בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות מהמדיום של Schistosoma japonicum בוגר מתורבת במבחנה. שיטה זו יכולה לבודד ביעילות EV במדיום תרבית במבחנה מ-Schistosoma japonicum בוגר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד ביעילות שלפוחית חוץ-תאית ממדיום תרבית חוץ גופית לטווח קצר, מה שיכול למזער את הלחץ שעלול לגרום להפרשת EV לא פיזיולוגית.

ההדגמה תהיה על ידי ג'ונטאו ליו, טכנאי מהמעבדה שלי. אוספים את הטפילים בכוס של 500 מיליליטר, ושוטפים אותם היטב אך בעדינות שלוש פעמים באמצעות 200 מיליליטר PBS חם. שמור על שטיפות קצרות, והשתמש במשקעי כוח הכבידה כדי להפריד בין הטפילים.

לאחר מכן, על כלים של 90 מילימטר, צלחת כ -200 זוגות תולעים למנה. בכלי יש לשטוף את הטפילים פעמיים נוספות באמצעות משקעי כוח הכבידה. עבור שטיפות אלה, השתמש במדיום RPMI חם בתוספת עט-סטרפטוק.

החלף את הכביסה השנייה ב -40 מיליליטר מהמדיום ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, תרבו את הטפילים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר שעתיים, העבירו את המדיה מהצלחות לצינורות צנטריפוגה, ואז אספו את הביצים ופסולת התולעים בטמפרטורה של 2,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, אספו והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. לאחר מכן, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון, ואסוף את התמיסה המסוננת לשקית דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 3.5 קילודלטון. לאחר מכן, דיאליזה של התמיסה באמצעות תמיסה של 8%PEG8000 בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

שלב זה חשוב להגדלת התשואה של שלפוחיות חוץ-תאיות. למחרת, העבירו את תמיסת הדיאליזה לצינור חדש, והוסיפו 0.5 נפחים של מגיב בידוד האקסוזום הכולל. מערבבים את התמיסה עד שהיא הומוגנית, ודוגרים על כחמש מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת בבוקר, צנטריפוגה את התערובת בחום של 15,000 גרם למשך שעה בטמפרטורה של כחמש מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת ה-EVs בשני מיליליטר PBS. סביר להניח שהגלולה לא תהיה גלויה.

לניתוח כתמים מערביים, קבע תחילה את ריכוז החלבון של הדגימה, כגון באמצעות בדיקת BCA. לאחר מכן, הכינו 10 עד 20 מיקרוגרם של רכבים חשמליים ב-22.5 מיקרוליטר של מאגר RIPA. לאחר מכן, מוסיפים 7.5 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 4, ומחממים את התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

לאחר הטיפול בחום, הפרד את חלבוני השלפוחית החוץ-תאית על ג'ל 12% SDS-PAGE. לאחר הפעלת הג'ל, החלבונים מועברים לקרום PVDF. בדוק את הממברנה עם נוגדנים נגד CD63 בדילול של 1 עד 1,000.

לאחר מכן, טפל בקרום עם IgG-HRP נגד ארנב בדילול של 1 עד 5,000. כעת, השתמש במגיב לזיהוי ECL כדי לפתח את הממברנה, והמשך עם ניתוח על מערכת הדמיה כימילומינסנציה. התחל בהעברת חמישה מיקרוגרם של דגימה לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה מפוליפרופילן, והתאם את הנפח ל-12 מיליליטר עם מדיום RPMI-1640.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-110,000 גרם למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הכינו תרחיף שלפוחית חוץ-תאית פי 2 על ידי הוספת מיליליטר אחד של C מדלל לגלולה.

השעו מחדש את הגלולה בעזרת פיפטינג עדין. כעת, הכינו תמיסת צבע 2X טרייה. הוסף שני מיקרוליטר של הצבע האתנולי PKH67 למיליליטר אחד של C מדלל בצינור מיקרופוגה, וערבב היטב.

לאחר מכן, צבעו את הדגימה על ידי ערבוב שתי התמיסות יחד ודגירת התערובת בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, עצרו את הצביעה על ידי הוספת ארבעה מיליליטר FBS והמתינו דקה נוספת. לאחר מכן, הוסף מדיום RPMI-1640 כדי לכוונן את עוצמת הקול ל-12 מיליליטר, וסובב את המתלה כדי לבודד את השלפוחיות המוכתמות.

הסר והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הרכבים החשמליים המסומנים ב-PKH67 ב-12 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. לאחר מכן, חזור על הצנטריפוגה, אך הפעם אסוף את השלפוחיות במיליליטר אחד של PBS.

לבדיקת הספיגה, הכינו תרביות לילה של תאי יונקים בצלחות של שש בארות. למחרת בבוקר, הוסיפו חמישה מיקרוגרם של שלפוחיות עם תווית PKH67 לכל באר, והמשיכו בתרבית במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם PBS פעמיים.

לאחר מכן, תקן את התאים למשך 15 דקות, שטוף אותם פעמיים עם PBS והכתים אותם ב-DAPI לפני ההדמיה. סכיסטוזומים בשלב הכבד נאספו מארנבים 28 יום לאחר ההדבקה. לאחר מכן נאספו שלפוחיות חוץ-תאיות מתולעי הסכיסטוזומים ונותחו.

גודל החלקיקים שלהם, כפי שנקבע על ידי ניתוח ננו-חלקיקים של מלברן, נע בין 100 ל-400 ננומטר, כאשר עיקר האוכלוסייה קרוב ל-220 ננומטר. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור גילה שהשלפוחיות החוץ-תאיות עגולות ובקוטר של בין 100 ל-200 ננומטר. ניתוח Western Blotting הצביע על כך שהשלפוחיות החוץ-תאיות המבודדות זוהו באמצעות נוגדנים CD63, שהוא סמן שלפוחית חוץ-תאי טיפוסי.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שלפוחיות חוץ-תאיות המסומנות PKH67 שהופנמו על ידי תאי שיבוט NCTC 1469 הראתה כי השלפוחיות החוץ-תאיות הופצו בעיקר בציטופלזמה של תאים מקבלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד EV במדיום תרבית במבחנה מ-Schistosoma japonicum בוגר.