Name: ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: חקור את שיטת Toeprinting לניתוח היווצרות מורכבות חניכת תרגום ב-mRNAs של יונקים. טכניקה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של מנגנוני תרגום מווסתים וכוללים IRES במחקר ביוכימי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו הייתה במימון של מדעי הטבע, מחקר המועצה של קנדה-גילוי הנדסית (RGPIN-2017-05463), קרן קנדה חדשנות-ג'ון ר אוונס מנהיגים קרן (35017), התוכנית מחדשת הקמפוס אלברטה, אלברטה משרד סחר ופיתוח כלכלי.

הערה: ה-RNA היא רגישים מאוד השפלה על-ידי ribonucleases (RNases). סטנדרט הזהירות כדי לשמור את הרנ א ללא שינוי. משתנים לעתים קרובות כפפות. להשתמש פיפטה מסוננים טיפים, נטולת נוקלאז plasticware, וכימיקלים נוקלאז ללא כל השלבים של הפרוטוקול. שימוש ללא נוקלאז או diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים עבור כל הפתרונות מטופלים.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכנת מאגר Toeprinting: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), 100 מ מ KOAc, 2.5 מ מ Mg(OAc)2, 5% (w/v) סוכרוז, spermidine dithiothreitol (DTT), ו- 0.5 מ מ 2 מ מ.<ol>
<li>לאחסן DTT, spermidine לשימוש יחיד aliquots ב-20 ° C כדי להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה. הערה: DTT, spermidine יש להוסיף למאגר toeprinting מיד לפני השימוש. פתרון חסר DTT, spermidine שניתן לאחסן ב-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין את aliquots של 85 מ מ 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP), מ מ 91 אדנוזין טריפוספט (ATP). לאחסן את aliquots ב-20 ° C.</li>
	<li>להכין 450 מ של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל מיקס: 67.5 מ של 40% acrylamide:bis-אקרילאמיד (19:1), g 189 של אוריאה, mL 112.5 של 5 x TBE (טריס/בוראט/thylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)), ו- 120 מ ל מים. להמיס האוריאה על-ידי חימום באמבט מים 37 ° C או על פלטה חמה עם ערבוב. לסנן את הפתרון (למשל., 0.2 μm ניטרוצלולוזה מסנן ואקום). הערה: הפתרון שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות. זהירות: אקרילאמיד Monomeric היא רעלן עצבי אשר יכול להיספג דרך העור. . שמור על עצמך כדי למנוע מגע עם העור (כלומר. ללבוש כפפות, מעיל המעבדה, עין הגנה). לזיהוי צריך גם לטפל טיפול, כפי הפילמור רשאי להמשיך עד 100% השלמת.</li>
	<li>להכין formamide בטעינת צבע: 95% formamide, EDTA 18 מ מ, 0.025% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (מרחביות), כחול bromophenol 0.025% (w/v), cyanol קסילן 0.025% (w/v). חנות ב-20 ° C.</li>
	<li>יתמוסס nmol 1 של פריימר (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' שכותרתו סיום עם IRDye 800.) 100 μL של מים עבור ריכוז עבודה של 10 pmol/μL. לאחסן ב-20 ° C ב- aliquots חד-פעמיים (µL כ 10), מוגן מפני אור.</li>
</ol>2. הכנת mRNA
<ol><li>להגביר את תבניות DNA לסינתזה של mRNA לפי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מתוך תבניות המתאימות (כלומר-, DNA גנומי או דנ א פלסמיד, לפי הצורך). להשתמש על אמינות גבוהה DNA פולימראז בהתאם להוראות היצרן, עם התנאים הבאים התגובה (מחזורים 35): להמיס, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; להרחיב, 72 ° C, 30 s. הערה: פריימר לפנים (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) משלבת את רצף יזם T7 כדי לאפשר שעתוק RNA; ומהצמיגים הפוכה (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) כולל שאריות תימין 51 לספק זנב poly-A הרנ א משועתקים. שימו לב כי ה-RNA ניתן גם במבחנה עיבד מ פלסמיד ה-DNA.</li>
	<li>שימוש ערכת שעתוק המתאים כדי במבחנה לתמלל המכילות IRES RNA או רצ'ט RNA מתבנית DNA. בצע הוראות היצרן. הכנת המדגם RNA רגיל 20 כרכים תגובה μL. להתייחס את הרנ א מסונתז החדש עם 2 יחידות של נטול RNase DNase למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לדלל את הרנ א שטופלו DNase עד 110 µL במים נטולי נוקלאז להוסיף 110 µL חומצת פנול, מערבולת 5 s וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב g 20,000 x בטמפרטורת החדר. הסר µL 100 של שלב מימית לרכבת התחתית microfuge 1.5 mL החדש, להוסיף 10 µL של 3 מ' סודיום אצטט, מערבולת 2 ס הוספה, שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, ולאחר לזרז את הרנ א ב-20 ° C בלילה.</li>
	<li>צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח וחזור על צנטריפוגה. האחות רב תגובת שיקוע ככל האפשר, מילה נהדרת בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.</li>
	<li>Resuspend את הרנ א באמצעי האחסון המתאים של מים נטולי נוקלאז להניב ריכוז העבודה של 0.5 μg/μL. זה יכול להיות מאוחסן ב- 80 ° C או שימוש באופן מיידי.</li>
</ol>3. Toeprinting תגובה
<ol><li>לערבב 15 μL של הארנב רטיקולוציט Lysate (כמובן, ררילה ררילה, אינם מטופלים נוקלאז), 1 μL (40 יחידות) של RNase מעכב, 1 µL של 91 מ מ ATP (סופי 1.82 גיגה מ"מ) μL 1 של 85 מ מ GMP-PNP (1.7 מ"מ הסופי) צינור microfuge 1.5 mL. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הערה: כמובן, ררילה ררילה צריך להיות aliquoted לשימוש יחיד להימנע ההקפאה-מפשיר חוזרות. פקד קריטי הוא תגובה חסר, כמובן, ררילה ררילה. כדי להבהיר את ההפסקות הטבעי של שעתוק במהופך בזכות מבנה משני הרנ א. להוסיף מאגר toeprinting להחליף כמובן, ררילה ררילה עבור פקד זה.</li>
	<li>להוסיף 0.5 µg (1 µL) של RNA, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 22 מאגר Toeprinting, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.</li>
	<li>להוסיף 0.5 µL (5 pmol) של פריימר התווית על-ידי IRDye, דגירה על קרח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להוסיף 2 µL של 25 מ מ dNTPs (הריכוז הסופי: 1 מ מ), 2 µL של 100 מ מ Mg(OAc)2, µL 1 של העופות Myeloblastosis וירוס רוורס טרנסקריפטאז (ס ס-RT) µL 3.5 Toeprinting מאגר. עוצמת הקול הסופי הוא 50 μL.</li>
	<li>דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.</li>
	<li>להוסיף 200 µL של מים נטולי נוקלאז ולחלץ מיד עם µL 250 25:24:1 פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (pH 8.0 בקירוב). מערבולת 5 s וצנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את שלב מימית צינור microfuge 1.5 mL, להוסיף שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, וכן לזרז ב-20 ° C בלילה.</li>
	<li>צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. רחץ בגדר DNA עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח. צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 15 דקות ב 4 º C. וביופסיה supernatant הרבה ככל האפשר, אוויר יבש בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.</li>
	<li>להמיס בגדר ב 6 μL של מים נטולי נוקלאז ולהוסיף 3 μL של formamide טעינה לצבוע.</li>
</ol>4. רצף תגובות
<ol><li>השתמש את תבנית ה-DNA מ 2.1 תחל את התווית על-ידי IRDye מהשלב 3.4 לתגובות רצף רגיל, באמצעות dideoxynucleotides (ddNTPs) כמו שרשרת מחסלים. השתמש ערכת המתאים של רצפי DNA ופעל לפי הוראות היצרן.</li>
	<li>מיקס 6 μL של כל תגובה רצף עם 3 μL של formamide טעינה לצבוע.</li>
</ol>5. הכנת רצף ג'ל ו אלקטרופורזה
הערה: פרוטוקול זה משתמש imager מבוסס על ג'ל של זריחה של 21 ס"מ על 23 ס"מ x ג'ל 0.2 מ מ, אך ניתן להתאים עבור סקוונסרים או ג'ל-גדלים, אחרים במידת הצורך.
<ol><li>ניקוי יסודי קפיציות 0.2 מ מ וכן את קצר (23 × 25 ס מ), זמן (30 × 25 ס מ) צלחות זכוכית עם 100% אתנול. אוויר יבש.</li>
	<li>לערבב 30 מ"ל של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל לערבב עם 200 μL של 10% (w/v) קירור (APS) ו 20 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED). יוצקים את הג'ל, מקפיד להימנע בועות, והכנס את המסרק ג'ל "כריש-שן". לאפשר את הג'ל פולימריזציה לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להרכיב את המנגנון רצף ולמלא את מאגרי מים עם 1 x TBE.</li>
	<li>מראש לפעול למשך 15 דקות ב-1500 V עד טמפרטורה אופטימלית של 55 ° C מושגת.</li>
	<li>מחממים את התמהיל צבע מדגם/טעינה (מן השלבים 3.9 או 4.2) עד 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק 1 טען μL על גבי הג'ל רצף.</li>
	<li>הפעל את הג'ל ב-1500 V עבור 8 שעות. המכונה יקרא הלהקות בזמן אמת.</li>
	<li>לפרק את המנגנון, ולחסל את ג'ל אקרילאמיד ואת מאגר הפעלה.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
<li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

המחברים שאין התנגשות-של-עניין לחשוף.

Toeprinting היא טכניקה חזקה למדוד ישירות את היכולת של RNA עניין לתמוך היווצרות של תרגום מתחמי חניכה בנסיבות מבוקרת מאוד. פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה עבור toeprinting RNAs יונקים. ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה) משמש כמקור נוח של הריבוזומים, eIFs, יוזם tRNA, IRES הטרנס-מתנהג גורמים (ITAFs). הנסיין מספק RNA שלהם של בחירה, יכול גם לשמש כתוספת התגובה toeprinting עם cofactors הספציפיים המעניינים אותם. למשל, 48S לעומת ה-80 תרגום חניכה מתחמי ניתן להבחין מבוסס על חלוקת עוצמות קרינה פלואורסצנטית...

כמו תרגום צורכת אנרגיה תאית ביותר, זה הגיוני כי התרגום הוא מוסדר בחזקה1. לעומת זאת, dysregulation של תרגום- והשינויים הסוגר בפלט חלבון-נצפית לעיתים קרובות במצבי סטרס-תגובה ומחלות, כגון סרטן1,2. היתרון העיקרי של שליטה translational הוא המהירות שבה תאים יכולים לשנות תפוקתן חלבון על מנת להגיב לגירויים שונים3. תרגום תקנה ובכך מייצג מנגנון חשוב זה יכול להשפיע על הישרדות cell ומוות1,2,3. השלבים של תרגום, חניכה הוא רוב מוסדר ומורכבות מאוד3. בקצרה, mRNAs האיקריוטיים להכיל 5' m7G כובע חיונית כמעט תמיד את התרגום שלהם. תלוי cap-חניכה דורש חניכה האיקריוטים גורמים eIF4E, eIF4A ו- eIF4G (cap-זיהוי המתחם) כדי לקיים אינטראקציה עם תום 5' של mRNA. 43S preinitiation הריבוזום מורכב, המכיל eIF2 מכורך יוזם tRNA, eIF3, הוא גויס לסוף 5' ה-mRNA דרך אינטראקציה של eIF4G עם eIF3. Preinitiation מורכבים נחשב לסרוק mRNA, שנעזר eIF4A (הליקאז RNA) עד codon ההתחלה (אוגוסט) ממוקם. לאחר מכן נוצרת הקבלה 48S מורכבים, סינתזת מועבר לתוך P-האתר של הריבוזום. בסופו של דבר, subunits ריבוזום בשנות ה-60 וה -40 מאוחדים כדי ליצור את ה-80 חניכה מורכב, ואחריו תרגום התארכות1,3,4. לעומת זאת, אתרים כניסה ריבוזום פנימית (IRESes) לעקוף את הדרישה כובע 5' על-ידי גיוס של יחידת משנה ribosomal ישירות אל codon חניכה3בשנות ה-40. מצבים פיזיולוגיים מתח להחליש הכללית תרגום mRNA בשל שינויים גורמי מפתח חניכה האיקריוטים כללי (eIFs). עם זאת, התרגום קאנונית חניכה מאפשרים לתרגום סלקטיבי של mRNAs מסוימים, אשר לעיתים קרובות לקודד את תגובת המתח חלבונים ולאחר dysregulation של תרגום קאנונית החניכה הייתה שם במדינות מחלות כמו סרטן 1 , 2. רכיבים רגולטוריות RNA דיסקרטי, כגון IRESes הסלולר, לאפשר התרגום של כזה2,mRNAs3.
היבט מעניין במיוחד אחד של שליטה translational היא להבין מנגנונים של הקנוני לעומת תרגום קאנונית mRNA נתון. Toeprinting היא טכניקה המאפשרת המחקר מכניסטית מפורט חניכה תרגום RNAs ספציפיים בתוך חוץ גופית. המטרה הכוללת של toeprinting הוא להעריך את היכולת של RNA עניין nucleate את היווצרות חניכה תרגום מורכב עם הריבוזום תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים נדרשים עבור תרגום יעיל חניכה. למשל, גיוס ריבוזום אולי הפריע בהיעדרו של כובע 5' אבל מגורה על ידי נוכחות IRES.
העקרון של השיטה היא במבחנה לתמלל של RNA של עניין, דגירה זה בנוכחות הסלולר תמציות המכילות רכיבים תרגום (או הרכיבים מטוהרים) כדי לאפשר חניכה מתחמי לטופס, וכדי להפוך לתמלל הרנ א עם פריימר ספציפיים. מתחמי RNA-ריבוזום יציב יגרום שעתוק במהופך לעכב בקצה 3' של הריבוזום-מה שנקרא 'toeprint'5,6,7.
ב פרוטוקול זה, ribosomal subunits, eIFs, tRNAs, ו IRES הטרנס-משחק גורמים (ITAFs) נתרמים בנוחות על ידי ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה). יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של פריימר fluorescently התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מבוסס על ג'ל imager, ולא פריימר radiolabeled. פעולה זו מבטלת צעדים נוספים, כולל radiolabeling הראשיים, כמו גם ייבוש הג'ל, לחשוף אותה למסך מעצימה. הלהקות פלורסנט נרשמים בזמן אמת, כמו שלשול ג'ל, המאפשרות ברזולוציה גדולה יותר. Uncapped X-linked המדכא של אפופטוזיס חלבון (XIAP) IRES RNA משמשת כדוגמה כאן, למרות mRNAs רצ'ט ניתן לנתח גם על-ידי טכניקה זו8.
בניגוד לניתוח המערבי, אשר מודד את הפלט הסופי של תהליך התרגום בתא lysates, toeprinting היא גישה במבחנה כדי למדוד את התרגום חניכה היווצרות מורכבות על RNA. גישה זו רדיוקציוניסטי מאפשרת לצורך המחקר ומפורט של סובסטרטים או גורמים המסדירים תרגום חניכה (למשל., רצ'ט או משולחים שאינם רצ'ט mRNA, IRES מבנה, נוכחות או היעדרות של זנב poly-A, אספקת חלבון ספציפי גורמים, וכו.). לפיכך, toeprinting ניתן ללמוד מצבים שונים של תרגום8 או ההשפעות של מבנים mRNA, כגון IRESes,9,של סינתזת חלבון10.

<table><tbody><tr><td>DEPC (דיאתיל פירוקרבונט)</td><td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>בסיס TRIS, Ultrapure</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (אשלגן אצטט)</td><td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2 (מגנזיום אצטט טטרהידרט)</td><td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז, ביולוגיה מולקולרית בדרגה</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין</td><td>סיגמא</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (גואנוזין 5&פריים;-[&בטא;,&גמא;-אימידו]טריפוספט טריסודיום מלח הידרט) תמיסה 0.1 M</td><td>סיגמא</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (אדנוזין 5&פריים;-טריפוספט) מלח דיסודיום, תמיסה 100 מ"מ</td><td>סיגמא</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 אקרילאמיד: ביס-אקרילאמיד, 40%</td> <td>ביו בסיסי</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>יחידות סינון בקבוק 500 מ"ל, 0.2 ומיקרו; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא</td><td>F9037-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (מלח דיסודיום, דיהידרט)</td> <td>ביו בייסיק</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>ביו בייסיק</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>ביו בייסיק</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול FF</td><td>ביו בייסיק</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 ערכת תמלול</td><td>אמביון</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פנול: כלורופורם (5: 1)</td> <td>אמביון</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25: 24: 1 פנול: כלורופורם: איזואמיל אלכוהול</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>ארנב רשתית ליזאט (RRL). לא צריך להיות מטופל בנוקלאז.</td><td>Green Hectares, ארה"ב</td><td></td><td>צור קשר עם Green Hectares, בקש 1:1 RRL:מים</td></tr><tr><td>RiboLock מעכב RNase (40 U/&micro; L)</td> <td>תרמו פישר</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>מערבבים חלקים שווים למלאי של 25 מ"מ כל אחד.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&micro; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase גרסה 2.0 ערכת ריצוף DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>דגם 4200 IR2 מנתח DNA</td><td>LI-COR</td><td></td><td>המוצר הופסק APS</td></tr><tr><td>(אמוניום פרסולפט)</td> <td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity Polymerase</td><td>חדש אנגליה Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>טורבו דנאז</td><td>תרמו פישר</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mrnas

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

תרגום חניכה היא הצעד הגבלת קצב של סינתזת חלבונים והוא מייצג נקודת מפתח שבה תאים לווסת את תפוקתן חלבון. רגולציה של סינתזת חלבונים היא המפתח מתח-תגובת תאי ולאחר dysregulation מקום מרכזי מדינות למחלות רבות, כגון סרטן. למשל, למרות מתח סלולארית מובילה עיכוב של תרגום הכללית על ידי חניכה תלויי-כיפה attenuating, חלבונים מסוימים הלחץ-תגובה סלקטיבית מתורגמים באופן שאינו תלוי-קאפ. דיסקרטי רכיבים רגולטוריות RNA, כגון אתרים כניסה הסלולר ריבוזום פנימית (IRESes), מאפשרים התרגום של אלה mRNAs ספציפיים. זיהוי של mRNAs כזה, אפיון מנגנוני הרגולציה שלהם, היה אזור מפתח בביולוגיה מולקולרית. Toeprinting היא שיטת המחקר של RNA מבנה ותפקוד כפי שהוא נוגע תרגום חניכה. המטרה של toeprinting היא להעריך את היכולת של במבחנה עיבד RNA ליצירת קומפלקסים יציבים עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים מעורבים ריבוזום איגוד — שלפני הסמן לטקס החניכה תרגום יעיל. לצד טכניקות אחרות, כגון ניתוח המערב והגדרת פרופיל polysome, toeprinting מאפשרת אפיון חזקים של מנגנוני ויסות תרגום חניכה.

בעבר תארנו את היכולת של IRES XIAP כדי לתמוך את החניכה תלוי cap-תרגום במבחנה8,10. Toeprinting הייתה הטכניקה מפתח לחקור את הפרטים מכניסטית חניכה XIAP IRES מורכבים. מבנה ה-DNA קידוד של mRNA המכיל את IRES XIAP (איור 1א') היה במבחנה עיבד ונחשפו ניתוח toeprinting. וריאנטים מוטציה של ה-mRNA XIAP IRES המשמש כאן מוצגים באיור 1B. ...

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

המטרה הכוללת של ניתוח הדפסת אצבעות זה היא להתבונן בהיווצרות קומפלקס התחלת התרגום על mRNA של יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תרגום mRNA, כגון התחלת תרגום בתיווך IRES. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע ניתוח מפורט של היווצרות קומפלקס התחלת תרגום על mRNA ספציפי.הרכיבו את תגובות השעתוק לתמלול RNA מתבניות ה-DNA המוגברות של PCR, המקודדות את ה-XIAP IRES RNA או המוטציות שלו. לאחר מכן, הוסף שתי יחידות של DNase נטול RNase כדי להסיר את תבנית ה-DNA לכל תגובה של 20 מיקרוליטר של RNA. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר מכן, יש לדלל את ה-RNA המטופל ב-DNase במים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 110 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 110 מיקרוליטר של פנול חומצי כדי להתחיל בטיהור RNA. מערבל את הדגימות למשך חמש שניות וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.זה קריטי לדלל את ה-RNA או ה-CDNA לפני מיצוי הפנול. אם הנפח נמוך מדי, יהיה קשה לשחזר פיזית את השלב המימי והתשואה הסופית תהיה נמוכה. לאחר מכן, העבירו בזהירות 100 מיקרוליטר מהפאזה המימית המכילה RNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.מוסיפים 10 מיקרוליטר של נתרן אצטט 3 M, pH 5.5, ומערבבים את הדגימות. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של 100% אתנול כדי לזרז RNA ומערבול את הדגימות למשך חמש שניות. דגירה למשך הלילה בחום של 20 מעל

toeprinting-analysis-translation-initiation-complex-formation-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מכשול משמעותי מנתח ביוכימיים של הריבוזומים המכיל המתהווה peptidyl-tRNAs כבר נוכחות של הריבוזומים אחרים דגימות אותו, ריבוזומים לא מעורב בתרגום של רצף ה-mRNA ספציפי להיות מנותח. פיתחנו מתודולוגיה פשוטה כדי לטהר, בלעדי, את הריבוזומים המכיל את המתהווה peptidyl-tRNA של עניין.

בידוד של הריבוזומים תרגום המכילים Peptidyl-tRNAs עבור ניתוח פונקציונלי מבנית

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

כאן, אנו מתארים את ההרכבה של RNA פולימראז II (Pol II) מתחמי התארכות הדורשים רק די-אן-איי סינתטי ו-RNA olig, ומטוהרים פול II. מתחמי אלה שימושיים עבור מנגנוני לימוד בבסיס עיבוד שכונתיות של התעתיקים הקשורים למכלול התארכות פול השני.

RNA מלאכותי פולימראז השני מכלולי התארכות לניתוח אירועים בעיבוד RNA

מעקב אחר אירועי תרגום בודדים מאפשר מחקרים קינטיים ברזולוציה גבוהה של מנגנוני תרגום תלויי כובע. כאן אנו מדגימים מבחנה במבחנה של מולקולה אחת המבוססת על אינטראקציות הדמיה בין נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לפפטידים המתהווים המתויגים באפיטופ. שיטה זו מאפשרת אפיון מולקולה אחת של קינטיקה של חניכה והתארכות פפטיד במהלך תרגום פעיל תלוי כובע במבחנה.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

פרוטוקול זה מתאר בדיקה עיתונאית כדי ללמוד את הרגולציה של תרגום mRNA ביציות בודדות במהלך התבגרות במבחנה.

הגדרת התוכנית של תרגום mRNA אימהי במהלך התבגרות במבחנה באמצעות בדיקה של כתב ביצית יחיד

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

חקור את שיטת Toeprinting לניתוח היווצרות מורכבות חניכת תרגום ב-mRNAs של יונקים. טכניקה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של מנגנוני תרגום מווסתים וכוללים IRES במחקר ביוכימי.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

גלה סרטונים נוספים