Name: מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: למדו ליצור מוטציות נקודה גנומיות ב-C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון הומולוגיות. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר של שונות גנטית בהקשר של בקרה רגולטורית אנדוגנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ישנם שאין ניגודי אינטרסים הקשורים בדו ח זה.

כל טיפול בבעלי חיים והתהליכים ניסיוני בעקבות המנחה של מכוני הבריאות הלאומיים ואת טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) ב אוניברסיטת מישיגן. להשתמש בפתרונות נטולת RNase, פיפטה טיפים לאורך כל הפרוטוקול. לנקות את אזור העבודה פיפטות, צינורות, צנטריפוגה עם פתרון טיהור RNase לבצע את ההנחיות יצרן (ראה טבלת חומרים).
1. sgRNA בחירת היעד
<ol><li>באמצעות דפדפן אינטרנט, פתח את דף האינטרנט: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>קלט ~ 60 בסיסים (bp) של רצף איגוף ערוך הרצוי של עניין (כלומר 30 bp 5' ו 3' של עריכה הרצוי).</li>
		<li>בחר את הגנום Caenorhabditis elegans מתוך התפריט הנפתח.</li>
		<li>בחר את מוטיב סמוך Protospacer (20 bp-הגולה - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) מתוך התפריט הנפתח.</li>
		<li>לחץ על שלח. בדף התוצאות, לבחור את רצף המטרה מדורגת העליון הקרוב ערוך עניין. אם אין אתרי יעד מתאים תוך איגוף 60 bp לרצף הקלט, להרחיב את רצף שאילתה ל-100 bp (כלומר 50 bp צדי הרצוי עריכה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>ממקור זמין, למשל synthego, להשיג sgRNA יעד של 20-מר עם המפרט הבא: 3 nmol; אין לערוך שינויים.</li>
	<li>עם קבלת, צנטריפוגה sgRNA lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף µL 60 של טה נטולת נוקלאז הצינור ולאחר בעדינות להשעות מחדש על-ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200. הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומטר.</li>
</ol>2. הומולוגיה מכוון לתיקון תבנית עיצוב
<ol><li>עיצוב של ssODN HDR תבנית המכילה: 1) מוטציה של הריבית, 2) אתר ייחודי endonuclease הגבלה במסגרת, 3) מוטציה שקטה של אחת או שתיהן Gs בתוך הרצף הגולה פאם והזרועות 4) 50 bp 5' ו 3' הומולוגיה איגוף המוטציה הראשונה והאחרונה. (איור 1C) 9 , 10.<ol>
<li>אם המוטציה של הרצף פאם הגולה אינו אפשרי, להציג 5-6 מוטציות שקטות בתוך הרצף sgRNA זיהוי המטרה למנוע בתיווך sgRNA המחשוף של התבנית HDR ssODN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ממקור זמין, למשל idtdna, להשיג "oligonucleotide Ultramer DNA" עם הפרמטרים הבאים: קנה מידה: 4 nmol; ניסוח: כלום; טיהור: Desalting רגיל.</li>
	<li>עם קבלת, צנטריפוגה ssODN lyophilized המכילה צינור-> g 12,000 x עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר. בעדינות מחדש להשעות ssODN כדי ריכוז סופי של 100 מיקרומטר ddH נטולת נוקלאז2O על ידי pipetting למעלה ולמטה 15 - 20 פעמים באמצעות פיפטה P200.</li>
</ol>3. עיצוב Genotyping תחל
<ol><li>עיצוב פריימר להגדיר איגוף השינוי הגנום לייצר ~ 400-700 bp PCR אמפליקון11.</li>
	<li>למטב את תנאי הרכיבה PCR כדי לייצר אמפליקון יחיד, מדויקת11.</li>
</ol>4. מכינים תערובת הזרקה
<ol><li>צנטריפוגה ריאגנטים טבלה 1 -מהירות מירבית למשך 2 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>לפי הסדר הרשום, להוסיף טבלה 1 ריאגנטים צינור PCR נוקלאז-חופשית.</li>
	<li>לערבב ביסודיות על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים עם P20 פיפטה.</li>
	<li>דגירה הזרקת מיקס 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>5. הזרקת פרוטוקול
<ol><li>עומס הזרקת micropipette עם חצי אחד של הזריקה לערבב12. שמור שנותרו לערבב הזרקת במקרה שהמחט הזרקת שסותם או שובר.</li>
	<li>לשבור עצה micropipette כך p.s.i. ~ 20-30 מייצרת פתרון זורם12הדרגתית. הערה: טיפים בקוטר גדול יותר באופן שלילי משפיעים על בריאות בעלי חיים ולא להקטין F1 רומא התשואה.</li>
	<li>להזריק 10-15 צעירים תולעים בוגרות בשני הידיים האשכים במידת האפשר12. אם לא, הזרקה לתוך זרוע האשכים אחת מספיקה.</li>
	<li>לאפשר מוזרק לבעלי חיים (P0) להתאושש במשך 1-2 h בטמפרטורת החדר בצלחת מדיה (NGM) נמטודות צמיחה מתחילה OP50 35 מ מ. לאחר מכן, יחיד מוזרק P0 לבעלי צלחות NGM בודדים מתחילה OP50 35 מ"מ באמצעות תולעת חוט פלטינה לבחור12.</li>
</ol>6. צלחות0 המסך P ו- s1יחיד mCherry(+) F
<ol><li>יומיים לאחר זריקה, לזהות P0 הצלחות המכיל F1 רומא לבטא mCherry ב הלוע באמצעות stereomicroscope של פלורסנט (איור 1D, יום 2 - 3). בחרו 3 P0 לוחות המכילים את רוב mCherry(+) F1 בעלי החיים.</li>
	<li>מכל שלוש נבחרות P0 הצלחות, יחידה 8-12 mCherry(+) F1 חיות בסך 24-36-mCherry(+) F-1-s באמצעות תולעת לבחור (איור 1D, יום 2 - 3). הערה: חיות mCherry(-) יכול גם שיוציאו מן הלוחיות P0 , אך ההסתברות של זיהוי כראוי נערך חיות הרבה נמוך (איור 2 א).</li>
	<li>לאפשר בודדים s1F self-fertilize, להטיל ביצים במשך 1-2 ימים בטמפרטורת החדר.</li>
</ol>7. יחיד תולעת PCR ו- Genotyping
<ol><li>לאחר 1-2 ימי להטלת ביצים, להעביר את ה-F1s לתוך בודדים PCR רצועת צינור כמוסות המכילות µL 7 תולעת פירוק המאגר באמצעות איסוף תולעת (טבלה 2, איור 1D, ביום 4-5).</li>
	<li>צנטריפוגה המבחנות במהירות המרבית עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להביא חיות לתחתית הצינור, ומקפיאים צינורות ב-80 מעלות צלזיוס עבור 1 h. הערה: תולעים ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן.</li>
	<li>Lyse תולעים קפואות thermocycler באמצעות התוכנית הבאה: 60 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, להחזיק 4 ° C.</li>
	<li>הגדרת ה-PCR mastermix כפי שמוצג בטבלה3.</li>
	<li>להוסיף µL 21 של PCR mastermix המבחנות נקי, ולאחר מכן להוסיף 4 µL של תולעת פירוק משלב 3. מערבבים היטב בעזרת פיפטה ולהפעיל PCR התוכנית לבצע את ההנחיות יצרנים (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לטהר תגובות PCR באמצעות ערכת ה-DNA נקי ולהתרכז, ביצוע ההוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). Elute DNA על-ידי הוספת 10 µL מים על העמודה ספין.</li>
	<li>הגדרת אנזים הגבלה mastermix כפי שמוצג בטבלה4.</li>
	<li>להוסיף 10 µL של mastermix אנזים הגבלה כל התגובה PCR נקי, תקופת דגירה של 1-2 h ב- 37 ° C13.</li>
	<li>נפרדים מתעכל PCR מוצרים ב- 1.5% agarose ג'ל לרוץ במהירות 120 V באמצעות 1 x טריס-אצטט-EDTA (טה) מאגר14.</li>
</ol>8. זיהוי ואימות רצף של חיות הערוך
<ol><li>לבחון דגימות אנזים מתעכל לנוכחות של להקות להצביע על פוטנציאל נערך חיות14 (איור 1D, ביום 4-5). הערה: טען פקד N2 לזהות מוטציות ויאסין פוטנציאליים אשר יכול להיות שנצפו כמו משמרות במידה ו/או עיכול אנזים הגבלה בלתי צפויים ומורכבים פסים דפוסי.</li>
	<li>לאחר זיהוי חיות שנערכו פוטנציאליים, להשתמש את µL 3 הנותרים של תולעת פירוק וחזור על התגובה ה-PCR. אסור לנקות או אנזים הגבלה לעכל את תגובת ה-PCR בסיום התוכנית. לטעון את תגובת ה-PCR על ג'ל agarose 1%, נפרד ולחלץ את הלהקה באמצעות ערכת חילוץ ג'ל15 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>סנגר רצף16 הג'ל מופק הדנ א באמצעות ומהצמיגים F1 כדי לזהות חיות הערוך בצורה נכונה (איור 1 א') הערה: Heterozygote קריאות יכיל בשכבות פסגות בשל נוכחותם של הסוג הפרוע ומתוכננים אלל.</li>
	<li>כדי לקבל חיות homozygous מחיות מאומת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים הערוך, יחידה 8-12 F2 חיות ולבצע שלבים 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
<li>Ma, D., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+and+Its+Applications+in+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Genome Editing and Its Applications in Model Organisms.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-Guided+Genome+Engineering+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).</li>
<li>Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+technologies+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Delivery technologies for genome editing.</a> Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
<li>Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient%2C+Rapid+and+Co-CRISPR-Independent+Genome+Editing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans.</a> G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5056/pcr-the-polymerase-chain-reaction">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5057/dna-gel-electrophoresis">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis .</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5063/gel-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
<li>Estrada-Rivadeneyra, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29171728">Sanger sequencing.</a> FEBS J. , (2017).</li>
<li>Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22918486">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).</li>
<li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337, 816-821 (2012).</li>
<li>Boyd, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Balanced+Look+at+the+Implications+of+Genomic+%28and+Other+%26%2334%3BOmics%26%2334%3B%29+Testing+for+Disease+Diagnosis+and+Clinical+Care%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other &#34;Omics&#34;) Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care.</a> Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).</li>
<li>Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+SOD1+loss+of+function+involved+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?</a> Brain. 136, 2342-2358 (2013).</li>
<li>Acevedo-Arozena, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+the+SOD1G93A+low-copy+transgenic+mouse%2C+which+models+human+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis.</a> Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

אנו מודים לחברי של המעבדה Beg לקריאה ביקורתית של כתב יד זה. זנים נמסרו על ידי המרכז גנטיקה Caenorhabditis , אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). המחקר במעבדה Beg הוא נתמך על ידי מענקים NIH (R01 NS094678), ניוון שרירים האגודה (MDA382300) כדי A.A.B.

מערכת CRISPR-Cas9 הוא כלי חזק ואפקטיבי בדיוק שינוי הגנום של מודל אורגניזמים. . הנה, נדגים שאת chimeric sgRNAs20 יחד עם ssODN HDR תבניות לזמינה הדור יעילה במיוחד של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. חשוב לציין, נדגים כי משלוח RNP מייצרת יעילות העריכה גבוהה כאשר קרינה פלואורסצנטית משמש כסמן בחירה משותף, המדגיש את נוחות ואמינות של הטכניקה.
הרוב המכריע של שיטות CRISPR-Cas9 C. elegans הגנום הנדסה להסתמך על רקע גנטי מסוים או co-CRISPR אסטרטגיות<sup class="xre...

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות טרנספורמציה באופן קיצוני, האיצו את היכולת בדיוק מהנדס הגנום. בפרט, המערכת CRISPR-Cas9, אשר מסתמך על endonuclease מונחה RNA Cas9 לזירוז הפסקה גדיל כפול (DSB) ליד הרצף היעד עניין, בהרחבה שימש לתכנן במדויק את הגנום של רוב האורגניזמים מודל בשימוש מחקר ביו1,2,3,4. באופן משמעותי, השימוש CRISPR-Cas9 נעול הגנום עריכה אפילו במינים קשה כמו C. elegans5. בין המינים, יצירת מוטציות נקודה עם הגנום CRISPR-Cas9 המבוסס על מערכת עריכה מתבסס על שלושה רכיבים מרכזיים: 1) Cas9 endonuclease, 2) RNA מדריך יחיד (sgRNA) שמנתב את Cas9 endonuclease רצף המטרה ולאחר 3) משתמש מעוצב תבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR) המכילה את edit(s) הרצוי של הריבית2.
ישנן מספר שיטות שבהן ניתן להשתמש כדי להציג את sgRNA ואת Cas9 מיקוד נוקלאז לתוך תאים כולל פלסמיד, RNA נגיפי המבוסס על משלוח שיטות6. לאחרונה, מסירה ישירה של טרום-ומורכבת sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) התפתחה ככלי רב עוצמה ויעיל הגנום CRISPR-Cas9 מבוססי עריכה7. מסירה ישירה של טרום-ומורכבת RNPs CRISPR-Cas9 יש מספר יתרונות ברורים, כלומר: 1) RNPs לעקוף את הצורך הסלולר תמלול, תרגום, 2) RNPs נמחקים במהירות, אשר עשוי להגדיל ירידה לפרטים על-ידי הפחתת הזמן הפנוי את המטרה המחשוף ו- 3) RNPs מכילים גורמים זרים אין DNA/RNA אשר עוקף המבוא של רצפים שאינם ילידי לתוך הגנום מארח באמצעות שילוב אקראי. יחד, סביר תכונות אלה מספקות פרץ קצר של--יעד CRISPR עריכה תוך מזעור תופעות את המטרה.
אנו מתארים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור שינויים בייעודי לאתר גנומית C. elegans. פרוטוקול זה כולל מיקוד sgRNA oligonucleotide תקועים יחיד (ssODN) HDR תבנית, sgRNA-Cas9 RNP complexing ו משלוח, ועיצוב אסטרטגיה genotyping לצורך זיהוי חד משמעי של חיות ערוכה כראוי. באמצעות אסטרטגיה זו, לא רק השינויים הרצויים בייעודי לאתר ניתן לשחזר, אבל גם עשוי להיות התאושש מוטציות ויאסין שאינם ספציפיים אחרים. לפיכך, האסטרטגיה שלנו מאפשרת את הדור של סדרות allelic באמצעות אסטרטגיה אחת, שם הן מונו-allelic, דו-allelic, ויאסין מוטציות יכול להיווצר דור1 F.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>כימרי sgRNA</td></tr><tr><td>נטול נוקלאז TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>מסופק עם ערכת sgRNA ערכת</td><td></td>EZ</tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>Synthego Inc.</td><td>מסופק עם ערכת sgRNA ערכת</td><td></td>EZ</tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN HDR תבנית</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות</td><td>1078728</td><td>חלבון Cas9</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mדובדבן סמן פלסמיד</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>DNA נקי & רכז</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean ג'ל שחזור DNA ערכת Zymo</td><td>Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 התחלה חמה נאמנות גבוהה 2X Master Mix</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקט זכוכית מיקרופיפטות</td><td>Sutter</td><td>Instruments BF100-78-10</td><td>OD: 1.0 מ"מ. מזהה: 0.78 מ"מ</td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Decooling</td><td>Solution Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- c. elegans באמצעות crispr/cas9 ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

חוזר palindromic באופן קבוע interspersed (CRISPR) - CRISPR - באשכולות קשורה חלבון 9 (Cas9) מערכת הגנה החיסון מסתגלת prokaryotic יש כבר גייס בתור כלי רב עוצמה עבור הנדסה מדויקת הגנום האיקריוטים. כאן, אנו מציגים שיטה מהירה ופשוטה באמצעות מדריך בודד chimeric RNAs (sgRNA) ו- CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) עבור הדור יעיל ומדויק של גנומית מוטציות נקודה C. elegans. אנו מתארים צינור בחירת היעד sgRNA, עיצוב התבנית תיקון מכוון הומולוגיה (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexing ו משלוח של אסטרטגיה genotyping המאפשרת זיהוי מהיר ועמיד חיות הערוך בצורה נכונה. הגישה שלנו מאפשרת הדור נתיישב וזיהוי של הנקודה הרצויה גנומית חיות אלא גם מקלה על האיתור של אללים אחרים מורכבים ויאסין כ 4-5 ימים עם יעילות גבוהה, עומס עבודה מופחתת ההקרנה.

מוטציות בגן האנושי סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1) בחשבון של משפחתית נוירודגנרטיביות, מחלה ניווניות הרסנית שמוביל תמיד לשיתוק ומוות17~ 10-20%. סופראוקסיד דיסמוטאז אנושי-1 הוא חלבון שנשמרת אבולוציונית שיתוף דמיון זהות ו- 70%-55% עם החלבון השתילות-1 C. elegans (איור 1B). כדי להדגים את הפשטות, כדאיות ויעילות של הגישה מבוססת-CRISPR-Cas9 RNP, שסימנו את הגן C. elegans השתילות-1 כדי להציג את הגרסה הקשורים למחלה G93A הא...

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans באמצעות תבניות תיקון מכוונות הומולוגיה של אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים וריבונוקלאופרוטאינים CRISPR/Cas9. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון קביעת ההשלכות הפתולוגיות של שונות גנטית הקשורה למחלות ניווניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור מוטציות נקודתיות גנומיות במהירות, מה שמאפשר מחקר פונקציונלי של שונות גנטית בהקשר של בקרה רגולטורית אנדוגינית תוך הימנעות מהאזהרות של ביטוי יתר של חלבונים.כדי לבצע בחירת יעד sgRNA, פתח את דף האינטרנט המוצג כאן. הזן כ-60 זוגות בסיסים של רצף המאגפים את העריכה הרצויה המעניינת. לאחר בחירת הגנום של C.Elegans והמוטיב הסמוך לפרוטוספייסר בהתאם לפרוטוקול הטקסט, לחץ על שלח.בדף התוצאות, בחר את רצף היעד המדורג העליון הקרוב ביותר לעריכה המעניינת. עם הקבלה, צנטריפוגה את הצינור המכיל sgRNA ליופיליזציה בטמפרטורת החדר ולפחות 12,000 גרם למשך דקה אחת. הוסף 60 מיקרוליטר של TE נטול נוקלאז לצינור והשתמש בפיפטה p200 כדי להשעות בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 15 עד 20 פעמים.הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומולר. תכנן תבנית ssODN HDR המכילה את המוטציה המעניינת, אתר אנדונוקלאז ייחודי בהגבלת מסגרת, מוטציה שקטה של אחד או שני ה-Gs ברצף NGG PAM ו-50 זוגות בסיסים חמש זרועות הומולוגיה ראשוניות ושלוש זרועות הומולוגיה ראשוניות המאגפות את המוטציה הראשונה והאחרונה. עם קבלתה, צנטריפוגה את הצינור המכיל ssODN ליופיליזציה כפי שהודגם זה עתה ואז השתמש ב-DD H20 נטול נוקלאז כדי להשעות בעדינות את ssODN לריכוז סופי של 100 מיקרומולר.להכנת תערובת הזרקה, צנטריפוגה את הריאגנטים המוצגים כאן במהירות מרבית וארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. בסדר הרשום, הוסף את הריאגנטים לצינור PCR נטול נוקלאז. לאחר מכן השתמש בפיפטה p20 כדי לערבב בעדינות וביסודיות את התוכן.דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות. לאחר הזרקת בעלי חיים P0 על פי פרוטוקול הטקסט, אפשר להם להתאושש בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים על צלחת NGM 35 מילימטר זרעי OP50. לאחר מכן, באמצעות פיק תולעת תיל פלטינה, העבירו חיות P0 מוזרקות בודדות ללוחות NGM בודדים של 35 מילימטר OP50.יומיים לאחר ההזרקה השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות לוחות P0 המכילים צאצאי F1, המבטאים mCherry בלוע. בחר שלוש צלחות P0 המכילות את בעלי החיים החיוביים ביותר ל- mCherry F1. מכל אחת משלושת לוחות ה-P0 שנבחרו השתמשו בפיק תולעים כדי לבודד שמונה עד 12 בעלי חיים חיוביים ל-F1 חיובי ל-24 עד 36 mCherry חיוביים.אפשר ל-F1s בודדים להפרות את עצמם ולהטיל ביצים בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים. לאחר יום עד יומיים של הטלת ביצים, השתמש בפיק תולעים כדי להעביר את ה-F1s למכסי צינור רצועת PCR בודדים המכילים שבעה מיקרוליטרים של מאגר ליזיס תולעים. צנטריפוגה של צינורות ה-PCR במהירות מקסימלית ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי להביא את החיות לתחתית הצינור.לאחר מכן הקפיאו את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן לייז תולעים קפואות בתרמו-סייקלר באמצעות התוכנית הבאה. לאחר מכן הגדר מיקס מאסטר PCR כפי שמוצג בטבלה זו.הוסף 21 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR לצינורות PCR נקיים ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של צינור הליזיס של התולעת וערבב היטב על ידי פיפטינג. לאחר מכן הפעל את תוכנית ה-PCR בהתאם להנחיות היצרן. טהר את תגובות ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי וריכוז DNA בהתאם להוראות היצרן.לאחר מכן יש לדלל את ה- DNA על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מים לעמוד הספין. לאחר הגדרת תערובת האנזים הראשית של ההגבלה, הוסף 10 מיקרוליטר לכל תגובת PCR נקייה ודגר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן הפרד את מוצרי ה-PCR המעוכלים על ג'ל אגרוז של 1.5% באמצעות מאגר TAE 1x ב-120 וולט.בדוק דגימות מעוכלות של אנזים לנוכחות רצועות המצביעות על בעלי חיים ערוכים פוטנציאליים. לאחר זיהוי בעלי חיים ערוכים פוטנציאליים, השתמש בשלושת המיקרוליטרים הנותרים של ליזיס תולעים וחזור על ה-PCR. לאחר מכן טען מיד את התגובות שהושלמו על ג'ל אגרוז 1% לפני הפרדת וחילוץ הרצועה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.באמצעות פריימר F1 בצע ריצוף סנגר כדי לזהות בעלי חיים ערוכים כהלכה. לבסוף, כדי להשיג בעלי חיים הומוזיגוטיים מבעלי חיים ערוכים הטרוזיגוטיים מאומתים, יש לבודד שמונה עד 12 חיות F2 ולבצע גנוטיפ ואימות רצף בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי להדגים את הפשטות, ההיתכנות והיעילות של הגישה המבוססת על CRISPR/Cas9 RNP, הגן C.Elegans sod-1 נועד להציג את וריאנט G93a האנושי הקשור למחלה בגנום התולעת.תמונת ג'ל זו מציגה את תוצאות הגנוטיפ עבור 24 בעלי חיים חיוביים ל-F1 mCherry . 10 הכילו שינוי מונואלי או דו-אלילי, 10 היו מסוג בר, שלושה היו אינדליים פוטנציאליים ואחד היה כשל PCR. כדי להדגים שסמן ה-mCherry הפלואורסצנטי מעשיר לשינוי הגנום, נבחרו שמונה בעלי חיים שליליים של mCherry מכל אחת משלושת לוחות ה-P0.רק בעל חיים אחד שונה כהלכה ואילו 23 היו מסוג בר. איור זה מציג את הכרומטוגרמה ממוצר ה-PCR המופק בג'ל באורך מלא, ומדגים כי שינויי הנוקלאוטידים המדויקים שתוכננו בתבנית ssODN HDR שולבו נאמנה בגנום של חיה F1 הומוזיגוטית זו. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור ולזהות מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans תוך ארבעה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להשתמש בריאגנטים וטכניקות נטולות גרעין כולל מים ללא RNase, קצות פיפטות מסנן וכפפות. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות תאיות, מולקולריות והתנהגותיות על מנת לחקור פנוטיפים שעשויים להיות קשורים למוטציה המעניינת. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור במדויק מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans באמצעות RNase כימרי יחיד וחלבונים ריבו-גרעיניים CRISPR/Cas9.

a-rapid-facile-pipeline-for-generating-genomic-point-mutants-c

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מתאר טכניקה לסינון מהיר של נמטודה בודדת לאיתור סמן גנטי על ידי בדיקת PCR. בפרוטוקול לדוגמה, אנו בודקים עריכת גנום מבוססת קריספר.

PCR תולעת יחידה: שיטה לחלץ ולהגביר DNA גנומי

סרטון זה מתאר מיקרו-הזרקה, שיטה נפוצה ליצירת זני C. elegans טרנסגניים. בדוגמה נראה מיקרו-הזרקה המשמשת להחדרת קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי קריספר.

Gonad Microinjection: שיטה של העברת תרכובות ישירות לתוך הנבט של C. elegans

CRISPR/Cas9 היא מערכת חזקה ליצירת שיבוש של גנים ואלמנטים גנטיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירה יעילה של מחיקות גנומיות בשורות תאים של יונקים באמצעות CRISPR/Cas9.

דור של מחיקות הגנומי בשורות תאים יונקים באמצעות CRISPR / Cas9

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

הגנום יישוב עריכה במערכת מודל רזבורה rerio (דג זברה) כבר באופן משמעותי בהנחייתם של הופעתה של גישות CRISPR. במסמך זה, אנו מתארים את פרוטוקול יעילים, חזקים הדור, זיהוי של אללים נגזר CRISPR שטויות המשלבת וזמינותו ניידות heteroduplex וזיהוי מוטציות באמצעות הדור הבא רצפי.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

פרוטוקול זה מספק שיטה כדי להקל על הדור של heterozygous או homozygous נוקלאוטיד שינויים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם pluripotent.

הדור של שינויים גנומית מוגדרים באמצעות CRISPR-CAS9 בתאי גזע האדם Pluripotent

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

מאמר זה מדגים הנדסת גנום בתיווך CRISPR-Cas9 ב-Steinernema hermaphroditum, נמטודה אנטומופתוגנית (EPN: חרק-טפילי) ומודל גנטי מתפתח. הטכנולוגיה המתוארת שימושית ליצירת מוטנטים, ומאפשרת הבהרה של פונקציות גנים בביולוגיית הנמטודות הרלוונטיות לסימביוזה הדדית וטפילית.

מוטגנזה מבוססת CRISPR-Cas9 בנמטודה אנטומופתוגנית Steinernema hermaphroditum ושימור קווי מוטנטים

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

למדו ליצור מוטציות נקודה גנומיות ב-C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון הומולוגיות. שיטה זו מאפשרת חקר מהיר של שונות גנטית בהקשר של בקרה רגולטורית אנדוגנית.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

גלה סרטונים נוספים