Name: Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: למדו ללכוד חלבונים ציטופלזמיים הקושרים לרצפי RNA ספציפיים בתאי מזותליומה ACC-MESO-4 באמצעות תיוג desthiobiotin. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבוני קישור ל-RNA וחקר אינטראקציות RNA-חלבון בביולוגיית RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענק שוויצרי Sinergia קרן המדע הלאומית CRSII3 147697, Stiftung לדנציג Krebsforschung לאומנות Krebsliga ציריך.

1. הכנת חלבון Cytosolic וגרעיני שבר
<ol><li>צלחת 4 x 106 ACC-MESO-4 תאים בקבוקון תרבות תא T150 גדל RPMI - 1640 בינוני בתוספת 10% FBS, x 1 פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ). כאשר תאים מגיעים זרימה של 80-90% (~5-5.5 x 106 תאים), להמשיך עם חלבון החילוץ של שבר גרעינית, cytosolic. הערה: ACC-MESO-4 תאים בטור היה המתקבלים מרכז BioResource RIKEN11.</li>
	<li>האחות בינוני, לשטוף את התאים על-ידי הוספת 15 מ"ל של PBS 1 x, להטות את הצלחת בעדינות מספר פעמים, מחוק לגמרי מגניב 1 x. להוסיף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA דגירה את הבקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. הערה: תראו התאים במיקרוסקופ לחיפוש ניתוק; אם עדיין מחובר ברז הבקבוקון נגד בכף יד 3 פעמים.</li>
	<li>להוסיף 7 מ של RPMI-1640 בינוני בתוספת 10% FBS, 1 x פניצילין/סטרפטומיצין (100 x) ו- 2 מ מגלוטמין (200 מ מ), לאסוף את התאים בשפופרת 15 מ"ל, ספין למטה ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>האחות בינוני, resuspend תא גלולה עם 1.5 מ של 1 x PBS, לאחר מכן להעביר התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL. ספין למטה ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך תגובת שיקוע. הערה: משלב זה ואילך, לבצע את כל השלבים צנטריפוגה ב 4 ° C ולשמור כל ריאגנטים על קרח.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא קר כקרח 1.5 מ של 1 x PBS וזורקים ספין למטה התאים ב 500 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות את תגובת שיקוע. הערה: הסכומים הנדרשים הועידה אני, השני CER ו נר ריאגנטים הם 10, 0.55 ו- 5 כרכים של גלולה תא מוערך ארוז נפח, בהתאמה; הפרוטוקול הבא מבוסס על ההנחה נפח של 20 µL. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט CER אני.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח (CER אני) בתוספת 2 µL 1 x proteinase מעכב, למשל, לדלל 1 טבליה של מעכב פרוטאז (חינם EDTA) ב- 500 µL של מים כדי להשיג 100 x מניות. כמות זו של ריאגנט CER אני מספיקה כדי lyse µL 20 של גלולה תא ארוז נפח.<ol>
<li>כדי להעריך צניפה ארוז נפח התאים, להשוות את הצינור המכיל בגדר תא עם צינור 1.5 mL מלא עם µL 10, 20, 50 או 100 ל- PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspend בגדר תא על-ידי נמרצות vortexing הצינור עבור 15 s דגירה הצינור על קרח במשך 10 דקות להוסיף 11 µL של ריאגנט החילוץ cytoplasmic כקרח II (CER II) אל הרכבת התחתית, נמרצות מערבולת עבור 5 s, דגירה 1 דקות על קרח.</li>
	<li>מערבולת נמרצות במשך 5 s ו צנטריפוגה הצינור ב- 16,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להעביר את תגובת שיקוע הצינור טרום מקורר נקי על קרח. תגובת שיקוע הוא השבר cytoplasmic זה נוספים המשמשים את הניסוי RNA-הנפתח.</li>
	<li>Resuspend בגדר הנותרים ב 100 µL של ריאגנט החילוץ גרעיני קרח (נר) בתוספת 1 µL של proteinase מעכב (100 x), נמרצות מערבולת 15 s. אנו ממליצים להכין רק את הכמות הנדרשת של ריאגנט נר עם מעכבי פרוטאז.</li>
	<li>דגירה המדגם על קרח למשך 40 דקות עם vortexing ומדי פעם 15 s (כל 10 דקות).</li>
	<li>Centrifuge הצינור ב- 16,000 x g עבור 10 דקות להעביר את תגובת שיקוע (זהו השבר חלבון גרעיני) לרכבת התחתית טרום מקורר נקי.</li>
	<li>המשך מיד על ידי מדידת ריכוז חלבון בשיטת bicinchoninic (BCA) (ראה טבלה של חומרים). כדי לשלוט על חלבון הטוהר של כל שבר, לבצע immunoblotting (איור 1) נגד α-טובולין (זיהוי חיובי רק ב השבר cytosolic), Poly ADP-ריבוז פולימראז - PARP (זיהוי חיובי רק ב השבר הגרעין). להמחשת חלבון, עיין בסעיף 4.</li>
	<li>על מנת לשמור על פעילות החלבון. והמדינה מקורית שלהם, להכין 25 µL של aliquots של תמציות cytosolic וגרעיני. Snap-הקפאת אלה aliquots על-ידי הצבתם חנקן נוזלי עבור 5 s ומאגר ישירות ב- 80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. תיוג של RNA עם Desthiobiotin
<ol><li>הגששים RNA מסחרית מסונתז, HPLC מטוהרים. Resuspend במים נטולי נוקלאז-10 מיקרומטר. הערה: רצפים בדיקה מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>השתמש pmol 50 של RNA לפי התגובה RNA-הנפתח. הפשרת ולשמור כל ריאגנטים על קרח חוץ עבור פג 30%, נהגה תווית 3' הסופית של RNA oligo.</li>
	<li>העברת µL 5 של 10 הגששים RNA מיקרומטר, כאנטי CALB2 3' UTR (הם), CALB2 3' UTR (mtARE), והכעס Unrelated-RNA (), לתוך 0.5 mL קיר דק microcentrifuge צינורות, דגירה במכונת ה-PCR ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק במקום הצינורות מיד על קרח. הערה: השלב זה חשוב, כפי שהיא מקדמת את הנגישות של המכשיר RNA עבור תיוג רוגע.</li>
	<li>לתגובה 30 µL יחיד, להוסיף הצינור המכיל RNA המיקס 10 µL הבאים: 3 µL של נוקלאז מים חינם, 3 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 1 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 1 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ) , ו- 2 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL). הערה: כדי להכין מיקס מאסטר א 3 דגימות עודף (3.2), לערבב µL 9.6 של נוקלאז מים חינם, 9.6 µL של 10 x רנ א ליגאז התגובה מאגר, µL 3.2 של RNase מעכב (40 U/µL), µL 3.2 של Desthiobiotinylated Cytidine Bisphosphate (1 מ מ), ו- 6.4 µL של T4 RNA ליגאז (U 20/µL).</li>
	<li>להוסיף בזהירות 15 µL של פג 30% להתגובה. השתמש עצה נוספת כדי לערבב את התגובה. דגירה התגובה בין לילה ב-16 ° c</li>
	<li>למחרת, להכין את הדברים הבאים: 5 M NaCl (רעננה/נוקלאז חינם), כלורופורם: אלכוהול isoamyl ב- 24:1 יחס (למשל, לפי התגובה - 96 µL כלורופורם וב µL 4 isoamyl אלכוהול), אתנול 100% קר כקרח, אתנול 70% קר כקרח.</li>
	<li>להוסיף 70 µL של מים נטולי נוקלאז הצינורות התגובה תיוג-RNA. להוסיף 100 µL של כלורופורם: isoamyl אלכוהול, מערבולת בקצרה. ספין למטה ב 13,000 x g עבור 3 מינימלית הסר בזהירות רק את השלב העליון ואת העברת צינור ללא נוקלאז mL 1.5; להימנע מלגעת השלב התחתון.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של NaCl 5 מ', µL 1 של גליקוגן µL 300 של אתנול 100% קר כקרח. מקם את הצינור ב-20 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. הערה: בשלב זה, הניסוי ניתן המשיך למחרת היום.</li>
	<li>צנטריפוגה-13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות להתעלם בקפידה את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. הוסף µL 300 של אתנול 70% קר כקרח, צנטריפוגה שוב ב 13,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר (15 דקות). Resuspend בגדר ב 20 µL של נוקלאז ללא מים. הערה: להמשיך עם ה-RNA-הנפתח באותו יום.</li>
	<li>דגירה את הרנ א ב 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ומניחים על קרח. מניחים את לוחיות ההסבר-RNA על קרח במהלך השלב הבא של קדם כביסה של חרוזים מגנטי streptavidin. הערה: זמן דגירה ארוך עשוי לפגום החללית ה-RNA.</li>
</ol>3. ה-RNA-חלבון הנפתח
<ol><li>
הדגירה עם desthiobiotin-RNA ושרשרות streptavidin-מגנטי כביסה קדם
	<ol>
<li>השתמש µL 50 של streptavidin beads מגנטי לכל 50 pmol RNA. עם זאת, זה צריך להיות מוטבת בהתאם הניסוי.</li>
		<li>מערבולת ברכבת התחתית עם חרוזי streptavidin-מגנטית 15 s, ובמהירות µL הסר 200 (מיקס מאסטר; מספיק תגובות 3 + 1) לתוך מנעול כספת צינור נקי mL 1.5 באמצעות חתך טיפים פיפטה. המקום את הצינורית על דוכן מגנטי כך החרוזים לאסוף על הצד של הצינור ולחכות דק 1. הסר הנוזל resuspension.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים, להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 400 של 0.1 M NaOH, 0.05 M NaCl פתרון בעדינות pipet לאורך מספר פעמים. מקם את הצינור בחזרה על הדוכן מגנטי. חכה 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה שוב.</li>
		<li>לשטוף את החרוזים עם µL 200 מ"מ NaCl. הסר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL של 20 מ מ טריס (pH 7.5), resuspend חרוזים מאת pipetting, למקם את הצינורית על הדוכן מגנטי, לחכות 1 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע. חזור על השלב.</li>
		<li>להסיר את הצינור מן הדוכן מגנטי, להוסיף µL 200 1 x מאגר לכידת RNA, resuspend beads מגנטי streptavidin על ידי vortexing בקצרה. להסיר µL 50 של beads מגנטי streptavidin ולהוסיף כל שפופרת הנקרא-RNA באמצעות טיפ פיפטה לחתוך. דגירה הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
איגוד של חלבון ל RNA
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>µL 50 מ מ 20 טריס (pH 7.5) להוסיף החרוזים, resuspend על ידי pipetting. למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לחכות 1 דקות והסר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה.</li>
		<li>להוסיף 100 µL 1 x מאגר מחייב חלבון-RNA החרוזים, resuspend על ידי pipetting.</li>
		<li>בינתיים, מכינים את התערובת הבאה: µL 10 של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, 30 µL של גליצרול 50%, 50 µg של חלבונים cytoplasmic, ונטולת נוקלאז מים עד 100 µL. הערה: להכין מיקס מאסטר B 3 דגימות עודף (3.3) כדלקמן: 33 µL של 10 x מאגר מחייב חלבון-RNA, µL 99 של 50% גליצרול, 165 µg של חלבונים cytoplasmic ומים ללא נוקלאז עד 330 µL. לשמור את הצינורית של מיקס מאסטר B על קרח.</li>
		<li>למקם את הצינורות מעמד מגנטי, לחכות 1דקות. ולאסוף את תגובת שיקוע. להוסיף 100 µL של מיקס מאסטר B, resuspend על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה, הימנע מיצירת בועות. דגירה התגובה צינורות עבור 60 דקות ב 4 ° C על גלגלת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כביסה ו • תנאי
	<ol>
<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, לאסוף את תגובת שיקוע (וזה לזרום - מטרים), ולהעביר לתוך צינור חדש. הערה: שמור זה מטרים על הקרח לניתוח בשלב מאוחר יותר.</li>
		<li>פיפטה µL 100 1 x שטיפת מאגר על החרוזים, resuspend בעדינות, להחזיר לתוך העמדה מגנטי, לחכות 1 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע. חזור על שלב זה פי 2.</li>
		<li>להוסיף 40 µL • תנאי המאגר החרוזים מגנטי, לערבב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה-37 מעלות צלזיוס על מטרף צינור (950 סל ד) למשך 30 דקות.</li>
		<li>למקם את הצינורות עמדה מגנטי, המתן 1 דקות, ולאחר איסוף הדגימה eluted (אשר eluate - E). הצב בקירור והשתמש לניתוח במורד הזרם. הערה: בשלב זה, כל נבדק בדיקה RNA מורכב (FT) זרימה דרך הדגימה eluate (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. לזיהוי אלקטרופורזה ומערביות כתם ניתוח
הערה: ראה טבלה 2 מתכונים המאגרים נעשה שימוש בסעיף זה. לבצע מערבון כתם על פי שיטת Laemmli12.
<ol><li>Handcast ג'לים של מרחביות-דף 12% (10-ולס, מרווח 1.5 מ מ, 66 µL). להכין תערובת ג'ל ריצה: 4 מ"ל של 30% אקרילאמיד-bisacrylamide פתרון מניות, 2.4 מ של טריס התחתון מאגר, 3.2 מ"ל של dH2O, 9.6 µL של TEMED, µL 96 של 10% אמוניום persulfate פתרון (APS). להכין תערובת ג'ל הערימה: 3.25 מ ל dH2O, 0.5 מיליליטר 30% אקרילאמיד - פתרון מניות bisacrylamide, 1.3 מ של מאגר טריס העליון, 10 µL של TEMED, µL 20 10% APS.</li>
	<li>להוסיף µL 16.6 מאגר x Laemmli 6 (למשל, 14 מ"ל של טריס/HCl/מרחביות pH 6.8 (מאגר טריס העליון), דור 2 למען חברה דמוקרטית, 1.86 גר' DTT, 6 מ של גליצרול, 0.012% bromophenol כחולות; מאוחסן ב-20 ° C) לתוך הדגימה מטרים, µL 6.6 6 מאגר x Laemmli לתוך מדגם E. דגירה הדוגמאות עבור 5 דקות ב 95 ° C.</li>
	<li>לטעון את הדגימות (µL 20 מטרים ואת כל Elute µL ~ 40) ולהפעיל אותם למשך 30 דקות 60 V, ממשיכים עם 20 וי לילה.</li>
	<li>באמצעות מערכת electroblotting חצי יבש, העברת החלבונים לתוך קרום PVDF במשך 80 דקות בגיל 15 V. הערה: קרום PVDF עליהן להיות מופעלות לפני ביצוע העברה חלבון. דגירה הקרום ב- 100% מתנול עבור 1 דקות, ואחריו דגירה 2 דקות במים הנדסה גנטית.</li>
	<li>לאחר המעבר חלבון, דגירה הג'ל מרחביות-דף עם פתרון Coomassie h 3, ואחריו שלושה שלבים של שטיפה עם מים הנדסה גנטית, בכל 30 דקות.</li>
	<li>בסוף חלבון העברה, תן את הקרום PVDF יבש עבור ה 1 להפעיל מחדש את הקרום כפי שמצוין בשלב 4.5. לחסום את הקרום h 1 עם 5% BSA ב 1 x TTBS.</li>
	<li>דגירה הקרום עם הנוגדן הראשון: חור או mesothelin, שניהם מדולל 1:1000 ב 5% BSA ב 1 x TTBS במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר או ללון ב- 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הקרום שלוש פעמים במשך 7 דקות ב- 1 x TTBS, דגירה עם ארנב עכבר נגד חזרת peroxidase (HRP)-נוגדנים משניים מצומדת מדולל 1:10,000 ב 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>הצג באופן חזותי באמצעות chemiluminescence משופר ו- imager דיגיטלי של חלבונים.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li>
<li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+3%27+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li>
<li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress%3A+a+matter+of+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li>
<li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AREsite2%3A+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU%2FGU%2FU-rich+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li>
<li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li>
<li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li>
<li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biotin-%28strept%29avidin+system%3A+principles+and+applications+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li>
<li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+Uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013).</li>
<li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis%2Ftransport+of+nuclear+ferritin+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li>
<li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5%27+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li>
<li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22201738">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li>
<li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+regulatory+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li>
<li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li>
<li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

3' UTRs שייך הגנום ללא קידוד3, כל אי קידוד RNAs יכול לקיים אינטראקציה עם חלבונים כדי להפעיל את פונקציית7. כאשר הגנום יונקים נמצאה pervasively יש לשעתק והפיק חלק ניכר RNAs זמן noncoding16, המתעוררים עדויות הדגימו כי אלה RNAs לונג-noncoding מתפקד בוויסות ביטוי גנים כפי שהם אינטראקציה עם שיפוצים-כרומטין מתחמי17. ידע זה נרכש על-ידי ניצול וזמינותו RNA-הנפתח. לפיכך, כדי להתחיל בפענוח interactors של RNA ספציפיים, השלב הראשון יכול להי...

ביטוי גנים ואת רמת הסופי של המוצר ג'ין יכול להיות צמוד מוסדר על ידי המשפיעים על יציבות mRNA של mRNA תרגום שיעור1. מנגנונים רגולטוריים post-transcriptional אלה הם המופעל באמצעות פעולת הגומלין בין ללא קידוד RNA ו/או RNA מחייב חלבונים (RBPs) עם ה-mRNA יישוב. בדרך כלל זה 3' לא מתורגם האזור של ה-mRNA (3' UTR - השייכים החלק ללא קידוד של הגנום2) המכיל ספציפי cis-אלמנטים רגולטוריות (CRE), אשר מוכרים על ידי טרנס-מתנהג גורמים כגון miRNA או RBPs 3. הטוב ביותר למד cis-רכיב 3' UTR, אינו המוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), אשר הוכר על ידי AU מחייבת ספציפי חלבונים (AUBP), בתורו, גורם גם mRNA השפלה/deadenylation (בתיווך הם ריקבון) או mRNA מייצב4.
הגודל של 3' UTR של calretinin ה-mRNA (CALB2) הוא 573 bp ארוך ומכיל בשם AUUUA pentamer, כפי שחזיתי מאת AREsite2, כלי bioinformatic5. בקנה אחד עם הנוכחות של מוטיב הם בשם, וזמינותו וקטור-כתב pmirGLO הפגינו תפקיד ייצוב של רכיב זה בתוך ה-mRNA CALB26. לבסוף, ה- במבחנה RNA-הנפתח שימש כדי לזהות את AUBP זה מייצב calretinin mRNA דרך מוטיב הם.
מאז כל אי קידוד RNAs אינטראקציה עם חלבונים7, ה במבחנה RNA-הנפתח היא דרך טובה הראשון-של-בחירה וזמינותו לזיהוי RNA-interactors כדי לסייע בפענוח המנגנונים המולקולריים. בשיטה זו RNA-הנפתח ', הגששים RNA מסונתז באופן מסחרי, אשר הודבקו תוויות עם צורה שונה של ביוטין (desthiobiotin) התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, שימשו. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם המאוגד-RNA עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. כזה חלבונים מאוגד-RNA הם eluted של החרוזים מגנטי, לרוץ דרך ג'ל מרחביות-דף 12%, הועבר קרום, שנבדק עם נוגדנים שונים.
במסגרת ההליך טיהור זיקה streptavidin סטנדרטי-ביוטין, דנטורציה קשים תנאים נדרשים כדי לשבש את הקשר חזק בלתי הפיך ביוטין-streptavidin elute חלבונים מאוגד8, אשר יכול להוביל הדיסוציאציה של מתחמי חלבון. בניגוד ביוטין, desthiobiotin הפיכה נקשר streptavidin, שנעקרו מבתיהם תחרותי עם פתרון במאגר של ביוטין, המאפשר • תנאי עדין של חלבונים, והימנעות בידודו של באופן טבעי biotinylated מולקולות9, רומז הטכניקה הוא אידיאלי עבור בידוד חלבון יליד מתחמי בתנאים מקורית.
במבחנה מחייב תנאים, לכתחילה, אשר נקבע על ידי ריכוז המלחים, צמצום סוכנים ואחוז דטרגנט, צריך להיות קרוב הנוכחים בהקשר הסלולר כדי לזהות נכון ויוו אינטראקציות. התנאים המחייבים מיושמת בזאת בעבר הוכחו באופן המתאים הזיהוי חור חלבון מחייב AU10. גישה זו יכולה לחסוך זמן, מאז אופטימיזציה של תנאי מחייב נכונה יכול להיות זמן רב ומאתגר. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש פרוטוקול התחלה לניסוי RNA-הנפתח כלשהו, ניתן למטב בהדרגה על-ידי שינוי ריכוז מלחים, דטרגנטים, שינוי אחוז גליצרול והוספת מלחים אחרים. יתר על כן, אנחנו הראו כי אפילו קצר 25-נוקלאוטיד RNA-בדיקה מחסה pentamer הם מוטיב יכול לשמש כדי להדגים את האינטראקציה עם AUBP ספציפיים.

<table><tbody><tr><td>ערכת מיצוי גרעיני וציטופלזמי NE-PER</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מעכב פרוטאז פירס, ללא EDTA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA פירס</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ערכת משיכה של חלבון RNA מגנטי פירס&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>כולל חרוזים מגנטיים ולכן יש לאחסן את הערכה בטמפרטורה של 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>פירס RNA 3' ערכת סיום Desthiobiotinylation&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>20163</td><td>הערכה היא חלק מ"ערכת הפתיחה הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס", ויש לאחסן אותה בטמפרטורה של -20 מעלות; C בניגוד לערכה הנפתחת (4 &deg; ג).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; מעמד מגנטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>אנטי - HuR (MOUSE) נוגדן חד שבטי</td><td>Thermo Fisher Scientific-הנוגדן</td><td></td> <td>כלול בערכת הנפתחת של חלבון RNA מגנטי פירס&nbsp; - 1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>אנטי - ואלפא; - טובולין (עכבר) נוגדן חד שבטי</td><td>סנטה קרוז</td><td>8035</td><td>1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד עכבר ארנב 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>אנטי--PARP (RABBIT) נוגדן פוליקלונלי</td><td>איתות תאים</td><td>9542</td><td>1:1000 ב-5% BSA 1x TTBS - נוגדן משני נגד ארנב עיזים 1:10,000 ב-5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד מזותלין (עכבר)&nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני נגד ארנב עז</td><td>איתות תאים</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר ארנב משני</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 בינוני</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - סרום בקר מסונן</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין - סטרפטומיצין (100x)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA (1x)</td><td>Gibco by Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 תאים</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>מיני צלחות זכוכית מערכת Protean&nbsp;</td>לוחות מרווח <td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN עם מרווח משולב 1.5 מ"מ</td><td>מסרק Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN, 10 בארות, 1.5 מ"מ, 66 ומיקרו; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Dequi Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese Gel 30 - תמיסת מלאי מימית 30% אקרילאמיד וביסקרילאמיד במנה של 37.5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>ממברנת העברת PVDF&nbsp;</td><td>פרקין אלמר</td><td>NEF1002</td><td>צריך להיות מופעל על ידי דגירה במתנול טהור למשך דקה אחת ולאחר מכן שטיפה במים למשך 2 דקות&nbsp;</td></tr><tr><td>תא העברה חצי יבש Trans-Blot SD&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; הדמיה דיגיטלית</td><td></td> <td>Vilber-RNA</td><td></td></tr> <tr><td>אוליגו סינתזה</td><td>Mycrosynth AG, שוויץ-סולם</td><td></td> <td>הסינתזה - 0.04 ומיקרו; mol - HPLC מטוהר</td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% אליקוטים סטריליים לאחסון ב-20&deg; C</td></tr><tr><td>פירס סטרפטווידין חרוזים מגנטיים&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>88817</td><td>שימו לב שלחרוזים המגנטיים הללו יש קוטר ממוצע של 1 ומיקרו; מ '(טווח בין 0.5 - 1.5 ומיקרו; יתר על כן, Dynabeads-M280 Streptavidin, שהם חרוזים בגודל הומוגני 2.8 ומיקרו; m, משמשים גם במשיכת RNA אך שימו לב שהדבר עלול להשפיע על תהליך הטיהור.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>אלומיניום סולפט-(14-18)-הידרט&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אורתו-זרחתית&nbsp;</td><td>אפליקציה</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של rna-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

ה במבחנה RNA-הנפתח עדיין משמש את הצעדים הראשונים של פרוטוקולים שמטרתם זיהוי חלבונים RNA מחייב לזהות ספציפית RNA מבנים ומוטיבים. ב פרוטוקול זה RNA-הנפתח, הגששים RNA מסחרית מסונתז מסומנות עם צורה שונה של ביוטין, desthiobiotin, התחנה הסופית 3' של סטרנד RNA, אשר נקשר הפיכה streptavidin, ובכך מאפשרת • תנאי של חלבונים תחת יותר פיזיולוגית תנאים. רנ א-desthiobiotin הוא משותק תוך אינטראקציה עם streptavidin על beads מגנטי, אשר משמשים כדי להוריד את חלבונים במיוחד אינטראקציה עם הרנ א עניין. חלבונים שפגע בסימני שאינם ופעיל מן השבר cytosolic של מזותליומה תאים משמשים כמקור של חלבונים. ניתן להחיל את השיטה המתוארת כאן כדי לזהות את האינטראקציה בין הידועים RNA מחייב חלבונים 25-נוקלאוטיד (nt) ארוך RNA בדיקה המכיל רצף של עניין. פעולה זו שימושית להשלים אפיון פונקציונלי ייצוב או לערער יציבות אלמנטים נוכח מולקולות RNA הושג ע י שימוש assay וקטור של הכתב.

בניסוי זה, קטע ארוך 25-nt של calretinin 3' UTR מחסה הם מוטיב (CALB2 3' UTR (הם) 25-nt) נעשה שימוש כדי לבדוק אם זה באופן ספציפי נקשר חלבון R האדם-אנטיגן (חור), מייצב mRNA ידוע. כדי לבדוק את ייחודה של רכיב הן, RNA 25-nt בדיקה CALB2 3' UTR (mtARE) הכוללת של מוטציה הם מוטיב, אשר הוצג בעבר לבטל את השפעת ייצוב הם מוטיב, היה בשימוש6. הרנ א השלישי בדיקה מייצג את הפקד שליליים, אשר הוא 28-nt שאינן קשורות RNA המכיל את מוגדרים היטב הברזל מגיב הרכיב (לא קשורים RNA (חמתו)), ידוע...

Desthiobiotin מצב רוח oligo RNA 25-נוקלאוטיד סינתטי, אשר מכיל מוטיב רכיב אדנין-עשיר (הם), מאפשר קשירה ספציפי של cytosolic הם מחייב חלבון.

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ללכוד חלבון ציטוזולי הנקשר לרצף ספציפי הממוקם במולקולת RNA בתאי מזותליומה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום הביולוגיה של RNA, כגון אם חלבון קושר RNA חזוי יכול לקשור אדנוזין או רצף עשיר באורידין בתעתיק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משלימה את האפיון הפונקציונלי של אלמנטים מייצבים או מערערי יציבות המוערכים על ידי בדיקת מדווח.תדגים את הטכניקה הזו ד"ר ילנה קרסויה-ראקיץ', פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוטוקול, השג תאי ACC-MESO-4 שהוכנו בעבר עם מפגש של 80 עד 90%. שאפו את המדיום, שטפו את התאים עם 15 מיליליטר של מי מלח חוצצים פוספט 1X, או PBS, ושאבו את ה-PBS.לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA, ודגרו על בקבוק התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. הוסף שבעה מיליליטר של מדיום RPMI-1640 בתוספת מים, אסוף את התאים בצינור של 15 מיליליטר וסובב אותם ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאפו את המדיום, והשעו מחדש את כדור התא עם 1.5 מיליליטר של 1X PBS.לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. סובב את התאים שוב ב -500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר הסיבוב, השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את כדור התא עם 1.5 מיליליטר 1X PBS קר כקרח, וסובבו את התאים ב-500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.השליכו את הסופרנטנט, והעריכו את הנפח הארוז של כדור התא על ידי השוואת הצינור המכיל את גלולת התא עם צינור של 1.5 מיליליטר עם 10, 20, 50 ו-100 מיקרוליטר של 1X PBS. הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח, או CER I, בתוספת שני מיקרוליטרים של מעכב פרוטאינאז 1X. מערבל במרץ את הגלולה למשך 15 שניות, ודגר את הצינור על קרח למשך 10 דקות.הוסף 11 מיקרוליטר של מגיב מיצוי ציטופלזמי קר כקרח II, או CER II, מערבולת נמרצת למשך חמש שניות, ודגירה על הצינור למשך דקה אחת על קרח. מערבל את הדגימה במרץ במשך חמש שניות, וצנטריפוגה את הצינור ב-16,000 פעמים גרם למשך חמש דקות. העבירו את הסופרנטנט לצינור הנקי והמקורר מראש על קרח.השעו מחדש את הגלולה הנותרת ב-100 מיקרוליטר של מגיב מיצוי גרעיני קר כקרח, או NER, בתוספת מיקרוליטר אחד של מעכב פרוטאינאז, ומערבולת נמרצת למשך 15 שניות. דגרו את הדגימה על קרח למשך 40 דקות, ומערבולת כל 10 דקות למשך 15 שניות. צנטריפוגה את הצינור ב 16, 000 פעמים גרם למשך 10 דקות.העבירו את הסופרנטנט, שהוא חלק החלבון הגרעיני, לצינור נקי ומקורר מראש. מדוד מיד את ריכוז החלבון בשיטה הביסינצ'ונינית. לאחר מכן, הכינו 25 מיקרוליטר של תמציות ציטוזוליות וגרעיניות.הקפיאו את החומרים הללו על ידי הנחתם בחנקן נוזלי למשך חמש שניות, ואחסנו אותם ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס. העבירו חמישה מיקרוליטרים של בדיקות RNA של 10 מיקרו-מולריות, לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה דקים בנפח 0.5 מיליליטר, ודגרו אותם במכונת PCR בטמפרטורה של 85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. מניחים את הצינורות מיד על קרח.לתגובה אחת של 30 מיקרוליטר, הוסף 10 מיקרוליטר של תערובת שהוכנה בעבר לצינור המכיל RNA. הוסף בזהירות 15 מיקרוליטר PEG 30% לתגובה, והשתמש בקצה טרי כדי לערבב את התגובה. דגרו את התגובה למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס.למחרת, הכינו את הריאגנטים. הוסף 70 מיקרוליטר של מים נטולי נוקלאז לצינורות התגובה לתיוג RNA. הוסף 100 מיקרוליטר אלכוהול כלורופורם-איזואמיל, ומערבולת קצרה וסובב את הדגימה ב-13,000 פעמים גרם למשך שלוש דקות.הסר בזהירות רק את השלב העליון. הימנע מלגעת בשלב התחתון. העבירו אותו לצינור חדש נטול נוקלאז, בנפח 1.5 מיליליטר.הוסף 10 מיקרוליטר של נתרן כלורי חמש מולארי, מיקרוליטר אחד של גליקוגן ו-300 מיקרוליטר של 100% אתנול קר כקרח. מניחים את הצינור במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, צנטריפוגה ב 13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.השליכו בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור. הוסף 300 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח, וצנטריפוגה שוב ב -13, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט לחלוטין, וייבשו את הכדור באוויר למשך 15 דקות.השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. דגרו את ה-RNA ב-90 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, והניחו אותו על קרח. הנח את ה-RNA המסומן על קרח במהלך השלב הבא של שטיפה מוקדמת של החרוזים המגנטיים של סטרפטווידין.שטיפה מוקדמת של 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין לכל 50 פיקומולים של RNA. מערבולת את הצינור עם חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין למשך 15 שניות. לאחר מערבולת מהירה, הסר 200 מיקרוליטר לתוך צינור Safe-Lock נקי בנפח 1.5 מיליליטר באמצעות קצות פיפטה חתוכים.לאחר מכן, הניחו את הצינור על מעמד מגנטי כך שהחרוזים יתאספו בצד הצינור, והמתינו דקה אחת. הסר את נוזל ההשעיה. כדי לשטוף את החרוזים, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 400 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 0.1 מולרי, תמיסת נתרן כלורי 0.05 מולארי, ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים.הנח את הצינור בחזרה על המעמד המגנטי והמתן דקה אחת. לאחר מכן, אספו את הסופרנטנט. שוטפים את החרוזים עם 200 מיקרוליטר נתרן כלורי 100 מילי-מולרי, ומסירים את הסופרנטנט.הוסף 200 מיקרוליטר של טריס של 20 מילי-מולארי, השהה מחדש את החרוזים על ידי פיפטינג והנח את הצינור על המעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט. לאחר מכן, הסר את הצינור מהמעמד המגנטי, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר לכידת RNA 1X והשהה מחדש חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין על ידי מערבולת קצרה.הסר 50 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים של סטרפטווידין, והוסף אותם לכל צינור RNA מסומן באמצעות קצה פיפטה חתוך. דגרו את הצינורות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגלת. לאחר שהשפופרת הייתה על המעמד המגנטי במשך דקה אחת, הסירו את הסופרנטנט.הוסף לחרוזים 50 מיקרוליטר של טריס 20 מילי-מולר, והשעה. לאחר מכן, הנח את הצינורות במעמד המגנטי. לאחר דקה אחת, הסר את הסופרנטנט.הוסף 100 מיקרוליטר של חוצץ קושר RNA חלבון 1X לחרוזים, והשהה אותם מחדש. לאחר מכן, הנח את הצינורות בחזרה למעמד המגנטי. לאחר שהצינורות היו במעמד במשך דקה אחת, אספו את הסופרנטנט.הוסיפו 100 מיקרוליטר של מאסטר מיקס B, השעו מחדש על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה, והימנעו מיצירת בועות. דגרו צינורות תגובה למשך 60 דקות בארבע מעלות צלזיוס על רולר. עברו לשלבי הכביסה והשטיפה.הנח את הצינורות במעמד מגנטי, אסוף את הזרימה והעביר אותה לצינור חדש. פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר כביסה 1X על החרוזים, תלייה בעדינות, החזר אותם למעמד, המתן דקה אחת והשליך את הסופרנטנט. חזור על שלב זה פעמיים.הוסף 40 מיקרוליטר של מאגר פליטה לחרוזים המגנטיים, ערבב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ודגירה על שייקר צינורות. הנח את הצינורות במעמד מגנטי, המתן דקה אחת ואסוף דגימה. מניחים על קרח, ומשתמשים בו לניתוח במורד הזרם.כדי להדגים את טוהר השברים הגרעיניים/ציטוזוליים, נותחו חלבונים על ידי Western Blot, שהראה כי אלפא-טובולין זוהה רק בשבר הציטוזולי, וחלבון PARP זוהה רק בשבר הגרעיני. הפליטה מבדיקת ה-UTR ARE התלת-ראשונית CALB2 הדגימה קשירה של R אנושי ונעדרה בפליטה מהגשושית המוטנטית ובבדיקת ה-RNA הלא קשורה, הקושרת את החלבון המגיב לברזל. כדי להדגים עוד יותר את הספציפיות בין ה-UTR התלת-ראשוני CALB ל-R האנושי, הממברנה נבדקה עם נוגדן אנטי-מזותלין, וכל שלוש דגימות ה-eluate לא הראו נוכחות של מזותלין, מה שמצביע על כך שמוטיב ה-ARE המייצב בתוך CALB2 UTR תלת-ראשוני יכול לקשור באופן ספציפי חלבון R אנושי.צביעת Coomassie של הג'ל מראה כי כמויות שוות של חלבונים שימשו לדגירה עם שלושת בדיקות ה-RNA השונות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטה נוספת ממוקדת חלבון, כמו משקעים חיסוניים של חלבון נתון, על מנת לענות על שאלה נוספת, כמו איזה רצף נקשר אליו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA לחקור שותפים אינטראקטיביים אפשריים של RNA ספציפי.

desthiobiotin-streptavidin-affinity-mediated-purification-rna

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

צפיפות שונה צנטריפוגה מבוססי מתודולוגיה שיפוע מבוסס נוצל לבודד תאים אפיתל מ רקמה Rhipicephalus רקמת microplus . משטח חלבונים הקשורים היו biotinylated ו מטוהרים באמצעות חרוזים מגנטיים streptavidin עבור יישומים במורד הזרם.

טיהור של biotinylated Cell חלבונים משטח מ<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; תאים אפיתל גוט

דו ח זה מתאר שיטה מהירה ואמינה עבור אימות מטרות mRNA miRNAs הסלולר. משתמשת בשיטה biotinylated סינתטי מבוססת מגבר קדם חומצת גרעין נעול miRNA מחקה ללכידת המטרה mRNA. לאחר מכן, מצופים streptavidin beads מגנטי מועסקים הנפתח המטרה mRNA על כימות על ידי תגובת שרשרת של פולימראז qPCR.

הנועד מבוסס-ביוטין הנפתח Validate mRNA miRNAs מטרות של הסלולר

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

מתחמי RNA/חלבון מטוהרים באמצעות אסטרטגיה botin-streptavidin הם eluted פתרון תחת תנאים denaturing בטופס אינו מתאים עוד טיהור, אנליזה פונקציונלית. כאן, אנו מתארים שינוי של אסטרטגיה זו אשר מנצל מקשר צילום-cleavable RNA, צעד • UV-תנאי עדין, מניב את מתחמי ה-RNA/חלבון המקורי והמלא.

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

בתוך מבחנה ביוכימית באמצעות תוויות Biotin ללמוד חלבון-גרעין חומצה אינטראקציות

כאן אנו מציגים פרוטוקול קליפ-seq שונה בשם FBIoקליפ-seq עם טיהור דגל-ביוטין טנדם כדי לקבוע את מטרות RNA של חלבונים מחייבים RNA (RBPs) בתאים יונקים.

פרופיל תמלול רחב של אינטראקציות חלבון-RNA על ידי קישור צולב וחיסונים בתיווך על ידי טיהור דגל-ביוטין טנדם

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

מאמר זה מתאר פרוטוקול לחקר אינטראקציות דנ"א-חלבון באמצעות מערכת אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין (BLI). הוא מתאר את השלבים והשיקולים החיוניים לשימוש בקינטיקה מחייבת בסיסית או מתקדמת כדי לקבוע את זיקת קשירת שיווי המשקל (KD) של האינטראקציה.

ניתוח אינטראקציות DNA-חלבון עם אינטרפרומטריה ביו-שכבתית מבוססת סטרפטווידין

למדו ללכוד חלבונים ציטופלזמיים הקושרים לרצפי RNA ספציפיים בתאי מזותליומה ACC-MESO-4 באמצעות תיוג desthiobiotin. שיטה זו מאפשרת זיהוי חלבוני קישור ל-RNA וחקר אינטראקציות RNA-חלבון בביולוגיית RNA.

Desthiobiotin-Streptavidin-זיקה מתווכת טיהור של RNA-אינטראקציה חלבונים בתאים מזותליומה

גלה סרטונים נוספים