. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לדמיין אינטרנוירונים GABAergic מהונדסים גנטית במהלך נדידה משיקית בסביבה הנטורליסטית ביותר האפשרית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במדעי המוח ההתפתחותיים על ידי סינון ההשפעה של אובדן תפקוד של גנים ספציפיים של חלבונים במהלך התפתחות המוח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא זולה וקלה יחסית לביצוע בהשוואה לשיטות דומות אחרות כמו באלקטרופורציה של הרחם.

כך שטכניקה זו יכולה בסופו של דבר לשפר את האבחון עבור חולים עם הפרעות נוירו-התפתחותיות גנטיות כגון אוטיזם ואפילפסיה על ידי הבהרת הפתוגנים של מוטציות ספציפיות שזוהו בחולים כמו גם התפקידים של גנים חדשים של מחלה במהלך התפתחות המוח. התחל בהקמת ארון הבטיחות הביולוגית עם כל המכשירים הדרושים לנתיחה ותרבות. רססו בנדיבות את כל המכשירים בארון הבטיחות הביולוגית באתנול 70% ועיקרו את המכשירים ואת פנים הארון באור UV למשך 15 עד 20 דקות.

כאשר מוכנים לאסוף עוברים, יש לרסס בנדיבות את בטן הסכר המורדם באתנול 70%. משוך את עור הבטן כלפי מעלה בעזרת זוג מלקחיים מעוקרים וביד השנייה השתמש במספריים כירורגיים מעוקרים כדי לחתוך את העור מהבטן. בעזרת זוג שני של מלקחיים ומספריים מעוקרים, משוך את הפאשיה הבטנית כלפי מעלה וחתוך אותה תוך הימנעות זהירה מהרחם.

בעזרת זוג שלישי של מלקחיים ומספריים מעוקרים, החזיקו את קרני הרחם וחתכו אותן מחלל האגן. מניחים את קרני הרחם המנותחות בפטרידיש סטרילי בגודל 60 מילימטר מלא במדיום תרבית ליבוביץ על בסיס עצבי בתוספת חומצות אמינו, ויטמינים ומלחים אנאורגניים. בארון הבטיחות הביולוגית הסטרילי, השתמש בשני זוגות פינצטה עדינה כדי לנתח את העוברים מהשליה ולבודד את הראשים על ידי עריפת ראש.

Bevel חתך את קצה פיפטת העברת הפלסטיק הסטרילית של שלושה מיליליטר והשתמש בזה כדי לשאוב את הראשים ולהעביר אותם לצלחת פטרי סטרילית חדשה בגודל 60 מילימטר מלאה באותו מדיום תרבית מבוסס עצבים משלים כדי לשטוף את הדם. העבירו אותם שוב לצלחת פטרי שלישית בשכבות שעווה שחורה מוצקה וממולאת במדיום תרבית משלים על בסיס עצבי. הניחו את צלחת הפטרי בגודל 16 מילימטר בשכבות שעווה שחורה ומכילה את הראשים הכרותים במדיום תרבית משלים מבוסס עצבים מתחת למיקרוסקופ הניתוח בארון הבטיחות הביולוגית.

השתמש בפינצטה עדינה המוחזקת ביד שמאל כדי לייצב את הראש כשהחלק הרוסטרלי פונה ימינה. לאחר מכן השתמש במזרק הננו ביד ימין כדי להזריק אחד עד שניים מיקרוליטר מתמיסת הפלסמיד הצבעונית לחדר הצדדי הימני. אלקטרופורציה של המוח המוזרק על ידי הצבת הראש בין האלקטרודות כאשר האלקטרודה השלילית ממוקמת בגב ובמקביל לראש והאלקטרודה החיובית לכיוון הצד הגחוני של הראש כדי למקד את ה-MGE.

לאחר שהאלקטרודות ממוקמות היטב, ספק פולסים מרובעים של 40 וולט למשך 50 מילישניות במרווחי אינטרפולסים של 500 אלפיות השנייה. בעודכם עובדים בסביבה הסטרילית של ארון הבטיחות הביולוגית, התחילו לנתח את המוח מתוך הגולגולת. ראשית, ייצב את הראש על שכבת השעווה השחורה על ידי החדרת מחט לכל עין תוך הימנעות זהירה מהמוח.

לאחר מכן השתמש בזוג פינצטה עדינה כדי להחזיק את הצד השמאלי של הצוואר ובזוג שני של פינצטה עדינה כדי לקרוע את העור מהגולגולת מאחור לפנים. תוך כדי החזקת הראש לרוחב עם פינצטה ביד אחת, השתמש בזוג פינצטה אחר ביד השנייה כדי לחתוך בזהירות את הגולגולת בגובה גזע המוח ולמשוך את הגולגולת כלפי מעלה. עם כל פינצטה, חותכים את הגולגולת במישור הסגיטלי לכיוון הקדמי ולאחר מכן חותכים לרוחב כדי לשחרר את שברי הגולגולת.

לאחר מכן הרם את גזע המוח וחתוך בזהירות את קרומי המוח ועצבי הגולגולת עד שהמוח יוצא לחלוטין מהגולגולת. ממלאים צלחת פטרי בגודל 35 מילימטר בתמיסת אגרוז מותכת שנשמרת נוזלית בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו במהירות מוח אלקטרופואט לכלי מלא האגרוז באמצעות פיפטת ההעברה שנחתכה קודם לכן.

מערבבים את האגרוז עם מקל מתכת כדי לשמור על המוח באמצע הבאר כדי למנוע שקיעה ולמקם את המוח במישור זנב רוסטרלי במקביל למנה. הפסיקו לערבב כאשר האגרוז מתחיל להתמצק כדי למנוע נזק למוח. בזמן ההמתנה להטמעת האגרוז להתמצקות, העבירו 750 מיקרוליטר של מדיום תרבית משלים N2 בכל באר של צלחת תרבית שש בארות בהתאם למספר המוחות לעיבוד.

והניחו תוספת קרום של 30 מילימטר בכל מדיום מלא היטב. השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את האגרוז המקיף את המוח ליצירת גוש מלבני המשאיר שוליים של מילימטר עד שני מילימטרים סביב המוח. ודא שהחלק הרוסטרלי של המוח מאונך לגבול הקדמי של הבלוק כדי להקל על ההתמצאות לשלבי החיתוך הבאים.

הדביקו את גוש האגרוז על פלטפורמת הוויברטום, הקצה הרוסטרלי פונה כלפי מטה וקצה הגחון פונה למשתמש. חותכים את המוח בחתכים עטרתיים כדי לקבל חתכים בעובי 250 מיקרון בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת מרית מעוקרת, אספו שניים עד שלושה חלקים המכילים את ה-MGE והניחו את כל חלקי המוח מבעל חיים אחד על תוספת ממברנה אחת של 30 מילימטר.

תוך הימנעות זהירה מחפיפה בין חלקים. הנח את צלחת התרבות באינקובטור סטרילי מאוורר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 60% לחות וחמישה אחוזי CO2 למשך 48 או 72 שעות. לאחר זמן הדגירה הרצוי, העבירו את קטעי העניין לכיסוי שמונה חדרים מלא בשלושה עד חמישה מיקרוליטרים של מדיום תרבית.

הנח את הכיסוי בתא סביבתי, חבר אותו לדיסק מסתובב הפוך המצויד בתוכנת רכישה בעזרת מחשב כדי להגדיר את הפעלת ההדמיה בזמן-lapse. אינטרנוירונים אלקטרופוטיים ב-E 13.5 עם פלסמיד ניסיוני המבטא את קלטת העגבניות TD ו-SH RNA המכוון לגן מעניין נראים בנדידה משיקה בפרוסת מוח אורגנו-טיפוסית המתקבלת מעובר עכבר DLX5 6Cre RCEE GFP לאחר 48 שעות של תרבית. אינטרנוירונים הודגמו באמצעות הדמיה חיה בהילוך מהיר במשך שמונה שעות.

בדוגמה זו, אותו אינטרנוירון אלקטרופוטרי נראה בתהליך של נוקלאוקינזיס. תוך כדי נדידה משיקית בקליפת המוח במקביל למשטח הקליפה. הנוירון מציג בתחילה גוף תא מוארך בתהליך של נוקלאוקינזיס.

כמו גם תהליך נגרר ותהליך מוביל מסועף. לאחר שלוש שעות של הדמיה חיה, הנוקלאוקינזיס הושלם. התהליך הנגרר נסוג והתהליך המוביל הוא הרחבת שני ענפים ארוכים.

לאחר חמש שעות ו-30 דקות, אחד מענפי התהליך המובילים נסוג וגוף תא העצב נע קדימה כ-10 מיקרון. לבסוף, לאחר שמונה שעות של הדמיה, הנדידה נעצרה, הנוירון האריך שוב את תהליך ההובלה שלו והופיע תהליך נגרר. אבל הגרעין עדיין לא התקדם קדימה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על סביבה סטרילית בכל הזמנים האפשריים. אז בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אלקטרופורציות MG ואחריהם אקספלנטים כדי לענות על שאלות נוספות לתשובות כדי להבהיר את התהליכים הציטו-שלד הדינמיים המתרחשים במהלך נדידת עצבים ברמה האולטרה-תאית.