Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד חלבון ציטוזולי הנקשר לרצף ספציפי הממוקם במולקולת RNA בתאי מזותליומה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביולוגיה של RNA, כגון אם חלבון קושר RNA חזוי יכול לקשור אדנוזין או רצף עשיר באורידין בתעתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלימה את האפיון הפונקציונלי של אלמנטים מייצבים או מערערי יציבות המוערכים על ידי בדיקת מדווח.

תדגים את הטכניקה הזו ד"ר ילנה קרסויה-ראקיץ', פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוטוקול, השג תאי ACC-MESO-4 שהוכנו בעבר עם מפגש של 80 עד 90%. שאפו את המדיום, שטפו את התאים עם 15 מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט 1X, או PBS, ושאבו את ה-PBS.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגרו על בקבוק התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. הוסף שבעה מיליליטר של מדיום RPMI-1640 בתוספת מים, אסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר וסובב אותם ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיום, והשעו מחדש את כדור התא עם 1.5 מיליליטר של 1X PBS.

לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. סובב את התאים שוב ב -500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא עם 1.5 מיליליטר 1X PBS קר כקרח, וסובבו את התאים ב-500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.

השליכו את הסופרנטנט, והעריכו את הנפח הארוז של כדור התא על ידי השוואת הצינור המכיל את גלולת התא עם צינור של 1.5 מיליליטר עם 10, 20, 50 ו-100 מיקרוליטר של 1X PBS. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח, או CER I, בתוספת שני מיקרוליטרים של מעכב פרוטאינאז 1X. מערבל במרץ את הגלולה למשך 15 שניות, ודגר את הצינור על קרח למשך 10 דקות.

הוסף 11 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח II, או CER II, מערבולת נמרצת למשך חמש שניות, ודגירה על הצינור למשך דקה אחת על קרח. מערבל את הדגימה במרץ במשך חמש שניות, וצנטריפוגה את הצינור ב-16,000 פעמים גרם למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור הנקי והמקורר מראש על קרח.

השעו מחדש את הגלולה הנותרת ב-100 מיקרוליטר של מגיב מיצוי גרעיני קר כקרח, או NER, בתוספת מיקרוליטר אחד של מעכב פרוטאינאז, ומערבולת נמרצת למשך 15 שניות. דגרו את הדגימה על קרח למשך 40 דקות, ומערבולת כל 10 דקות למשך 15 שניות. צנטריפוגה את הצינור ב 16, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות.

העבירו את הסופרנטנט, שהוא חלק החלבון הגרעיני, לצינור נקי ומקורר מראש. מדוד מיד את ריכוז החלבון בשיטה הביסינצ'ונינית. לאחר מכן, הכינו 25 מיקרוליטר של תמציות ציטוזוליות וגרעיניות.

הקפיאו את החומרים הללו על ידי הנחתם בחנקן נוזלי למשך חמש שניות, ואחסנו אותם ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס. העבירו חמישה מיקרוליטרים של בדיקות RNA של 10 מיקרו-מולריות, לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה דקים בנפח 0.5 מיליליטר, ודגרו אותם במכונת PCR בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מניחים את הצינורות מיד על קרח.

לתגובה אחת של 30 מיקרוליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת שהוכנה בעבר לצינור המכיל RNA. הוסף בזהירות 15 מיקרוליטר PEG 30% לתגובה, והשתמש בקצה טרי כדי לערבב את התגובה. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס.

למחרת, הכינו את הריאגנטים. הוסף 70 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לצינורות התגובה לתיוג RNA. הוסף 100 מיקרוליטר אלכוהול כלורופורם-איזואמיל, ומערבולת קצרה וסובב את הדגימה ב-13,000 פעמים גרם למשך שלוש דקות.

הסר בזהירות רק את השלב העליון. הימנע מלגעת בשלב התחתון. העבירו אותו לצינור חדש נטול נוקלאז, בנפח 1.5 מיליליטר.

הוסף 10 מיקרוליטר של נתרן כלורי חמש מולארי, מיקרוליטר אחד של גליקוגן ו-300 מיקרוליטר של 100% אתנול קר כקרח. מניחים את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוסף 300 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח, וצנטריפוגה שוב ב -13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט לחלוטין, וייבשו את הכדור באוויר למשך 15 דקות.

השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. דגרו את ה-RNA ב-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, והניחו אותו על קרח. הנח את ה-RNA המסומן על קרח במהלך השלב הבא של שטיפה מוקדמת של החרוזים המגנטיים של סטרפטווידין.

שטיפה מוקדמת של 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין לכל 50 פיקומולים של RNA. מערבולת את הצינור עם חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין למשך 15 שניות. לאחר מערבולת מהירה, הסר 200 מיקרוליטר לתוך צינור Safe-Lock נקי בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות קצות פיפטה חתוכים.

לאחר מכן, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי כך שהחרוזים יתאספו בצד הצינור, והמתינו דקה אחת. הסר את נוזל ההשעיה. כדי לשטוף את החרוזים, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 400 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 0.1 מולרי, תמיסת נתרן כלורי 0.05 מולארי, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים.

הנח את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי והמתן דקה אחת. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים עם 200 מיקרוליטר נתרן כלורי 100 מילי-מולרי, ומסירים את הסופרנטנט.

הוסף 200 מיקרוליטר של טריס של 20 מילי-מולארי, השהה מחדש את החרוזים על ידי פיפטינג והנח את הצינור על המעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר לכידת RNA 1X והשהה מחדש חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין על ידי מערבולת קצרה.

הסר 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין, והוסף אותם לכל צינור RNA מסומן באמצעות קצה פיפטה חתוך. דגרו את הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת. לאחר שהשפופרת הייתה על המעמד המגנטי במשך דקה אחת, הסירו את הסופרנטנט.

הוסף לחרוזים 50 מיקרוליטר של טריס 20 מילי-מולר, והשעה. לאחר מכן, הנח את הצינורות במעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט.

הוסף 100 מיקרוליטר של חוצץ קושר RNA חלבון 1X לחרוזים, והשהה אותם מחדש. לאחר מכן, הנח את הצינורות בחזרה למעמד המגנטי. לאחר שהצינורות היו במעמד במשך דקה אחת, אספו את הסופרנטנט.

הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאסטר מיקס B, השעו מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה, והימנעו מיצירת בועות. דגרו צינורות תגובה למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס על רולר. עברו לשלבי הכביסה והשטיפה.

הנח את הצינורות במעמד מגנטי, אסוף את הזרימה והעביר אותה לצינור חדש. פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X על החרוזים, תלייה בעדינות, החזר אותם למעמד, המתן דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים.

הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים המגנטיים, ערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגירה על שייקר צינורות. הנח את הצינורות במעמד מגנטי, המתן דקה אחת ואסוף דגימה. מניחים על קרח, ומשתמשים בו לניתוח במורד הזרם.

כדי להדגים את טוהר השברים הגרעיניים/ציטוזוליים, נותחו חלבונים על ידי Western Blot, שהראה כי אלפא-טובולין זוהה רק בשבר הציטוזולי, וחלבון PARP זוהה רק בשבר הגרעיני. הפליטה מבדיקת ה-UTR ARE התלת-ראשונית CALB2 הדגימה קשירה של R אנושי ונעדרה בפליטה מהגשושית המוטנטית ובבדיקת ה-RNA הלא קשורה, הקושרת את החלבון המגיב לברזל. כדי להדגים עוד יותר את הספציפיות בין ה-UTR התלת-ראשוני CALB ל-R האנושי, הממברנה נבדקה עם נוגדן אנטי-מזותלין, וכל שלוש דגימות ה-eluate לא הראו נוכחות של מזותלין, מה שמצביע על כך שמוטיב ה-ARE המייצב בתוך CALB2 UTR תלת-ראשוני יכול לקשור באופן ספציפי חלבון R אנושי.

צביעת Coomassie של הג'ל מראה כי כמויות שוות של חלבונים שימשו לדגירה עם שלושת בדיקות ה-RNA השונות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה נוספת ממוקדת חלבון, כמו משקעים חיסוניים של חלבון נתון, על מנת לענות על שאלה נוספת, כמו איזה רצף נקשר אליו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור שותפים אינטראקטיביים אפשריים של RNA ספציפי.