מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans באמצעות תבניות תיקון מכוונות הומולוגיה של אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים וריבונוקלאופרוטאינים CRISPR/Cas9. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח כגון קביעת ההשלכות הפתולוגיות של שונות גנטית הקשורה למחלות ניווניות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן ליצור מוטציות נקודתיות גנומיות במהירות, מה שמאפשר מחקר פונקציונלי של שונות גנטית בהקשר של בקרה רגולטורית אנדוגינית תוך הימנעות מהאזהרות של ביטוי יתר של חלבונים.

כדי לבצע בחירת יעד sgRNA, פתח את דף האינטרנט המוצג כאן. הזן כ-60 זוגות בסיסים של רצף המאגפים את העריכה הרצויה המעניינת. לאחר בחירת הגנום של C.Elegans והמוטיב הסמוך לפרוטוספייסר בהתאם לפרוטוקול הטקסט, לחץ על שלח.

בדף התוצאות, בחר את רצף היעד המדורג העליון הקרוב ביותר לעריכה המעניינת. עם הקבלה, צנטריפוגה את הצינור המכיל sgRNA ליופיליזציה בטמפרטורת החדר ולפחות 12,000 גרם למשך דקה אחת. הוסף 60 מיקרוליטר של TE נטול נוקלאז לצינור והשתמש בפיפטה p200 כדי להשעות בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 15 עד 20 פעמים.

הריכוז הסופי הוא 50 מיקרומולר. תכנן תבנית ssODN HDR המכילה את המוטציה המעניינת, אתר אנדונוקלאז ייחודי בהגבלת מסגרת, מוטציה שקטה של אחד או שני ה-Gs ברצף NGG PAM ו-50 זוגות בסיסים חמש זרועות הומולוגיה ראשוניות ושלוש זרועות הומולוגיה ראשוניות המאגפות את המוטציה הראשונה והאחרונה. עם קבלתה, צנטריפוגה את הצינור המכיל ssODN ליופיליזציה כפי שהודגם זה עתה ואז השתמש ב-DD H20 נטול נוקלאז כדי להשעות בעדינות את ssODN לריכוז סופי של 100 מיקרומולר.

להכנת תערובת הזרקה, צנטריפוגה את הריאגנטים המוצגים כאן במהירות מרבית וארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. בסדר הרשום, הוסף את הריאגנטים לצינור PCR נטול נוקלאז. לאחר מכן השתמש בפיפטה p20 כדי לערבב בעדינות וביסודיות את התוכן.

דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות. לאחר הזרקת בעלי חיים P0 על פי פרוטוקול הטקסט, אפשר להם להתאושש בטמפרטורת החדר למשך שעה עד שעתיים על צלחת NGM 35 מילימטר זרעי OP50. לאחר מכן, באמצעות פיק תולעת תיל פלטינה, העבירו חיות P0 מוזרקות בודדות ללוחות NGM בודדים של 35 מילימטר OP50.

יומיים לאחר ההזרקה השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות לוחות P0 המכילים צאצאי F1, המבטאים mCherry בלוע. בחר שלוש צלחות P0 המכילות את בעלי החיים החיוביים ביותר ל- mCherry F1. מכל אחת משלושת לוחות ה-P0 שנבחרו השתמשו בפיק תולעים כדי לבודד שמונה עד 12 בעלי חיים חיוביים ל-F1 חיובי ל-24 עד 36 mCherry חיוביים.

אפשר ל-F1s בודדים להפרות את עצמם ולהטיל ביצים בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים. לאחר יום עד יומיים של הטלת ביצים, השתמש בפיק תולעים כדי להעביר את ה-F1s למכסי צינור רצועת PCR בודדים המכילים שבעה מיקרוליטרים של מאגר ליזיס תולעים. צנטריפוגה של צינורות ה-PCR במהירות מקסימלית ובטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי להביא את החיות לתחתית הצינור.

לאחר מכן הקפיאו את הצינורות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן לייז תולעים קפואות בתרמו-סייקלר באמצעות התוכנית הבאה. לאחר מכן הגדר מיקס מאסטר PCR כפי שמוצג בטבלה זו.

הוסף 21 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR לצינורות PCR נקיים ולאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטר של צינור הליזיס של התולעת וערבב היטב על ידי פיפטינג. לאחר מכן הפעל את תוכנית ה-PCR בהתאם להנחיות היצרן. טהר את תגובות ה-PCR באמצעות ערכת ניקוי וריכוז DNA בהתאם להוראות היצרן.

לאחר מכן יש לדלל את ה- DNA על ידי הוספת 10 מיקרוליטר מים לעמוד הספין. לאחר הגדרת תערובת האנזים הראשית של ההגבלה, הוסף 10 מיקרוליטר לכל תגובת PCR נקייה ודגר את הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. לאחר מכן הפרד את מוצרי ה-PCR המעוכלים על ג'ל אגרוז של 1.5% באמצעות מאגר TAE 1x ב-120 וולט.

בדוק דגימות מעוכלות של אנזים לנוכחות רצועות המצביעות על בעלי חיים ערוכים פוטנציאליים. לאחר זיהוי בעלי חיים ערוכים פוטנציאליים, השתמש בשלושת המיקרוליטרים הנותרים של ליזיס תולעים וחזור על ה-PCR. לאחר מכן טען מיד את התגובות שהושלמו על ג'ל אגרוז 1% לפני הפרדת וחילוץ הרצועה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל.

באמצעות פריימר F1 בצע ריצוף סנגר כדי לזהות בעלי חיים ערוכים כהלכה. לבסוף, כדי להשיג בעלי חיים הומוזיגוטיים מבעלי חיים ערוכים הטרוזיגוטיים מאומתים, יש לבודד שמונה עד 12 חיות F2 ולבצע גנוטיפ ואימות רצף בהתאם לפרוטוקול הטקסט. כדי להדגים את הפשטות, ההיתכנות והיעילות של הגישה המבוססת על CRISPR/Cas9 RNP, הגן C.Elegans sod-1 נועד להציג את וריאנט G93a האנושי הקשור למחלה בגנום התולעת.

תמונת ג'ל זו מציגה את תוצאות הגנוטיפ עבור 24 בעלי חיים חיוביים ל-F1 mCherry . 10 הכילו שינוי מונואלי או דו-אלילי, 10 היו מסוג בר, שלושה היו אינדליים פוטנציאליים ואחד היה כשל PCR. כדי להדגים שסמן ה-mCherry הפלואורסצנטי מעשיר לשינוי הגנום, נבחרו שמונה בעלי חיים שליליים של mCherry מכל אחת משלושת לוחות ה-P0.

רק בעל חיים אחד שונה כהלכה ואילו 23 היו מסוג בר. איור זה מציג את הכרומטוגרמה ממוצר ה-PCR המופק בג'ל באורך מלא, ומדגים כי שינויי הנוקלאוטידים המדויקים שתוכננו בתבנית ssODN HDR שולבו נאמנה בגנום של חיה F1 הומוזיגוטית זו. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור ולזהות מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans תוך ארבעה עד חמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור להשתמש בריאגנטים וטכניקות נטולות גרעין כולל מים ללא RNase, קצות פיפטות מסנן וכפפות. לאחר הליך זה, ניתן לבצע בדיקות תאיות, מולקולריות והתנהגותיות על מנת לחקור פנוטיפים שעשויים להיות קשורים למוטציה המעניינת. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור במדויק מוטציות נקודתיות גנומיות ב-C.Elegans באמצעות RNase כימרי יחיד וחלבונים ריבו-גרעיניים CRISPR/Cas9.