ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs
10 במאי 2018
Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.
המטרה הכוללת של ניתוח הדפסת אצבעות זה היא להתבונן בהיווצרות קומפלקס התחלת התרגום על mRNA של יונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תרגום mRNA, כגון התחלת תרגום בתיווך IRES. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע ניתוח מפורט של היווצרות קומפלקס התחלת תרגום על mRNA ספציפי.
הרכיבו את תגובות השעתוק לתמלול RNA מתבניות ה-DNA המוגברות של PCR, המקודדות את ה-XIAP IRES RNA או המוטציות שלו. לאחר מכן, הוסף שתי יחידות של DNase נטול RNase כדי להסיר את תבנית ה-DNA לכל תגובה של 20 מיקרוליטר של RNA. דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
לאחר מכן, יש לדלל את ה-RNA המטופל ב-DNase במים נטולי נוקלאז לנפח סופי של 110 מיקרוליטר. לאחר מכן, הוסף 110 מיקרוליטר של פנול חומצי כדי להתחיל בטיהור RNA. מערבל את הדגימות למשך חמש שניות וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
זה קריטי לדלל את ה-RNA או ה-CDNA לפני מיצוי הפנול. אם הנפח נמוך מדי, יהיה קשה לשחזר פיזית את השלב המימי והתשואה הסופית תהיה נמוכה. לאחר מכן, העבירו בזהירות 100 מיקרוליטר מהפאזה המימית המכילה RNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
מוסיפים 10 מיקרוליטר של נתרן אצטט 3 M, pH 5.5, ומערבבים את הדגימות. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של 100% אתנול כדי לזרז RNA ומערבול את הדגימות למשך חמש שניות. דגירה למשך הלילה בחום של 20 מעלות צלזיוס.
למחרת, צנטריפוגה של הדגימות ב-20,000 x גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את הגלולה עם 500 מיקרוליטר אתנול קר כקרח 70% וחזרו על הצנטריפוגה. שאפו בזהירות כמה שיותר סופרנטנט מבלי לעקור את הגלולה.
לאחר מכן, יבש את הכדור באוויר למשך חמש עד 10 דקות. השעו מחדש את הגלולה במים נטולי נוקלאז לריכוז סופי של 0.5 מיקרוגרם למיקרוליטר. כדי להתחיל בבדיקת הדפסת האצבעות, הוסף 15 מיקרוליטר של ליזאט רטיקולוציטים ארנב שאינו מטופל בנוקלאז לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, המייצגים את ה-XIAP IRES RNA מסוג הבר והמוטציות שלו.
הוסף מעכב RNase, ATP ו-GMP-PNP לכל צינור. דגירה בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו מיקרוליטר אחד של ה-RNA המתאים לכל אחד מהצינורות ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות נוספות.
במהלך תקופת הדגירה, הוסף DTT וספרמידין למאגר הדפסת האצבעות. לאחר מכן, הוסיפו 22 מיקרוליטר של מאגר הדפסת אצבעות לכל אחד מהצינורות ודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 0.5 מיקרוליטר של צבע IR עם תווית פריימר להדפסת אצבעות ודגר את התגובה על קרח למשך 10 דקות.
לאחר מכן, הוסף שני מיקרוליטר של dNTPs, שני מיקרוליטר מגנזיום אצטט ומיקרוליטר אחד של טרנסקריפטאז הפוך של נגיף מיולובלסטוזיס עופות. הביאו את הנפח הסופי ל-50 מיקרוליטר עם מאגר הדפסת אצבעות. לאחר מכן, אפשר להארכת פריימר להתרחש למשך 45 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
זה גם קריטי להוסיף מגנזיום אצטט לתגובת טביעת האצבעות, שבלעדיה, הטרנסקריפטאז ההפוך לא יתפקד בצורה מיטבית. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז. הוסף 250 מיקרוליטר של 25:24:1 פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל, pH 8.0, כדי להתחיל בטיהור ה- cDNA.
לאחר מערבולת הדגימות במשך חמש שניות, צנטריפוגה את הדגימות ב-20,000 x גרם בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר מכן, העבירו בזהירות את השלב המימי המכיל את ה-DNA לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. לאחר מכן, הוסף שלושה נפחים של 100% אתנול כדי לזרז את ה-DNA והמערבולת למשך חמש שניות.
דגירה למשך הלילה בחום של 20 מעלות צלזיוס. למחרת, צנטריפוגה את הצינורות ב-20,000 x גרם למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, שטפו את כדור ה-DNA עם 500 מיקרוליטר אתנול 70% קר כקרח וצנטריפוגה ב-20,000 x גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שאפו כמה שיותר סופרנטנט, והקפידו לא לעקור את הכדור. לאחר מכן, יבש את הכדור באוויר למשך חמש עד 10 דקות. ממיסים את גלולת ה-DNA בשישה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז.
לאחר מכן, הוסף שלושה מיקרוליטרים של צבע טעינת פורממיד. השתמש בערכת ריצוף כדי להכין סולם ריצוף נוקלאוטידים דידאוקסי עם פריימר הדפסת האצבעות ומבנה ה-DNA המקודד את ה-XIAP IRES RNA. לאחר מכן, מערבבים שישה מיקרוליטרים מכל תגובת ריצוף עם שלושה מיקרוליטרים של צבע טעינת הפורממיד.
לאחר ניקוי והרכבת הצלחות, שפכו את הג'ל והכניסו את המסרק. לאחר פילמור הג'ל, הרכיבו את מנגנון הרצף ומלאו את המאגרים ב-1x TBE. לאחר מכן, הפעל מראש ב-1500 וולט למשך 15 דקות עד להשגת טמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס.
מחממים את כל הדגימות בצבע פורממיד ל-85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, טען מיקרוליטר אחד מכל דגימה על ג'ל ריצוף פוליאקרילאמיד 6% והפעל את הג'ל ב-1500 וולט למשך שמונה שעות. לבסוף, קרא את הרצועות בזמן אמת עם הדמיה מבוססת פלואורסצנט.
שיטה זו מראה כי אישור RNA הוא קריטי להיווצרות קומפלקס התחלת תרגום. השעתוק ההפוך של קומפלקס ריבוזום mRNA XIAP מניב טביעות אצבעות אופייניות של 17 עד 19 נוקלאוטידים במורד הזרם של AUG. המוטציה 5'PPT מראה פגיעה בהיווצרות טביעות אצבעות.
עם זאת, כאשר הוא מתומלל עם ה-5'cap, מתרחשת היווצרות מורכבת חניכה. באופן דומה, המוטציה 3'PPT מראה גם פגיעה בהיווצרות טביעות אצבעות. עם זאת, שעתוק עם 5'cap מוביל להיווצרות מורכבת של התחלה.
מוטנט ה-PPT הכפול המכיל את המוטציות 5'PPT ו-3'PPT מסוגל ליצור את קומפלקס החניכה ללא ה-5'cap. היווצרות טביעת הרגליים נפגעת מאוד עבור מוטנט קודון ההתחלה בהיעדר RRL ו-GMP-PNP וזנב פולי A. מוצרי ה-CDNA מושווים לסולם ריצוף נוקלאוטידים דידאוקסי.
בטא גלובין אנושי, או HBB mRNA, אינו מראה טביעת אצבע בהיעדר 5'cap. עם זאת, קומפלקס החניכה נוצר על ה-5'UTR המכוסה של HBB, ומניב טביעות אצבעות של 16 עד 18 נוקלאוטידים במורד הזרם של AUG. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים, כולל הכנת תבניות תמלול במבחנה ו-RNA, אם מבוצעת כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקה מבנית על מנת לענות על שאלות נוספות כמו המבנה המשני של גרסאות הפרא או המוטנטיות של ה-IRES. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תרגום ה-mRNA לחקור תרגום מתווך IRES במבחנה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע הדפסת אצבעות של mRNA של יונקים ולנתח את היווצרותם של מתחמי התחלת תרגום.
אל תשכח שחומצה-פנול, פנול: כלורופורם, אלכוהול איזואמיל ואקרילאמיד יכולים להיות מסוכנים ביותר. יש ללבוש ציוד מגן אישי מתאים בזמן השימוש בריאגנטים אלה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
ניתוח toe-printing זה נועד למדוד את היווצרותם של קומפלקסים של פתיחת תרגום על mRNA של יונקים. הוא מספק תובנות לגבי מנגנוני תרגום התלויים ב-cap וגם כאלו המונעים על ידי IRES.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- Toeprinting היא טכניקה המשמשת לחקר תחילת התרגום.
- היא מאפשרת ניתוח של אינטראקציות ספציפיות של mRNA עם ריבוזומים.
- ניתן להחיל את השיטה כדי לחקור תחילת תרגום המתווכת על ידי IRES.
- הבנת תהליכים אלו היא קריטית להשגת תובנות לגבי ויסות ביטוי גנים.
מטרת המחקר
- לצפייה בהיווצרותם של קומפלקסים של התחלת תרגום על mRNA של יונקים.
- לבחינת המנגנונים של התחלת תרגום המתווכת על ידי IRES.
- לספק ניתוח מפורט של התחלת תרגום על mRNA ספציפיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תגובות שעתוק מורכבות לצורך שעתוק RNA מתבניות DNA שהוגברו באמצעות PCR.
- DNase נטול RNase מתווסף כדי להסיר את תבנית ה-DNA מתגובות ה-RNA.
- הדגירה מבוצעת בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.
- ניתוח Toeprinting מבוצע כדי להעריך את היווצרות הקומפלקס.
תוצאות עיקריות
- השיטה מדגימה בהצלחה את היווצרותם של קומפלקסים של התניית תרגום.
- מתקבלים תובנות לגבי התניית תרגום המתווכת על ידי IRES.
- ניתן לנתח בפירוט אינטראקציות ספציפיות של mRNA עם ריבוזומים.
- הטכניקה מספקת מסגרת חסונה לחקר התניית תרגום.
מסקנות
- טואפרינטינג (Toeprinting) היא שיטה יעילה לחקר תחילת התרגום.
- הטכניקה משפרת את ההבנה של מנגנוני תרגום mRNA.
- ניתן להחיל אותה על סוגים שונים של mRNA כדי לבחון את דינמיקת התרגום שלהם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
ניתוח טואפרינטינג (Toeprinting) מאפשר בחינה מדויקת של מנגנוני התחלת התרגום, המהווים נקודת בקרה קריטית בוויסות סינתזת חלבונים. שיטה זו מספקת תובנות יישמיות לגבי תרגום תלוי-ב🧢 (cap-dependent) ותרגום המתווך על ידי IRES, ובכך היא תורמת ישירות לתיקוף מטרות ולהפחתת סיכונים מנגנוניים בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולתה לנתח אלמנטים רגולטוריים ואינטראקציות של ריבוזומים תומכת בביטחון חיזוי לצורך מיון פורטפוליו במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה ישירה של קישור ריבוזומים לרצפים ומבנים ספציפיים של mRNA.
- מבהיר את ההשפעה הפונקציונלית של אלמנטים רגולטוריים כגון IRES על תחילת התרגום.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבחנה בין מסלולי התחלה תלויי-cap למסלולים בלתי תלויים-cap.
- מקל על תיקוף מונחה-היפותזה של נקודות בקרה תרגומית הרלוונטיות למצבי מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת מתוּקפסת לכימות של היווצרות קומפלקס פתיחת התרגום תחת תנאים מוגדרים.
- מאפשר מדידה הדירה של אינטראקציות בין mRNA מוטנטי וסוג בר (wild-type) לבין ריבוזומים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך סריקה המשכית של מווסתים של התרגום.
- מספק תוצרים כמותיים המשמשים להערכת תרכובות ולסריקה מכניסטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם מודלים רלוונטיים למחלות באמצעות בחינת מנגנוני תרגום של תגובת מאמץ.
- תומך ברצף מהגילוי המולקולרי ועד לתיקוף פרה-קליני של בקרה תרגומית.
- מאפשר התקדמות מותאמת סיכונים על ידי הבהרת ההשפעה התרגומית של אלמנטים רגולטוריים של RNA.
- מספק נתונים מכניסטיים לשם פיתוח סממנים ביולוגיים להתערבויות מבוססות תרגום.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ה-Toeprinting ממוקמת בתוך הרצף שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המוליך (lead identification), ובכך היא מגשרת בין הבהרה של מנגנונים מולקולריים לבין פיתוח בדיקות עבור תוכניות המכוונות לתרגום.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות לגבי מנגנוני פתיחת תרגום ותפקוד של אלמנטים רגולטוריים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור היווצרות קומפלקס פתיחת התרגום.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה ישירה של יעילות פתיחת תרגום בין mRNA מסוג wild-type לבין mRNA מוטגני.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מולקולריים לבקרת תרגום רלוונטית למחלות ומסלולי תגובה למעבדות (stress-response).
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לבחינה של mRNA ואלמנטים רגולטוריים מגוונים לאורך תוכניות מחקר שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות ומפחית עמימות מנגונית בבקרת התרגום.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות התחלת תרגום לצורך הדירות ויכולת הרחבה בין צוותי מו"פ.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go באמצעות הבהרת הבקרה התרגומית ותמיכה בקידום תיק פיתוח יעיל הונית.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מטרות ומנגנונים מותאם סיכון, המבוסס על נתוני בקרה תרגומית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול ב-RNA, תעתוק in vitro והרכבת קומפלקס ריבוסומלי.
- נדרשת גישה לריאגנטים ייעודיים, דימות פלואורסצנטי ותשתיות ריצוף.
- נדרש סטנדרד קפדני בין צוותים לצורך כימות toeprint הדיר.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור תבניות mRNA שונות או הקשרי אלמנטים רגולטוריים שונים.
- טיפול זהיר בריאגנטים מסוכנים ואופטימיזציה של תנאי התגובה חיוניים לקבלת תוצאות מהימנות.
