ייחודיים חיוניים לזיהוי מדויק של מוטציות.
מטרת המחקר
- להציג פרוטוקול לרצף מתוקן שגיאות באמצעות כימיה של Illumina.
- להדגים את הרגישות של השיטה בזיהוי וריאנטים חד-נוקלאוטידיים קלונליים.
- לאמת את האפקטיביות של הפרוטוקול בהקשרים מחקריים שונים.
שיטות ששימשו
- הכנת Q5 Master Mix עם פולימראז בעל נאמנות גבוהה.
- שימוש במזהי מולקולריים ייחודיים באמצעות מתאמים מותאמים אישית.
- הגברה PCR עם פרמטרים מחזוריים ספציפיים.
- PCR טיפתי דיגיטלי לכימות ואימות של מוטציות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוטציות מוצלח עם שיעורי אלל משתנה נמוכים כמו 0.0001.
- זיהוי 109 מוטציות סומטיות קלונליות בדגימות שונות.
- אימות מוטציות באמצעות PCR טיפתי דיגיטלי.
- הוכחת דיוק כמותי של שיטת הרצף המתוקן שגיאות.
מסקנות
- רצף מתוקן שגיאות משפר משמעותית את רגישות זיהוי המוטציות.
- השיטה ישימה בסביבות קליניות ומחקריות לניתוח גנומי.
- מחקרים נוספים יכולים להרחיב את השימוש בה בזיהוי וריאנטים גנטיים נדירים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Error-corrected sequencing (ECS) addresses a critical limitation in next-generation sequencing by reducing error rates to enable detection of mutations at variant allele fractions as low as 0.0001. This capability supports early detection of pre-leukemic clones and minimal residual disease monitoring in hematological malignancies, directly impacting therapeutic decision-making and patient stratification in oncology drug development. By providing quantitative, reproducible detection of rare clonal variants, ECS enhances predictive confidence in target validation and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting clonal somatic mutations at ultra-low frequencies, supporting biological de-risking of putative cancer targets.
- Operational Value: Provides quantitative variant allele fraction measurements that clarify pathway involvement and functional relevance of genetic alterations in disease models.
- Predictive Value: Improves confidence in target prioritization by distinguishing true low-frequency mutations from sequencing artifacts, reducing false-positive leads in target validation campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, error-corrected libraries compatible with Illumina sequencing, enabling scalable screening of large gene panels for somatic variant discovery.
- Quantitative Output: Delivers precise variant allele fraction data that supports assay standardization and cross-laboratory reproducibility in mutation detection workflows.
- Platform Reuse: Facilitates multiplexed sample processing via patient-specific indices, increasing throughput and reducing per-sample cost in large-scale genotyping efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to monitoring minimal residual disease in leukemia patients post-treatment, aligning with clinically relevant endpoints in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mutation detection with preclinical validation through quantitative tracking of clonal dynamics over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing sensitive detection of emergent resistant clones during preclinical therapy studies.
Pipeline & Workflow Integration
ECS fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in hematologic malignancy models where clonal evolution informs therapeutic response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling sensitive detection of pre-leukemic clones in healthy donor samples, clarifying origins of malignancy.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative sequencing data with high reproducibility, facilitating reliable compound screening in genetically defined models.
- Analytics: Generates precise variant allele fraction measurements and digital droplet PCR-validated outputs that allow accurate comparison of mutant burden across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through monitoring of minimal residual disease, a key biomarker in leukemia therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping capability for longitudinal tracking of clonal dynamics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mutation detection, increasing confidence in genetic biomarkers and therapeutic targets.
- Operational Value: Standardizes library preparation with unique molecular identifiers, improving reproducibility and reducing batch effects in sequencing data.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by detecting resistance mutations at clinically relevant thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on sensitivity to detect emergent clonal variants in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular library preparation, PCR optimization, and digital droplet PCR validation for accurate rare variant detection.
- Depends on access to high-fidelity polymerases, magnetic bead purification systems, and droplet generation instrumentation for library processing.
- Necessitates cross-team standardization of index design and PCR cycle numbers based on gene panel complexity to ensure multiplexing compatibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to RNA sequencing or fusion transcript detection beyond DNA-based variant calling.
- Involves practical limitations related to input DNA quality and quantity, as low-yield samples may require increased PCR cycles that could introduce bias.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Incorporating i5 and i7 Adapters onto Error-corrected Sequencing Libraries
3:36
Quantifying the Libraries with QX200 Digital Droplet PCR (ddPCR)
6:14
Amplifying and Normalizing the Libraries for Sequencing
7:37
Results: Mutation-calling with Error-corrected Sequencing (ECS)
9:14
Conclusion
