וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

המטרה הכוללת של הליך כירורגי זה היא לשנות את ביטוי הגנים בערמונית העכברית על ידי אספקה ויראלית של מדריכי CRISPR Cas9 לזירוז סרטן הערמונית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות חדשות בביולוגיה של סרטן הערמונית בנוגע לניתוח ואימות גנים חדשים בסביבה in vivo. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת עריכה מהירה של גנים מרובים על ידי התמקדות רק בתת-קבוצה של תאי הערמונית כפי שניתן לראות בתרחיש האנושי.

מישהו חדש בהליך עשוי להיאבק בהתחלה בגלל גודל האיבר, והדיוק הדרוש לסיום כירורגי מוצלח. להכנת נפח כולל טרי של 5 מיליליטר הרדמה, מערבבים 0.15 מיליליטר של מ"ג אחד למיליליטר מדטומידין הידרוכלוריד, 0.4 מיליליטר של 5 מ"ג למיליליטר מידזולם, ו-0.25 מיליליטר של 10 מ"ג למיליליטר בוטורפנול. לאחר מכן, הוסיפו 4.2 מיליליטר מים מלוחים סטריליים.

כדי להפוך את ההשפעות של מדטומידין הידרוכלוריד לאחר הניתוח, יש לערבב 0.1 מיליליטר של 5 מ"ג למיליליטר אטיפמזול עם 4.9 מיליליטר מי מלח סטריליים כתרופת הרדמה. הכינו סביבה כירורגית אספטית על ידי חיטוי ועיקור נאותים וחיטוי המכשירים הניתוחיים. להעביר וירוס לערמונית, לאחר הרדמת עכבר זכר בן שמונה שבועות לפי פרוטוקול הטקסט; לבחון את עומק ההרדמה על ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגת דוושה ורפלקסים מוחשיים.

כאשר נצפה אובדן רפלקסים, יש לגלח את הבטן התחתונה של החיה. בעזרת צמר גפן סטרילי, כסו בזהירות את עיני החיה במשחת עיניים וטרינרית כדי למנוע עיוורון הנגרם על ידי קסרופתלמיה. לאחר מכן, השתמש ב-70% אתנול ו-10% יוד פרובידון כדי לנגב את הבטן המגולחת כדי לחטא את אזור הניתוח.

לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים סטריליים, בצע חתך עור אנכי של כסנטימטר אחד בקו האמצע של הבטן התחתונה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים נקודתיים עדין, הרם את הצפק כדי למנוע פגיעה באיברים המונחים מתחתיו; והשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע בזהירות חתך של שמונה מילימטר או קצר יותר דרך הצפק. הזיזו בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע.

לאחר מכן, בעזרת מלקחיים טבעתיים, הרם בזהירות את שלפוחית הזרע עד שניתן יהיה לזהות את הערמונית הקדמית. כעת, עם מזרק אינסולין של 0.5 מיליליטר ומחט בגודל 30 בגודל 8 מילימטר; הזרקו נפח כולל של 30 מיקרוליטר של תמיסת וירוס לאפיתל הערמונית הקדמית. צמצם את הדליפה וודא שהנוזל נספג בתוך הרקמה ויוצר בועה קטנה.

לאחר מכן, הנח את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן. כדי להבטיח שהנוזל ייספג בתוך הרקמה בבועה קטנה וללא דליפה, הקפידו להזריק במקביל לשלפוחית הזרע ולעקוב אחר צורת האונה הקדמית של הערמונית. בעזרת מחט נקודתית מתחדדת ועיגול של 13 מילימטר 3/8, תפר את הפרינאום בשניים עד שלושה תפרים קטועים פשוטים של תפר נספג 6-0.

לאחר מכן, הרמת העור בעזרת מלקחיים כדי למנוע פגיעה בצפק; מהדקים את העור בשלושה קליפסים סטריליים בגודל 4.8 על 6.5 מילימטר. להחלמה טובה יותר לאחר הניתוח, השתמש במזרק סטרילי של 1 מיליליטר ובמחט בגודל 27 על 1/2 אינץ' כדי לתת את נוגדן ההרדמה במינון של 0.1 מיליליטר לגרם משקל גוף על ידי הזרקה תוך צפקית. לאחר מכן, החזירו בזהירות את החיה לכלוב שלה.

שמור את הכלוב על כרית חימום למשך שעה לאחר ההליך כדי למנוע היפותרמיה עד להחלמה מלאה. החיה צריכה להתעורר מספר דקות לאחר ההזרקה. המשיכו לעקוב ולטפל בבעל החיים מדי יום בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

וכאשר הפצע נסגר, הסר את קליפס העור. כדי להעריך את העברת הנגיף לערמונית העכברים, נותחו דגימות שלושה חודשים לאחר הניתוח. כפי שמוצג כאן, העכברים ששימשו במחקר זה ביטאו GFP בתאים שנחשפו לחלבון Cree המתבטא על ידי הנגיף.

אות ה-GFP מראה את פעילות קרי באפיתל הערמונית, אך לא אם עריכת גנים הושרה על ידי מדריך הקריספר. חתכים אימונוהיסטוכימיים אלה מזהים אזורי מוקד של תאים עם ביטויים גבוהים של pAKT, מה שמעיד על אובדן של P10. בפאנלים אלה, צביעה עבור pAKT ו-GFP זיהתה תאים חיוביים כפולים, שאישרו את הטרנספורמציה של תאי הערמונית על ידי הנגיף הקשור לאדנו.

בסך הכל, תוצאות אלה מראות כי in vivo, ניתן לבצע עריכת גנים CRISPR-Cas9 באפיתל הערמונית באמצעות עכבר Rosa26-LSL-Cas9-EGFP והנגיף הקשור לאדנו. לאחר השליטה, ניתן לבצע את ההליך תוך 15 דקות. טכניקה זו סללה את הדרך למחקר בתחום סרטן הערמונית לבחינת גנים מרובים עם סימולטני in vivo.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר מצע לערמונית העכבר. אל תשכח שכאשר עובדים עם וירוסים מסוימים יכולים להיות מסוכנים ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות בעת ביצוע הליכים אלה.