Name: בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למדו לבודד שלפוחיות חוץ-תאית מתרבית של תולעים בוגרות Schistosoma japonicum. הפרוטוקול ממזער מתח ומאפשר אפיון פיזיולוגי מדויק של ה-EVs לחקר ביולוגיה טפילית מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה היה, בחלקו או במלואו, נתמך על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31472187 ו- 31672550), אגרונומיה ו תוכנית חדשנות טכנולוגית של האקדמיה הסינית למדעי החקלאות.

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית של מכון מחקר וטרינרי שנגחאי, האקדמיה הסינית למדעים חקלאי (מספר היתר: SHVRIAU-14-0101).
1. תרבות במבחנה של Schistosomes
הערה: Schistosomes מייצגים של חומרים מסוכנים. העובדים יש ללבוש כפפות גומי בכלל פעמים כאשר טיפול תולעים, המתלים schistosomal או אחרים הקשורים חומרים ביולוגיים. ניו זילנד ארנבים נדבקו בנגיף ~ 2,000 cercariae באמצעות חשיפה בטן. Schistosomes בשלב הכבד היו שנאספו ארנבים נגוע japonicum S. cercariae ב- 28 ימים לאחר הפגיעה על ידי זלוף של הכבד וורידים מצע המעי העליון. ההליכים של תולעת אוסף צריכה להפנות אליהם בפרסומים קודמים דיווח על מחקרים עכברים18.
<ol><li>לאסוף טפילים בתוך 500-mL. רוחצים אותם ביסודיות את x 3 בעדינות עם 200 מ של טרופה (37 מעלות צלזיוס) PBS (pH 7.4).</li>
	<li>הפרד ~ 200 זוגות תולעת על כל צלחת פטרי 90 מ מ. לאחר מכן לשטוף ביסודיות הטפילים, בעדינות 2 x עם 50 מ של טרופה (37 ° C) RPMI-1640 תרבות בינוני המכיל 100 U של פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין.</li>
	<li>לשמור על טפילים ב- 40 מ של טרופה RPMI-1640 תרבות בינונית ללא אנטיביוטיקה ב 37 מעלות צלזיוס מתחת 5% CO2 -צפיפות של תולעת ~ 5 זוגות /mL עבור 2 h ב- 90 מ מ פטרי צלחת. הערות: המדיום RPMI 1640 אינו אמור להכיל סרום, אחרת יהיה הציג אקסוגני שלפוחית חוץ-תאית.</li>
</ol>2. מראש שטופלו תנאי מדיה
<ol><li>לאסוף את המדיום תרבות, ואז centrifuge המדיום ב 4 ° C ב g × 2,000 למשך 30 דקות להסיר את ביצי התולעת הטגמנטום פסולת.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים ולסנן ואז הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>לאסוף את פתרון מסונן בשקית dialyzed (משקל מולקולרי ניתוק: 3.5kD), ואז dialyze את הפתרון באמצעות פתרון 8% PEG8000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הערות: השלב זה חשוב להעשיר את SjEVs להגדלת התשואה של בידוד SjEVs.</li>
</ol>3. בידוד של SjEVs
<ol><li>להעביר את הפתרון dialyzed צינור חדש ולאחר מכן להוסיף 0.5 נפחי הכימית בידוד מוחלט exosome.</li>
	<li>מערבבים את הפתרון על ידי vortexing או pipetting למעלה ולמטה כדי להבטיח ההומוגניות של הפתרון.</li>
	<li>דגירה התערובת ב 2 מעלות צלזיוס 8 מעלות למשך הלילה.</li>
	<li>Centrifuge את התערובת ב g × 15,000 עבור h 1-2 ° C עד 8 ° C.</li>
	<li>האחות וזורקים את תגובת שיקוע. הערות: EVs הכלולים בגדר בחלק התחתון של הצינור (לא גלוי ברוב המקרים).</li>
	<li>Resuspend בגדר EVs ב 2 מ של PBS ולאחר מכן אחסן את הפתרון EVs ב-80 מעלות צלזיוס עד ניתוח נוסף.</li>
</ol>4. אפיון של EVs מאת סופג המערבי
<ol><li>לקבוע ריכוז חלבון הדגימה SjEVs, למשל, על ידי BCA וזמינותו.</li>
	<li>הכינו 10-20 µg של EVs במאגר ריפה 22.5 µL. לאחר מכן להוסיף 7.5 µL של 4 x טעינת מאגר וחום במשך 5 דקות ב 95 ° C.</li>
	<li>להפריד חלבונים SjEVs על ידי ג'ל מרחביות-דף 12%.</li>
	<li>להעביר את החלבונים PVDF ממברנה, ואז בדיקה עם נוגדנים anti-CD63 (1:1, 000 דילול), ואחריו חיטוט עם הארנב אנטי איג-HRP (1:5, 000 דילול).</li>
	<li>השתמש ריאגנט לזיהוי ECL לפיתוח ממברנה, לזהות את הסימנים chemiluminescence מערכת הדמיה.</li>
</ol>5. אפיון של EVs מאת במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים
<ol><li>להוסיף 2 µL של SjEVs מבודדים רשתות מצופים formvar ל- 200 עם רשת שינוי, אז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>כתם עם 2% חומצה Phosphotungstic עבור 1 דקות, ואז לאפשר לו להתייבש בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לטעון את הרשתות אל בעל מדגם של מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, נחשפים בקרן אלקטרון kV 80 עבור לכידת תמונה.</li>
</ol>6. SjEVs תווית עם PKH67 ואת וזמינותו ספיגת תא
הערות: כל השלבים הבאים בוצעו בטמפרטורת החדר (20-25 ° C), אלא אם צוין אחרת.
<ol><li>העברת µg 5 SjEVs פתרון לתוך צינור פוליפרופילן התחתון חרוט ולכוונן את העוצמה 12 מ על-ידי הוספת RPMI 1640 בינוני.</li>
	<li>Centrifuge את SjEVs ב g × 110,000 במשך 90 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה SjEVs.</li>
	<li>לאחר צנטריפוגה, תשאף היטב את תגובת שיקוע. הערה: לצבוע ethanolic PKH67 צריכים לא להתווסף ישירות בגדר SjEV, כמו זה יביא מכתים הטרוגנית ואת הכדאיות תא מופחת.</li>
	<li>להכין פתרון ההשעיה EV 2 x על-ידי הוספת 1 מ"ל של Diluent C בגדר SjEV; כדי להבטיח פיזור מלאה, resuspend עם pipetting עדין.</li>
	<li>לפני צביעת בדו Diluent, הכן טרי 2 x צבע פתרון על ידי הוספת 2 µL של הפתרון צבע ethanolic PKH67 1 מ"ל של Diluent C בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן ולערבב היטב כדי לפזר.</li>
	<li>להוסיף במהירות של 1 מ"ל של x 2 EV ההשעיה (שלב 6.4) עד 1 מ"ל של 2 x צבע פתרון (שלב 6.5) ומיד מערבבים המדגם על-ידי pipetting.</li>
	<li>דגירה התערובת בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות.</li>
	<li>הפסק ההכתמה על-ידי הוספת 4 מיליליטר FBS ולאחר מכן תקופת דגירה של 1 דקות.</li>
	<li>הוסף RPMI1640 בינוני לכוונן את עוצמת הקול מ ל 12 ולאחר מכן צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע והוסף בינוני RPMI1640 resuspend את PKH67 הנקרא SjEV כדורי.</li>
	<li>צנטריפוגה ב g × 110,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות לשטוף פעם אחת ולאחר מכן להוסיף PBS כדי resuspend את כדורי SjEVs.</li>
</ol>7. תא SjEVs ספיגה Assay
<ol><li>תאים בתרבית של זרע כמו NCTC לשבט 1469 תאים או HEK293T תאים ב- 6-ובכן צלחות (2 × 105 תאים לכל טוב), התרבות התאים בן לילה.</li>
	<li>מוסיפים 5 µg SjEVs מתויג PKH67, ואז התרבות תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-4 h.</li>
	<li>לאחר דגירה, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעמיים.</li>
	<li>לתקן את התאים עם 4% פתרון פורמלדהיד למשך 15 דקות, לשטוף פעמיים יותר עם PBS.</li>
	<li>כתם תא גרעינים עם 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).</li>
	<li>לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ זריחה.</li>
</ol>

<ol><li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+Extracellular+Vesicles%3A+Biogenesis%2C+RNA+Cargo+Selection%2C+Content%2C+Release%2C+and+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li>
<li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+of+helminths%3A+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).</li>
<li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cancer%3A+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes%3A+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li>
<li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).</li>
<li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen%2C+Fasciola+hepatica%3A+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li>
<li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25421927">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488(2014).</li>
<li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li>
<li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Res%22%5BJournal%5D)">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li>
<li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li>
<li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li>
<li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26616523">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319(2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885(2016).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).</li>
<li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+miRNAs%3A+roles+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

מחקרים שנעשו לאחרונה על EVs הוכיחו את schistosome ש-evs לשחק תפקיד חשוב בפתוגן-פונדקאי אינטראקציות3,9,12,16. כתובת נוספת פונקציות התקינה שלהם, זה חיוני כדי לבודד EVs מן schistosomes. כאן, אנו מתארים שיטה חלופית עבור בידוד SjEV. שיטה זו מניבה בגודל מגוון רחב של SjEVs, מ- 100 ננומטר 400 nm, ב מבוגרים ס japonicum. וזמינותו ספיגת תא הבאות הצביעו EVs מבודד תחת פרוטוקול המתואר הופנמו בהצלחה ...

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם אוכלוסיה של קטן מאוגד-קרום שלפוחית אנקפסולציה עם חלבונים, ליפידים ו חומצות גרעין שונות. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי EVs לשחק תפקיד מכריע תקשורת, מעורבים בוויסות תהליכים פיזיולוגיים רבים, לרבות פיתוח תא, ויסות מערכת החיסון, אנגיוגנזה תא העברה2, 3,4,5. לצבירת ראיות מציין כי EVs, במחזור exosomes, ואת המטען שלהם miRNA מייצג פוטנציאל סמנים ביולוגיים של מחלות מסוימות6.
מספר חד-תאיים כגון Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi, לישמניה spp-, הוכחו להיות מסוגל להפריש EVs; helminths בנוסף נמצאו להפריש EVs לתוך החיים המארח7. EVs טפיליות הוכחו להיות מעורב קיומו של זיהום, פתוגניות8ו חסין תקנה9. מחקרים אחרונים שהיו בשימוש schistosomes 10,שני mansoni עלקת הבילהרציה (S. mansoni)11 ו ס japonicum12 הראו, למבוגרים schistosomes מפרישים exosome דמויי שלפוחית שעשויים להיות מעורב בהוראות פונקציונלי של תהליכים ביולוגיים ספציפיים.
עד כה, היו בשימוש מספר שיטות כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית, כגון ultracentrifugation, אולטראפילטרציה13, השימוש של ריאגנטים מבוסס פולימר, גודל-הדרה, ו- immunoaffinity בידוד. אלה שיטות שונות בעלי משלהם-יתרונות ומגבלות14. באופן כללי, ultracentrifugation נחשב לשיטת תקן הזהב שלפוחית בידוד. עם זאת, שיטה זו סובל המגבלה של EV פוטנציאליות צבירה14.
ב- schistosomes, כמה שיטות דווחו לבידוד EV: אלה כוללים את השימוש המסחרי EV בידוד ערכת16 עבור מספר שלבים (ביצים16,12,11,ultracentrifugation10 schistosomula11,12,10,schistosomes בוגרים17). בהתחשב בעובדה. שלפוחיות זעירות הן של מגוון רחב של גודל בין ננומטרים מאות אלפי ננומטר, פיתחנו שיטה חלופית המשלבת עם השימוש של ספסל צנטריפוגה אולטראפילטרציה, ערכת בידוד EV מסחרית כדי לבודד את EVs מ עלקת הבילהרציה japonicumלמבוגרים. EVs מבודד בדרך כלל בעל קוטר של 100-400 ננומטר, הופנמו בהצלחה על ידי תאים הנמען.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגיב בידוד אקסוזום מוחלט (ממדיה של תרבית תאים)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות S. japonicum</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>לתיוג Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>לתרבית טפילים</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&mu; m מסנן מזרק</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin צינורות דיאליזה Thermo</td><td>SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100159&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&trade; אימובילון וסחר; מצע HRP כימי מערבי (ECL)</td><td>פישר מדעי</td><td>WBKLS0100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ערכת BCA</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 נוגדנים</td><td>סנגון ביוטק</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 רשת</td><td>טד פלה</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פוספוטונגסטית</td><td>טד פלה</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>אנטי עכבר IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>שיבוט NCTC 1469 תאים</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-9.1 ומסחר;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE מערכת הדמיה כימית</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>היטאצ'י</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מים</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor צנטריפוגה&nbsp;</td>צנטריפוגה <td>אפנדורף</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>אופטימה L-100 XP חממת אולטרה-צנטריפוגה</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td>Zeiss Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

חוץ-תאית שלפוחית (EVs) הם עלי הלוואי קרומיים שלפוחית שפורסמו על ידי מגוון רחב של תאים לתוך microenvironment חוץ-תאית. EVs לייצג אוכלוסייה של שלפוחית הטרוגנית, אשר גודל נע בין 40 ו- 1,000 ננומטר. ראיות המצטבר ציינו כי EVs תפקיד חשוב רגולטוריות פתוגן-פונדקאי אינטראקציות. הבנה עמוקה של schistosome EVs צריך לספק תובנות לגבי המנגנונים אינטראקציות schistosome-מארח, המאפשר פיתוח של אסטרטגיות הרומן נגד בילהרציה. כאן, אנו שואפים המשך מחקר EVs פונקציות ב- schistosomes על-ידי הצגת פרוטוקול להצפנה בידוד ואפיון של EVs מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum (S. japonicum). EVs הם בודדו אותנו מהמתרחש in vitro לקשרי תרבות בינוני באמצעות צנטריפוגה בשילוב עם ערכת בידוד exosome מסחרי. מבודדים japonicum ס EVs (SjEVs) בדרך כלל בעלי קוטר של 100-400 ננומטר, מאופיינים על ידי שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית החיוורים ומכתים המערבי. השימוש PKH67 צבע התווית על-ידי SjEVs הוכיחה כי SjEVs הם לנחלתו של התאים הנמען. בסך הכל, פרוטוקול שלנו מספק שיטה חלופית עבור בידוד EVs מ schistosomes למבוגרים; SjEVs מבודדים עשוי להיות מתאים אנליזה פונקציונלית.

כדי לכמת את התשואה של SjEVs מבודדים באמצעות פרוטוקול המתואר, השתמשנו BCA חלבון assay כדי לגשת ריכוז חלבון SjEVs מבודדים schistosomes למבוגרים 28 יום. כפי שמוצג בטבלה 1, ריכוז חלבון SjEV נע בין 208 µg אל µg 250 לכל 100 מ של מדיום (טבלה 1). גודל החלקיקים, כפי שנקבע על ידי ניתוח nanoparticle מלוורן, ציין כי SjEVs מבודדים נע בין 100 ננומטר 400 nm, עם האוכלוסייה הגבוה ביותר בסביבות 220 nm בגודלם (איור 1). אפיון נוסף SjEVs על ידי ב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור חוץ-תאית שלפוחית (EVs) בידוד במבחנה בינוני בתרבית מ למבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות מהמדיום של Schistosoma japonicum בוגר מתורבת במבחנה. שיטה זו יכולה לבודד ביעילות EV במדיום תרבית במבחנה מ-Schistosoma japonicum בוגר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לבודד ביעילות שלפוחית חוץ-תאית ממדיום תרבית חוץ גופית לטווח קצר, מה שיכול למזער את הלחץ שעלול לגרום להפרשת EV לא פיזיולוגית.ההדגמה תהיה על ידי ג'ונטאו ליו, טכנאי מהמעבדה שלי. אוספים את הטפילים בכוס של 500 מיליליטר, ושוטפים אותם היטב אך בעדינות שלוש פעמים באמצעות 200 מיליליטר PBS חם. שמור על שטיפות קצרות, והשתמש במשקעי כוח הכבידה כדי להפריד בין הטפילים.לאחר מכן, על כלים של 90 מילימטר, צלחת כ -200 זוגות תולעים למנה. בכלי יש לשטוף את הטפילים פעמיים נוספות באמצעות משקעי כוח הכבידה. עבור שטיפות אלה, השתמש במדיום RPMI חם בתוספת עט-סטרפטוק.החלף את הכביסה השנייה ב -40 מיליליטר מהמדיום ללא אנטיביוטיקה. לאחר מכן, תרבו את הטפילים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך שעתיים. לאחר שעתיים, העבירו את המדיה מהצלחות לצינורות צנטריפוגה, ואז אספו את הביצים ופסולת התולעים בטמפרטורה של 2,000 גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, אספו והעבירו את הסופרנטנט לצינור טרי. לאחר מכן, סנן את הסופרנטנט דרך מסנן מזרק של 0.22 מיקרון, ואסוף את התמיסה המסוננת לשקית דיאליזה עם חתך משקל מולקולרי של 3.5 קילודלטון. לאחר מכן, דיאליזה של התמיסה באמצעות תמיסה של 8%PEG8000 בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.שלב זה חשוב להגדלת התשואה של שלפוחיות חוץ-תאיות. למחרת, העבירו את תמיסת הדיאליזה לצינור חדש, והוסיפו 0.5 נפחים של מגיב בידוד האקסוזום הכולל. מערבבים את התמיסה עד שהיא הומוגנית, ודוגרים על כחמש מעלות צלזיוס למשך הלילה.למחרת בבוקר, צנטריפוגה את התערובת בחום של 15,000 גרם למשך שעה בטמפרטורה של כחמש מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו והשליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את גלולת ה-EVs בשני מיליליטר PBS. סביר להניח שהגלולה לא תהיה גלויה.לניתוח כתמים מערביים, קבע תחילה את ריכוז החלבון של הדגימה, כגון באמצעות בדיקת BCA. לאחר מכן, הכינו 10 עד 20 מיקרוגרם של רכבים חשמליים ב-22.5 מיקרוליטר של מאגר RIPA. לאחר מכן, מוסיפים 7.5 מיקרוליטר של מאגר טעינה פי 4, ומחממים את התערובת בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.לאחר הטיפול בחום, הפרד את חלבוני השלפוחית החוץ-תאית על ג'ל 12% SDS-PAGE. לאחר הפעלת הג'ל, החלבונים מועברים לקרום PVDF. בדוק את הממברנה עם נוגדנים נגד CD63 בדילול של 1 עד 1,000.לאחר מכן, טפל בקרום עם IgG-HRP נגד ארנב בדילול של 1 עד 5,000. כעת, השתמש במגיב לזיהוי ECL כדי לפתח את הממברנה, והמשך עם ניתוח על מערכת הדמיה כימילומינסנציה. התחל בהעברת חמישה מיקרוגרם של דגימה לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה מפוליפרופילן, והתאם את הנפח ל-12 מיליליטר עם מדיום RPMI-1640.לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-110,000 גרם למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, שאפו בזהירות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הכינו תרחיף שלפוחית חוץ-תאית פי 2 על ידי הוספת מיליליטר אחד של C מדלל לגלולה.השעו מחדש את הגלולה בעזרת פיפטינג עדין. כעת, הכינו תמיסת צבע 2X טרייה. הוסף שני מיקרוליטר של הצבע האתנולי PKH67 למיליליטר אחד של C מדלל בצינור מיקרופוגה, וערבב היטב.לאחר מכן, צבעו את הדגימה על ידי ערבוב שתי התמיסות יחד ודגירת התערובת בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. לאחר מכן, עצרו את הצביעה על ידי הוספת ארבעה מיליליטר FBS והמתינו דקה נוספת. לאחר מכן, הוסף מדיום RPMI-1640 כדי לכוונן את עוצמת הקול ל-12 מיליליטר, וסובב את המתלה כדי לבודד את השלפוחיות המוכתמות.הסר והשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן, השעו מחדש את הרכבים החשמליים המסומנים ב-PKH67 ב-12 מיליליטר של מדיום RPMI-1640. לאחר מכן, חזור על הצנטריפוגה, אך הפעם אסוף את השלפוחיות במיליליטר אחד של PBS.לבדיקת הספיגה, הכינו תרביות לילה של תאי יונקים בצלחות של שש בארות. למחרת בבוקר, הוסיפו חמישה מיקרוגרם של שלפוחיות עם תווית PKH67 לכל באר, והמשיכו בתרבית במשך שעתיים עד ארבע שעות. לאחר הדגירה, הסר את המדיום ושטוף את התאים עם PBS פעמיים.לאחר מכן, תקן את התאים למשך 15 דקות, שטוף אותם פעמיים עם PBS והכתים אותם ב-DAPI לפני ההדמיה. סכיסטוזומים בשלב הכבד נאספו מארנבים 28 יום לאחר ההדבקה. לאחר מכן נאספו שלפוחיות חוץ-תאיות מתולעי הסכיסטוזומים ונותחו.גודל החלקיקים שלהם, כפי שנקבע על ידי ניתוח ננו-חלקיקים של מלברן, נע בין 100 ל-400 ננומטר, כאשר עיקר האוכלוסייה קרוב ל-220 ננומטר. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור גילה שהשלפוחיות החוץ-תאיות עגולות ובקוטר של בין 100 ל-200 ננומטר. ניתוח Western Blotting הצביע על כך שהשלפוחיות החוץ-תאיות המבודדות זוהו באמצעות נוגדנים CD63, שהוא סמן שלפוחית חוץ-תאי טיפוסי.מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שלפוחיות חוץ-תאיות המסומנות PKH67 שהופנמו על ידי תאי שיבוט NCTC 1469 הראתה כי השלפוחיות החוץ-תאיות הופצו בעיקר בציטופלזמה של תאים מקבלים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד EV במדיום תרבית במבחנה מ-Schistosoma japonicum בוגר.

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.

מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל

מאמר זה מציג שיטות ליצירה, טיהור ובדיקת כימות של שלפוחיות. Caenorhabditis...

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

כאן אנו מתארים את העשרת שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית אופטימלית.

שיטת העשרה לבועיות חוץ-תאיות קטנות שמקורן ברקמת סרטן הכבד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים שמקורם בטחול עכברים באמצעות שילוב של עיכול עם קולגן מסוג I ואולטרה-צנטריפוגה.

בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר

פרוטוקול זה נועד לבודד ולטהר שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד (SkM-EVs) מרקמות שרירי מכרסמים באמצעות ניתוק מכני, דיסוציאציה אנזימטית, סינון ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית. זה מפגין עקביות ואמינות. ה- SkM-EV המבודדים מספקים תובנות לגבי הומאוסטזיס שרירים ומחלות, עם יישומים פוטנציאליים כסמנים ביולוגיים אבחוניים או כלי טיפול.

בידוד אנזימטי של שלפוחיות חוץ-תאיות של שרירי השלד

כאן, אנו מתארים תנאי תרבית חוץ גופית , בידוד וייצור מוגבר של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) מ-Echinococcus granulosus. הרכבים החשמליים הקטנים התאפיינו בפיזור אור דינמי ובמיקרוסקופ אלקטרונים שידור. הספיגה על ידי תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם והאפנון הפנוטיפי שלהם נחקרו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וציטומטריית זרימה.

בידוד וספיגת תאים דנדריטיים של שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מ-Echinococcus granulosus

פרוטוקול זה מתאר את בידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות משרירי השלד של העכברים וממח עצם באמצעות עיכול אנזימטי וכרומטוגרפיה של הרחקת גודל, ומאפשר שחזור שניתן לשחזור של שברים מועשרים בוסיקולות מרקמות מורכבות מבנית ובעלות תפוקה נמוכה לניתוח מולקולרי במורד הזרם.

בידוד וזיקולות חוץ-תאיות קטנות משריר השלד של עכברו וממח עצם באמצעות כרומטוגרפיה של הוצאת גודל

טרנספורמציה Cercarial ו במבחנה טיפוח Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosoma ביצים mansoni הם לגירוי חזק מסוג T helper 2 (Th2) בתגובה החיסונית, מאפיין של דלקת טפיל, אסטמה ודלקת אלרגית. פרוטוקול זה מנצל ס mansoni ביצה הזרקת ליצור CD4 תגובה ציטוקינים Th2-Induced דלקת בריאה, המאופיינת היווצרות גרנולומה ריאות סביב הביצה, eosinophilia והפעלה מקרופאג חלופי.

שימוש ביצים מ<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; כמו<em&gt; ב-vivo</em&gt; דגם של דלקת ריאות הנגרמת helminth

למדו לבודד שלפוחיות חוץ-תאית מתרבית של תולעים בוגרות Schistosoma japonicum. הפרוטוקול ממזער מתח ומאפשר אפיון פיזיולוגי מדויק של ה-EVs לחקר ביולוגיה טפילית מתקדמת.

בידוד ושלפוחיות אפיון של חוץ-תאית מן הבוגרים עלקת הבילהרציה japonicum

גלה סרטונים נוספים