הערכה של הכללה אקסון שנגזרות אחוי Oligonucleotides Antisense מיתוג ב SMA החולה Fibroblasts
11 במאי 2018
Oligonucleotides antisense שונים (AONs) הוכחו לגרום אקסון הכללה (splice אפנון) והצלה SMN ביטוי עבור ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA). כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור און lipotransfection לזירוז אקסון להיכלל הגן SMN2 ואת שיטות ההערכה כדי לקבוע את יעילות fibroblasts חולה SMA.
המטרה הכוללת של פרוטוקול ליפוטרנספקציה זה היא להכניס אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס לתאים ולהעריך את היעילות של תרופות אלו על הכללת אקסון בתאי SMA. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול באנטיסנס. כגון, היעילות של אוליגוס אנטיסנס חדשים לספק טיפול לחולים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהירה, קלה ורגישה מספיק לבדיקת כימיקלים שונים של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו להעברה של אוליגוס אנטיסנס לפיברובלסטים, ניתן ליישם אותה גם על סוגי תאים אחרים, כגון מיובלסטים ראשוניים וקווי תאים שונים אחרים. מי שידגים את ההליך יהיה אלכס, טכנאי מהמעבדה שלי.
ראשית, יש להפשיר תמיסה של 10 מיקרו-מולרים של מערבל LNA/DNA על קרח. יש לדלל את תמיסת המיקסמר במצע נטול סרום לריכוז הנדרש בשפופרת של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, יש לדלל את מגיב הטרנספקציה ולהוסיף את מגיב הטרנספקציה המדולל למיקסמר ביחס של אחד לאחד.
זה קריטי שמפגש התאים יהיה בסביבות 65 עד 80% בזמן ביצוע הטרנספקציה. אם המפגש הוא מעל 80%, יעילות הטרנספקציה תפחת. לאחר מכן, דגרו את תערובת ריאגנט הטרנספקציה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות, פיפט 900 מיקרוליטר של מדיום נטול סרום עם סרום בקר עוברי 5% לצינורית. אל תוסיף את ה-FBS לפני הדגירה עם מגיב הטרנספקציה ומערבלי ה-LNA/DNA, מכיוון שהוא משפיע גם על יעילות הטרנספקציה. לאחר מכן, שאפו את המדיום הישן מצלחת התרבות.
כעת, הוסיפו מיליליטר אחד של המדיום המכיל את מערבל ה-LNA/DNA לצלחת התרבית. לאחר מכן, השאירו את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 48 שעות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיום מצלחת התרבות.
לאחר מכן, צנרת מיליליטר אחד של מגיב GPC לתאים. לאחר מכן, שטפו את הבארות מספר פעמים עם מגיב ה- GPC. לאחר מספר כביסות, אספו את התאים בצינור של 1.5 מיליליטר ושמרו את הדגימות על קרח.
לאחר מכן, מערבול את הצינור במהירות גבוהה למשך 30 שניות. לאחר מכן, אחסן את הצינור במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה. כעת, הפשירו את הדגימה בטמפרטורת החדר ומערבלו אותה במהירות.
לאחר מכן, הוסיפו לדגימה 200 מיקרוליטר כלורופורם ונערו אותה במרץ למשך 15 שניות. לאחר מכן, דגרו את הצינור בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. לאחר שלוש דקות, צנטריפוגה את הדגימה ב -12, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר סיום הצנטריפוגה, אסוף את השלב המימי מהחלק העליון של צינור הצנטריפוגה. ואז העבירו את השלב המימי בצינור חדש. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר איזופרופנול ומיקרוליטר אחד של שמונה מיקרוגרם למיקרוליטר של גליקוגן בדרגת RNA לשלב הימי.
מערבל במהירות את הדגימה למשך 10 שניות ודגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב -12, 000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שפכו את הסופרנטנט לאחר סיום הריצה.
הוסף מיליליטר אחד של אתנול 75% קר ומערבולת קצרה כדי לשטוף את הגלולה המתקבלת. שוב, צנטריפוגה את הדגימה ב-7500 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוציאו את כל האתנול וייבשו את הגלולה בטמפרטורת החדר.
לאחר שהגלולה התייבשה, ממיסים אותה ב-30 מיקרוליטר מים ללא DNAse/RNAse. לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, קרא את ריכוז ה-RNA ב-260 ננומטר בספקטרופוטומטר והתאם אותו ל-15 ננוגרם למיקרוליטר.
כדי להוות את תערובת המאסטר RT-PCR, הוסף את שני מאגר התגובה X RT-PCR, תערובת אנזימים RT-PCR שלב אחד, פריימרים קדימה ואחורה ומים מזוקקים ללא RNAse/DNAse. מחלקים את תערובת המאסטר לצינורות PCR של 0.2 מילימטר ומוסיפים את ה-RNA הכולל עבור כל דגימה בהתאמה. לאחר מכן התחל את תגובת ה-PCR.
לאחר השלמת ה-RT-PCR, הוסף חמישה מיקרוליטרים של שישה צבע טעינת X למוצר המוגבר. לאחר מכן, טען חמישה מיקרוליטר מהתערובת על ג'ל אגרוז של 2%. הפעל את יחידת האלקטרופורזה ב-100 וולט למשך 40 דקות.
ראשית, נחקרת היעילות של מיקסרים שונים. לשם כך, מנותחים הכללת רמות SMN2 exon 7 ו-GAPDH בפיברובלסטים SMA שהועברו עם המיקסרים. תמונת הג'ל מציגה הכללה של אקסון 7 כאשר הרצועות העליונות והתחתונות מייצגות את האקסון 7 הכלול ולא נכלל ב-SMN2 RNA.
יעילות ההכללה מכומתת גם היא ל-78 עד 98% כאשר מועברים עם המיקסמרים מאחד עד חמש. מצד שני, לא מתקבלות תוצאות משמעותיות כאשר משתמשים במיקסמר שש עד שמונה כדי להעביר את הפיברובלסטים SMA של המטופל בהשוואה לביקורת. בניסוי, GAPDH משמש כבקרה.
לאחר מכן, PCR כמותי נעשה כדי לנתח את הביטוי היחסי של SMN2 באורך מלא בהשוואה ל-GAPDH. עלייה חדה בכמות רמת התעתיק של SMN2 נצפתה כאשר מועברים עם מיקסמרים 1 עד 3 ומספר חמש, בהשוואה לביקורת. נחקרת גם רמת ביטוי חלבון SMN, מה שמראה עלייה ברמת ביטוי חלבון SMN בפיברובלסטים של המטופל שהועבר עם מיקסמרים אחד עד חמש.
נצפתה עלייה חדה של פי 1.5 עד פי 1.9 ברמת חלבון ה-SMN. כאן, השליטה המשמשת היא קופילין. נהפוך הוא, מיקסמר שש עד שמונה אינם משנים את רמת ביטוי חלבון ה-SMN.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להעביר אוליגו אנטיסנס לפיברובלסטים ולהעריך את היעילות במבחנה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליפוטרנספקציה להחדרת אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) לתאים כדי להשרות הכללה של אקסון בגן SMN2, במטרה לטפל בניוון שרירים ספינלי (SMA). יעילותה של שיטה זו מוערכת בפיברובלסטים של חולי SMA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- ניוון שרירים ספנלי (SMA) הוא הפרעה גנטית המשפיעה על נוירונים מוטוריים.
- אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs) יכולים לווסת את השחזור (splicing) ולהציל את ביטוי ה-SMN.
- שיטות הובלה יעילות עבור AONs הן קריטיות ליישומים טיפוליים.
- פרוטוקול זה מאפשר לבחון כימיות שונות של AONs.
מטרת המחקר
- להחדרה יעילה של AONs לתאי SMA.
- להערכת היעילות של AONs בהשראת הכללה של אקסון (exon inclusion).
- לספק שיטה מהירה ורגישה לבדיקת AONs.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ליפוטרנספקציה של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס לתאי פיברובלסטים.
- הערכת הכללה של אקסונים בגן SMN2.
- יישום השיטה על סוגי תאים שונים, כולל מיובלסטים ראשוניים.
- הדגמת הפרוטוקול על ידי טכנאי מעבדה.
תוצאות עיקריות
- שיטת הליפוטרנספקציה יעילה להחדרת AON.
- הושגה השראה מוצלחת של הכללת אקסון בגן SMN2.
- הפרוטוקול ניתן להתאמה לסוגי תאים שונים.
- התוצאות תומכות בפוטנציאל של AONs כטיפול ב-SMA.
מסקנות
- פרוטוקול ליפוטרנספקציה זה הוא כלי בעל ערך למחקר בתרפיה אנטי-סנסית.
- הוא מאפשר בדיקה מהירה של יעילות AON בתאי SMA.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את השיטה זו כדי לבחון AONs חדשים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה ורגישה של יעילות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AON) בהשראת הכללה של אקסון ב-SMN2 בפיברובלסטים המופקים מחולים, ובכך תומך בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובזיהוי מובילים לטיפולים המווסתים שחבור (splicing). באמצעות כימות של הכללת אקסונים ושחזור חלבון בריכוזי AON נמוכים, הפרוטוקול מספק ביטחון ניבוי לתיעדוף מועמדים בעלי סמיות משופרת ופרופילי רעילות מופחתים. יכולת ההסתגלות של השיטה לסוגי תאים וכימיות שונות מקלה על הפחתת סיכונים בשלב הפרה-קליני ועל רציפות תרגומית בקווי פיתוח תרופות ל-SMA.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזה טיפולית על ידי מדידת יעילות ההכללה של אקסון 7 ב-SMN2 כמדד תפקודי למעורבות המטרה.
- ערך תפעולי: משתמש ב-RT-PCR וב-qPCR לכימות רמות ההכללה של האקסון ורמות התמלילים, ובכך מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך תיקוף המטרה.
- ערך ניבוי: מדגים שיקום תלוי-מינון של חלבון SMN באמצעות Western blot, ובכך תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית ובמיון של מועמדי AON בפורטפוליו.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: ביסוס תהליך עבודה המבוסס על ליפוטרנספקציה התואם לבדיקות בסביבת תפוקה גבוהה של כימיות AON מגוונות, כולל LNA/DNA mixmers.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של תנאי הטרנספקציה (65–80% קונפלואנס, יחסי ריאגנטים) ונורמליזציה לבקרים GAPDH ו-cofilin, להבטחת עקביות בין ניסויים.
- יכולת הרחבה: תאימות למיובלאסטים ראשוניים ולקווי תאים אחרים, המאפשרת שימוש חוזר בפלטפורמה במודלים רלוונטיים למחלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בפיברובלסטים של חולי SMA לשמירה על נאמנות גנטית ופנוטיפית, ובכך שיפור התקפות התרגומית של נתוני סריקת AON.
- המשכיות פרה-קלינית: קישור בין הכללת אקסון לבין ביטוי חלבון SMN, המספק גשר מכניסטי בין מודולציה של מטרה מולקולרית להצלה פנוטיפית תפקודית.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר קבלת החלטות go/no-go המבוססות על יעילות הכללת אקסון (78–98%) ושינוי קיפול של החלבון (1.5–1.9), ובכך מפחית את הסיכון הביולוגי בשלבים מאוחרים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי מוביל ועד להערכה פרה-קלינית, ובכך מאפשרת הערכה איטרטיבית של יעילות ה-AON לפני מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מנגנוני החלפת שחבור (splice-switching) באמצעות כימות הכללת אקסונים ושלילת השפעות לא רצויות באמצעות נורמליזציה של GAPDH.
- סריקה: מספק מוכנות של הבדיקה ופלטים כמותיים (% הכללת אקסונים, שינוי קיפול בתמליל) להערכה מהימנה של תרכובות על פני כימיות שונות של AON.
- אנליטיקה: מייצר קריאות מדידות (כימות פסי RT-PCR, ביטוי יחסי ב-qPCR, רמות חלבון ב-Western blot) המאפשרות ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יעילות מולקולרית לשחזור חלבון בתאים המופקים מחולים, ובכך תומך בהתאמת סממנים ביולוגיים ובהמשכיות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע פרוטוקול ליפוטרנספקציה סטנדרטי שניתן להחילוו על סוגי AON ומערכות תאים מרובות, ובכך מפחית פיתוח שיטות כפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות מדידה ישירה של הכללה של אקסון ושחזור חלבון SMN.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, הדירות ורגישות לבדיקת כימיות AON שונות בריכוזים נמוכים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי קישור יעילות הכללת האקסון לביטוי החלבון, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדי AON מותאם סיכון על בסיס ספי רגישות כמותיים של יעילות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומצות גרעיניות, אופטימיזציה של טרנספקציה ואנליזה של RNA/חלבון.
- תלוי בתאימות של סוכן הטרנספקציה, בספקטרופוטומטר לכימות RNA ובמכשור לאלקטרופורזה של ג'ל/qPCR/Western blot.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הטרנספקציה (צפיפות תאים, יחסי סוכנים) ונורמליזציה של ביקורות (GAPDH, cofilin) לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
- הסבה למיובלסטים ראשוניים או לקווי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של יעילות הטרנספקציה והערכת ציטוטוקסיות.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות במספר המעברים של פיברובלסטים ממטופלים ואת הצורך בשימור שלם של ה-RNA במהלך המיצוי.
