Name: וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: למד שיטת משלוח ויראלי של CRISPR/Cas9 לערמונית העכבר לעריכת גנים מהירה. טכניקה זו מאפשרת שינוי ביטוי גנים אורתוטופי ומספקת מודל חדש לחקר סרטן הערמונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מר מומן על ידי התחברות של האגודה למלחמה בסרטן הדני (R146-A9394-16-S2). MFB ו MKT היו ממומן על-ידי AUFF נובה (AUFF-E-2015-FLS-9-8). מר MFB משותפת, במימון בית הספר, בריאות, AU. המעבדה E.F.W. נתמך על ידי מענקים ממשרד ספרדית של הכלכלה (SAF2015-70857, שותפה במימון על ידי ERDF-האיחוד האירופי), של ERC מתקדם גרנט (741888 - CSI-Fun).
אנחנו רוצים להודות ליליאנה Fajardo מלור (גנים, פיתוח ומחלות; לחקר הסרטן הלאומי) לקריאה ביקורתית של כתב היד.

פרוטוקול זה כרוך הליך כירורגי של עכברי מעבדה. ניסויים בבעלי חיים כל חייב להיות בנפרד נבדקו ואושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC). כמו הגישה מבוססת על שחזור בעלי חיים, הישרדות, ודא ההרדמה המתאימה לניהול כאב, סביבה כירורגי aseptic בכל עת. השתמש כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה במהלך הניתוח ועד ההתאוששות מן ההרדמה.
1. הפעלת שיקולים
<ol><li>בהתאם הנגיף שימש, דרישות כייל נוגדנים שונים עשויים לחול; לדלל את הוירוס בהתאם. הערה: בדוגמה זו, וירוס Adeno-הקשורים בלתי מדולל ב- PBS מוזרק ב כייל של עונה 1 פרק 10-12 IU/mL. הנגיף מכיל מדריך RNA Pten , ביטוי של חלבונים Cre תחת promotor אוביקוויטין (איור 1), ויש serotype 9. אובדן Pten גדל pAKT והתפשטות של האפיתל של הערמונית13.</li>
	<li>השתמש עכברים זכרים בגיל 8 שבועות בזמנו של ניתוח כדי להבטיח פיתוח הערמונית נאותה. הערה: עכברים הראו בניסוי זה הם עכברים knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP על רקע C57BL/6J12 (איור 1).</li>
	<li>טרי להכין תערובת הרדמה כללית, אם אפשר שיהיה סטרילי. הערה: עבור שחזור בעלי חיים טוב יותר לאחר הניתוח, תרופת הרדמה מומלץ מאוד.<ol>
<li>כדי להכין את הנפח הכולל של הרדמה 5 מ"ל, מערבבים 0.15 מ ל medetomidine הידרוכלוריד (1 מ"ג/מ"ל), midazolam 0.4 מ ל (5 מ"ג/מ"ל) ו 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) עם 4.2 mL סטרילי מים מלוחים. הערה: ניתן להשתמש שיטות הרדמה חלופי, כמו איזופלוריין נשימים, על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
		<li>כדי להפוך את האפקט של medetomidine הידרוכלוריד לאחר הניתוח, מערבבים atipamezole 0.1 מ"ל (5 מ"ג/מ"ל) עם 4.9 מ ל מים מליחים סטרילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין סביבה כירורגי aseptic מאת נכונה חיטוי ועיקור. אוטוקלב מכשירי ניתוח לפני השימוש.</li>
</ol>2. וירוס-משלוח הערמונית מאתר
<ol><li>עזים ומתנגד החיה על ידי זריקה בקרום הבטן עם מזרק עקר 1 מ"ל, מחט 27G x ½". השתמש מנה הרדמה של 0.01 מ ל/גרם משקל. אם ההליך נמשך יותר מ 30 דקות, לשמור על הרדמה על ידי הזרקת מנה 1/3 של ההתחלה כל 30 דקות.</li>
	<li>בדוק את עומק הרדמה על-ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגה פדלים, רפלקסים palpebral. כאשר אובדן רפלקסים נצפית, לגלח את הבטן התחתונה של החיה.</li>
	<li>בזהירות לכסות את העיניים של החיה עם וטרינרי משחה אופטלמולוגיות באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי כדי למנוע עיוורון עקב חוסר רפלקס המצמוץ.</li>
	<li>נגב את הבטן מגולח עם 70% אתנול וביו -10% povidone יוד לחטא את האזור הכירורגי. לשפשף את האזור הכירורגי במרכז האזור כירורגי לעבר הפריפריה.</li>
	<li>לבצע חתך אנכי העור בקו האמצע בבטן נמוך של 1 ס מ בעזרת מספריים כירורגי סטרילי.</li>
	<li>הרם את הצפק באמצעות מלקחיים הצבע בסדר כדי למנוע פגיעה האיברים הן הנחת מתחת. בזהירות לעשות חתך < 8 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים דרך הצפק. הערה: בניגוד אנושית, בלוטת הערמונית של מכרסם כוללת ארבע אונות נפרדים. האונה הקדמי מחוברת של שלפוחית הזרע.</li>
	<li>להניע בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. באמצעות מלקחיים טבעת, בזהירות להרים שלפוחית הזרע עד הקדמי הערמונית יכולה להיות מזוהה (איור 1).</li>
	<li>תזריק את הנפח הכולל של פתרון וירוס (3 x 1010 חלקיקים נגיפיים) µL 30 קדמי האפיתל הערמונית באמצעות מזרק אינסולין 0.5 mL עם מחט 30G x 8 מ מ. למזער את זליגת ולהבטיח שהנוזל נספג בתוך הרקמה, ויצרו בועה קטנה. מקם את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.</li>
	<li>תפר של הצפק עם תפרים קטע פשוט 2-3, 6-0 נספגים באמצעות של 13 מ מ, 3/8 circle ו מחט להתחדד לנקודה.</li>
	<li>סיכת הידוק העור עם 3 קליפים סטרילי 4.8 x 6.5 מ"מ הרמת העור עם מלקחיים כדי למנוע נזק של הצפק.</li>
	<li>להתאוששות טובה יותר, החל תרופת הרדמה במנה של 0.01 מ ל/גרם משקל בזריקה בקרום הבטן באמצעות מזרק עקר 1 מ"ל ו מחט 27G x ½". בזהירות המקום האחורי חיות בכלוב שלו.</li>
</ol>3. לאחר הניתוח נהלים
<ol><li>שמור את הכלוב עם עכברים נותח על משטח חימום עבור 1 h לאחר הניתוח, כדי למנוע היפותרמיה עד החלים לחלוטין. אם הנוגדן מוחל, החיה צריך להיות ער, דקות ספורות לאחר ההזרקה.</li>
	<li>לפקח על החיות מדי יום עבור אינדיקציות ריפוי וכאב הפצע המתאים. במידת הצורך, לנהל משככי כאבים נוספים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
	<li>להסיר סרטונים העור אחרי 4-5 ימים, לאחר הפצע סגור.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשנות ביטוי גנים באונה הקדמי של הערמונית מאתר באמצעות הזרקת וירוס, יצירת מודל חזק עכבר חדש עבור סרטן הערמונית (איור 2). ניהול מוצלח אדנו תוארה לראשונה על ידי Leow et al. . ב- 2005-8. בעבר הראינו איך קידוד אדנו Cre recombinase חלבון יכול להחליף גוזלת זמן בין מטלטלין של אלל Cre רקמות ספציפיות מחיקה 9 (איור דו-ממדי). מאז הנגיף מדביק תאים מספר9, מודל זה מח...

זיהוי וטיפול בסרטן הערמונית השתפרו משמעותית בעשור האחרון. ובכל זאת, השכיחות של סרטן הערמונית עולה, בעקבות תוחלת החיים. משוערת 1.1 מיליון מקרים חדשים ברחבי העולם, זה בין הסיבות הנפוצות ביותר של מוות מסרטן גברים 1. סרטן הערמונית הוא איטי בהתפתחות שלו, אך כאשר הסרטן התפתחה למצב גרורתי מתקדם, הפרוגנוזה הוא עני בשל אפשרויות הטיפול מוגבל. עד כה, רק כמה גנים זוהו מנהלי התקנים נפוצים ב סרטן זה, ופוגע שלה הטרוגניות, multifocality זיהוי של סמנים ביולוגיים, מחלת targetable מנהלי התקנים2,3.
לטכניקות GEMMs ביצירת הם לעיתים קרובות לקוי על ידי המורכבות שלהם, הוצאות בזמן ועלויות. מודלים נוקאאוט מותנה היה בשימוש נרחב לחקר סרטן הערמונית המועמד גנים, כי התוצאה עובריים קטלני כאשר לא פעיל ב germline4. הדגמים הנפוצים ביותר לערב של recombinase Cre ספציפיים הערמונית מושפעת גם ששונה Probasin5 או מקדם6 PSA משולב של GEMM על ידי הצלב מטלטלין נוספים. דגמים אלה, הגן עניין יהיה ממוקד ברוב המכריע של הערמונית תאים אפיתל, יצירת היפרפלזיה האיבר כולו, אשר עשוי לפגום של החיה בדרכי השתן פונקציה7.
משלוח ויראלי של החלבון Cre בזריקה לתוך האונה הקדמי של הערמונית מאתר ניתן לפתור בעיה זו על ידי מיקוד רק תאים מספר8. התחשבות דרישות טכניות מעבדות, מומחיות, מטרות, יתרונות שיטת מקשת רחבה של ווריאציות אפשריות. גישות מוצלחת ניצול אדנו מיקוד JunB , Pten9 או Lentivirus מיקוד Pten ו- Trp5310 הוכחו בין השאר. הוספת transgenes, כגון לוציפראז, הבונה ויראלי או GEMM את יתר על כן תאפשר פולשני ניטור של התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה11.
הגנום עריכה מבוסס על טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מגלה הזדמנות חדשה ומהירה ללמוד סרטן באמצעות יצירה מהירה של הסתרה סומאטית12. משלוח ויראלי של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) למזהים ייחודיים של האונה הקדמי של הערמונית מאתר יוצר מודל פיזיולוגית רלוונטיים יותר של סרטן הערמונית. בכך תאים בודדים נשיאת מוטציות שבחרת יכולים ליצור שיבוטים מסוגלים התפשטות ופלישה. יתר על כן, השימוש מדריך RNAs עבור גנים יעד מרובים יפיק שיבוטים תאים עם שינויים בגנים שונים. פעולה זו תאפשר גידול הטרוגניות, לחץ הברירה הטבעית על התקדמות סרטן, אשר יכול לחשוף את החשיבות של כל שינוי גנטי או מנגנונים epistatic.
כאן אנו מציגים שיטה להעביר נגיפים הערמונית מאתר עבור שינוי של ביטוי גנים. בטן חתך קטן, האונה הערמונית הקדמי מאתר חשוף, נגיפים מוזרקים לתוך האונה. חמישה ימים לאחר הניתוח, ניתוח קליפים ניתן להסיר מן העור, ניתן לנתח את סרטן הערמונית מ- 8 שבועות לאחר. בסך הכל, זה הליך מהיר וחסכוני, יש השפעה קטנה על העכבר ומאפשר הגידול גדול יותר לפתח מבלי להתפשר על העכבר.

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J עכברים</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 מ"ל U-100 מזרק אינסולין</td><td>BD</td><td>324825</td><td>להזרקת וירוסים</td></tr><tr><td>1 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>300013</td><td>להזרקת הרדמה</td></tr><tr><td>30 גרם 1/2' ' מחט</td><td>BD</td><td>304000</td><td>להזרקת הרדמה</td></tr><tr><td>6-0 תפר פוליסורב</td><td>מדטרוניק</td><td>GL889</td><td>לסגירת הצפק</td></tr><tr><td>וילון ניתוח מעוקר חד פעמי מספר</td><td>ספקים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>מספר ספקים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Prep Pad</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>זמירה מכונה</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>לגילוח הבטן</td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט מיקרו Halsey</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דפוס צר</td><td>FST</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים טבעתיים</td><td>FST</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>ידית מערכת קליפ פצע כולל קליפסים</td><td>FST</td><td>12030-01</td><td>לסגירת העור</td></tr><tr><td>מסיר מערכת קליפ פצע</td><td>FST</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td></td><td>נעשה שימוש בדגמים שונים</td></tr> <tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>מתקבל ממתקן בעלי חיים</td></tr><tr><td>בוטאורפנול</td><td></td><td></td><td>שהושג ממתקן בעלי חיים</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td></td><td>שהושג ממתקן בעלי חיים</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>שהושג ממתקן בעלי חיים</td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>וירוס (AAV, AV)</td> <td>וירוס ספקים</td><td></td> מרובים <td>המשמש בפרוטוקול זה הוא</td></tr><tr><td>נוגדן pAKT</td> ייצור פנימי <td>CST</td><td>4060</td><td>בשימוש 1:200 דילולציה</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>בשימוש 1:100 דילולציה</td></tr></tbody></table>

וירוס משלוח של מדריכים crispr הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

עם השכיחות הגוברת של סרטן הערמונית, זיהוי של הגידול מנהלי התקנים חדשים או מאפננים היא קריטית. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) עבור סרטן הערמונית מונעים על ידי גידול הטרוגניות ואת הדינמיקה שלה microevolution מורכבים. סרטן הערמונית המסורתית העכבר דגמים הכוללים, בין השאר, germline, הסתרה מותנה, ביטוי הטרנסגניים oncogenes ומודלים xenograft. דור של מוטציות דה נובו מודלים אלה הוא מורכב, זמן רב ויקר. בנוסף, רוב המודלים המסורתיים יעד הרוב המכריע של האפיתל הערמונית, ואילו האדם סרטן הערמונית הוא ידוע להתפתח ארוע בודד ברק תת קבוצה קטנה של תאים. מודלים יקר צריך לדמות לא רק סרטן הערמונית חניכה, אלא גם סדר מחלה מתקדמת.
כאן נתאר שיטת למטרה מספר תאי האפיתל הערמונית על ידי תאים transducing על ידי נגיפים. המשלוח של וירוס מהונדס הערמונית מאתר מאפשרת שינוי של ביטוי גנים epithelia הערמונית. וירוס סוג וכמות בזאת יגדירו את מספר תאים ממוקדות עבור שינוי גנטי על ידי transducing כמה תאים לטקס החניכה סרטן ותאים רבים עבור ריפוי גנטי. באמצעות הזרקת המבוסס על ניתוח באונה הקדמי, דיסטלי מן המסלול בדרכי השתן, הגידול במודל זה ניתן להרחיב מבלי ופוגע הפונקציה השתן של החיה. יתר על כן, על ידי מיקוד רק ערכת משנה של הערמונית תאים אפיתל הטכניקה מאפשר משובט הרחבה של הגידול, ולכן מחקה גידול אנושי חניכה, התקדמות, כמו גם פלישה דרך קרום הבסיס.
טכניקה חדשנית זו מספק מודל חזק סרטן הערמונית עם שיפור הרלוונטיות פיזיולוגיים. סבלם של בעלי החיים היא מוגבלת, שכן אין גידול נוסף נדרש, מונה בסך הכל בעלי חיים מצטמצם. באותו הזמן, ניתוח של גנים מועמדים חדשים מסלולים היא מואצת, וזה בתורו עלות גבוהה יותר יעיל.

כדי להעריך וירוס משלוח הערמונית מאתר, דגימות נותחו 3 חודשים אחרי הניתוח. עכברים Rosa26-LSL-Cas9-EGFP12 מבטאים את ה-GFP בתאים נחשפו Cre לחלבון מבוטא על ידי הוירוס. הדגימות הערמונית נבחנו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות כדי לזהות אזורים עם GFP אות (איור 2 א). האות ה-GFP מציין פעילות Cre האפיתל הערמונית אבל לא אם ג'ין עריכה יש כבר המושרה על ידי מדריך CRISPR. Immunohistochemical מקטעים הראה תחומי פעילות של תאים עם ביטוי גבוהה של pAKT (<strong cla...

פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לשנות את ביטוי הגנים בערמונית העכברית על ידי אספקה ויראלית של מדריכי CRISPR Cas9 לזירוז סרטן הערמונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חדשות בביולוגיה של סרטן הערמונית בנוגע לניתוח ואימות גנים חדשים בסביבה in vivo. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת עריכה מהירה של גנים מרובים על ידי התמקדות רק בתת-קבוצה של תאי הערמונית כפי שניתן לראות בתרחיש האנושי.מישהו חדש בהליך עשוי להיאבק בהתחלה בגלל גודל האיבר, והדיוק הדרוש לסיום כירורגי מוצלח. להכנת נפח כולל טרי של 5 מיליליטר הרדמה, מערבבים 0.15 מיליליטר של מ"ג אחד למיליליטר מדטומידין הידרוכלוריד, 0.4 מיליליטר של 5 מ"ג למיליליטר מידזולם, ו-0.25 מיליליטר של 10 מ"ג למיליליטר בוטורפנול. לאחר מכן, הוסיפו 4.2 מיליליטר מים מלוחים סטריליים.כדי להפוך את ההשפעות של מדטומידין הידרוכלוריד לאחר הניתוח, יש לערבב 0.1 מיליליטר של 5 מ"ג למיליליטר אטיפמזול עם 4.9 מיליליטר מי מלח סטריליים כתרופת הרדמה. הכינו סביבה כירורגית אספטית על ידי חיטוי ועיקור נאותים וחיטוי המכשירים הניתוחיים. להעביר וירוס לערמונית, לאחר הרדמת עכבר זכר בן שמונה שבועות לפי פרוטוקול הטקסט; לבחון את עומק ההרדמה על ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגת דוושה ורפלקסים מוחשיים.כאשר נצפה אובדן רפלקסים, יש לגלח את הבטן התחתונה של החיה. בעזרת צמר גפן סטרילי, כסו בזהירות את עיני החיה במשחת עיניים וטרינרית כדי למנוע עיוורון הנגרם על ידי קסרופתלמיה. לאחר מכן, השתמש ב-70% אתנול ו-10% יוד פרובידון כדי לנגב את הבטן המגולחת כדי לחטא את אזור הניתוח.לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים, בצע חתך עור אנכי של כסנטימטר אחד בקו האמצע של הבטן התחתונה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים נקודתיים עדין, הרם את הצפק כדי למנוע פגיעה באיברים המונחים מתחתיו; והשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע בזהירות חתך של שמונה מילימטר או קצר יותר דרך הצפק. הזיזו בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע.לאחר מכן, בעזרת מלקחיים טבעתיים, הרם בזהירות את שלפוחית הזרע עד שניתן יהיה לזהות את הערמונית הקדמית. כעת, עם מזרק אינסולין של 0.5 מיליליטר ומחט בגודל 30 בגודל 8 מילימטר; הזרקו נפח כולל של 30 מיקרוליטר של תמיסת וירוס לאפיתל הערמונית הקדמית. צמצם את הדליפה וודא שהנוזל נספג בתוך הרקמה ויוצר בועה קטנה.לאחר מכן, הנח את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן. כדי להבטיח שהנוזל ייספג בתוך הרקמה בבועה קטנה וללא דליפה, הקפידו להזריק במקביל לשלפוחית הזרע ולעקוב אחר צורת האונה הקדמית של הערמונית. בעזרת מחט נקודתית מתחדדת ועיגול של 13 מילימטר 3/8, תפר את הפרינאום בשניים עד שלושה תפרים קטועים פשוטים של תפר נספג 6-0.לאחר מכן, הרמת העור בעזרת מלקחיים כדי למנוע פגיעה בצפק; מהדקים את העור בשלושה קליפסים סטריליים בגודל 4.8 על 6.5 מילימטר. להחלמה טובה יותר לאחר הניתוח, השתמש במזרק סטרילי של 1 מיליליטר ובמחט בגודל 27 על 1/2 אינץ' כדי לתת את נוגדן ההרדמה במינון של 0.1 מיליליטר לגרם משקל גוף על ידי הזרקה תוך צפקית. לאחר מכן, החזירו בזהירות את החיה לכלוב שלה.שמור את הכלוב על כרית חימום למשך שעה לאחר ההליך כדי למנוע היפותרמיה עד להחלמה מלאה. החיה צריכה להתעורר מספר דקות לאחר ההזרקה. המשיכו לעקוב ולטפל בבעל החיים מדי יום בהתאם לפרוטוקול הטקסט.וכאשר הפצע נסגר, הסר את קליפס העור. כדי להעריך את העברת הנגיף לערמונית העכברים, נותחו דגימות שלושה חודשים לאחר הניתוח. כפי שמוצג כאן, העכברים ששימשו במחקר זה ביטאו GFP בתאים שנחשפו לחלבון Cree המתבטא על ידי הנגיף.אות ה-GFP מראה את פעילות קרי באפיתל הערמונית, אך לא אם עריכת גנים הושרה על ידי מדריך הקריספר. חתכים אימונוהיסטוכימיים אלה מזהים אזורי מוקד של תאים עם ביטויים גבוהים של pAKT, מה שמעיד על אובדן של P10. בפאנלים אלה, צביעה עבור pAKT ו-GFP זיהתה תאים חיוביים כפולים, שאישרו את הטרנספורמציה של תאי הערמונית על ידי הנגיף הקשור לאדנו.בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי in vivo, ניתן לבצע עריכת גנים CRISPR-Cas9 באפיתל הערמונית באמצעות עכבר Rosa26-LSL-Cas9-EGFP והנגיף הקשור לאדנו. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההליך תוך 15 דקות. טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום סרטן הערמונית לבחינת גנים מרובים עם סימולטני in vivo.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר מצע לערמונית העכבר. אל תשכח שכאשר עובדים עם וירוסים מסוימים יכולים להיות מסוכנים ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליכים אלה.

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר שיטה לעריכת גנים ספציפיים בתאי בלוטת הערמונית באמצעות מערכת העברה מבוססת אדנווירוס. הגישה מאפשרת שינוי אורתוטופי ומקומי של ביטוי גנים תוך שימוש בטכנולוגיית CRISPR לפיתוח מודלים עכבריים חדשניים לסרטן הערמונית.

מידול סרטן הערמונית במודלים של עכברים מהונדסים גנטית: טכניקת עריכת גנים מקומית בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי האונה הקדמית של הערמונית בעכבר

מערכת CRISPR / Cas9 מציעה את הפוטנציאל להפוך הגנום ממוקד עריכה נגישה ובמחיר סביר לקהילה המדעית. פרוטוקול זה נועד להדגים כיצד ליצור וירוסים אשר מפסיד יוצאים גן של עניין באמצעות מערכת CRISPR / Cas9, ואז מזריקים אותם stereotaxically לתוך מוח העכבר הבוגר.

תכנון, אריזה, משלוח של רטרו CRISPR כייל גבוה ו Lentiviruses באמצעות Stereotaxic הזרקת

עבור פרוטוקול מהיר CRISPR/Cas9-מתווכת ' שיבוש גנטי עכבר, התאים hematopoietic העיקרי של האדם מתואר במאמר זה. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins הם הציגו ויה אלקטרופורציה עם sgRNAs שנוצר דרך במבחנה שעתוק ו Cas9 מסחרי. יעילות העריכה גבוהה מושגות עם זמן מוגבל ועלות פיננסיים.

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין אינטרה-הערמונית הזרקה של תאי סרטן הערמונית, עם סירוס עוקבות. Orthotopic מודלים קליניים של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית הם קריטיים כדי לחקור את המחלה בהקשר של microenvironment של הגידול הרלוונטית קלינית, מארח immunocompetent.

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע ויוו ג'ין לב עריכה בעכברים באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-Associated (rAAV)-מתווכת משלוח של CRISPR. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נוקאאוט ספציפיות הלב בעכברים כמחנכת, ומציע אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול dystrophic קרדיומיופתיה ב ניוון שרירים דושן.

Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים

אנו מתארים שיטה למסירה של הדנ א פלסמיד לתאים urothelial של העכבר שלפוחית השתן ויוו דרך השופכה צנתור אלקטרופורציה. הוא מציע דרך נוחה ומהירה ליצירת מודלים העכבר autochthonous של מחלות שלפוחית השתן.

הרומן שיטת המסירה דנ א פלסמיד העכבר Urothelium שלפוחית השתן על ידי אלקטרופורציה

כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.

ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.

הסרת אתר התחלה תרגומי פנימי מ- mRNA תוך שמירה על הביטוי של חלבון באורך מלא

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה של עריכת גנים של גנים חוזרים פלינדרומיים קצרים (CRISPR) בתפוקה גבוהה, המקובצים באופן קבוע, עבור ניתוח רשת של אשכולות מיקרו-רנ"א, המאפשרת ייצור מהיר של פאנל של קווי תאים מהונדסים גנטית הנושאים שילובי מחיקה ייחודיים של חברי אשכול miRNA בגודל של עד 35 קילו-בתים בתוך ניסוי יחיד.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.

עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים

אנו מציגים פרוטוקול להתמרה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, המספקים חלופה יעילה לעריכת גנים בחקר התמיינות Th17.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

למד שיטת משלוח ויראלי של CRISPR/Cas9 לערמונית העכבר לעריכת גנים מהירה. טכניקה זו מאפשרת שינוי ביטוי גנים אורתוטופי ומספקת מודל חדש לחקר סרטן הערמונית.

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

גלה סרטונים נוספים