פורסטר זמן לפתור הומוגנית תהודה אנרגיה מבוססת על העברת Assay גילוי של הפרשת האינסולין

המטרה הכוללת של הליך זה היא לגרום ולכמת במדויק את רמות האינסולין המופרש מהתאים המפרישים אינסולין. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסוכרת, כגון המנגנונים העיקריים תחת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז בתאי בטא בלבלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לכמת במדויק ובמהירות את הפרשת האינסולין בתגובה לגירוי הגלוקוז ולזהות השפעות פוטנציאליות של תרופות על ההפרשה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול וגילוי תרופות לטיפול בסוכרת מסוג 2, מכיוון שהיא תאפשר לנו להבין טוב יותר את המנגנונים של תפקוד מטבולי לקוי הנגרם על ידי תרופות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הפרשת אינסולין משורות תאי בטא אימורטליות, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון איי לבלב שלמים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו, בגלל שלבי טיפול מרובים בתאים והכנת תרופות.

הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשרצינו להמציא בדיקה מהירה כדי לחקור את הפעולות של תרופות דופמינרגיות על הפרשת אינסולין. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הטיפול בתאים בגלל האופי העדין של התאים וחשיבות הדיוק כדי להבטיח עקביות של הבדיקה בין הניסויים. ראשית, גדל את תאי INS-1E כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר שהתאים מגיעים למפגש הרצוי, שאפו את המדיום. שוטפים את התאים בחמישה מיליליטר מי מלח עם פוספט. לאחר מכן, הוסיפו לתאים 0.5 מיליליטר של 025% טריפסין ואז השאירו את התאים באינקובטור למשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

השבת את הטריפסין על ידי הוספת תשעה מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן, העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. ואז צנטריפוגה את התאים ליצירת כדור.

לאחר הצנטריפוגה, ממיסים את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום טרי. הוציא 10 מיקרוליטר מהתאים התלויים מחדש מהצינור וערבב עם 10 מיקרוליטר של צבע חיוני כחול טריפן כדי להעריך את הכדאיות. לאחר מכן, השתמשו בהמוציטומטר כדי לספור את מספר התאים החיים והמתים ולוודא ש-90% מהתאים חיים.

לאחר הספירה, הוסף מיליון תאים למיליליטר במדיום RPMI 1640 טרי, ואז זרע 0.5 מיליליטר של 500,000 תאי INS-1E בכל באר של צלחת מצופה פולי-ליזין עם 24 בארות. השאירו את הצלחת בחממה למשך יום שלם. למחרת, הסר את המדיה והוסף 500 מיקרוליטר מדיום RPMI 1640 טרי בכל אחת מהבארות.

דגרו את הצלחת למשך 24 שעות נוספות כדי שהתאים יתפשטו על משטחי הבאר. כדי לבצע את הבדיקה, הכינו תחילה את מאגר ה-KRB, לאחר מכן שאפו את המדיום מכל אחת מהבארות ושטפו עם מי מלח פוספט מחוממים מראש, פעמיים. לאחר מכן, הוסף 450 מיקרוליטר של מאגר KRB, בתוספת אלבומין סרום בקר, אך ללא גלוקוז, בכל באר.

השאירו את צלחת התרבות על 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך שעה. הכן דילולים סדרתיים של התרופות במאגר KRB, בתוספת ריכוז סופי פי 10 של גלוקוז 200 מילימולרי. לאחר שלב הרעבת הגלוקוז, פיפטה 50 מיקרוליטר של תרופות מדוללות סדרתיות בכל אחת מהבארות המתאימות.

לגירוי גלוקוז, הוסף את התרופות המדוללות סדרתיות בהתאמה בנוכחות גלוקוז של 20 מילימולארי. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר סיום הגירוי, אספו את הסופרנטנטים והעבירו אותם לצינורות צנטריפוגה מסומנים של 1.5 מיליליטר.

העבירו 10 מיקרוליטר מכל סופרנטנט שנאסף לצלחת של 96 בארות. הוסף 90 מיקרוליטר KRB לכל באר כדי להשיג יחס דילול של 1 עד 10. מערבבים את הדילולים כדי להבטיח הומוגניות.

לאחר מכן, השג את עקומת תקן האינסולין עבור בדיקת האינסולין HTRF. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר כל אחת מדגימות האינסולין הסטנדרטיות ואת חומרי הבדיקה המדוללים לצלחת של 96 בארות. הכן את תערובת הנוגדנים בתורם אחד עד שניים כדי לקבל יחס במאגר הזיהוי.

לאחר הכנת תערובת הנוגדנים, הוסיפו 30 מיקרוליטר ממנה לכל אחת מהבארות בצלחת של 96 בארות. אוטמים את הצלחת ודוגרים בטמפרטורת החדר. לאחר שעתיים של דגירה, קרא את הצלחת עם תערובת הנוגדנים על קורא הצלחת.

השתמש במודול האופטי המתאים של HTRF ב-665 ו-620 ננומטר לקריאה והשתמש ב-200 הבזקים לכל באר. ראשית, עקומה סטנדרטית של אינסולין משורטטת כדי להוציא את הערכים האמיתיים של אינסולין מדגימות הבדיקה. העקומה הסטנדרטית מראה כי קריאת הקרינה היחסית המתקבלת עולה משמעותית כפונקציה של ריכוזי האינסולין האנושיים הסטנדרטיים שהוגדרו מראש.

לאחר מכן, הרמה הבסיסית של הפרשת אינסולין מתאי INS-1E נחקרת בנוכחות או היעדר גלוקוז של 20 מילימולארי. מהתרשים עולה כי התאים מפרישים כ-100 ננוגרם למיליליטר אינסולין בנוכחות גלוקוז. מעניין שרמת האינסולין היא כמעט מחצית בכ-15 ננוגרם למיליליטר בהיעדר גלוקוז.

לאחר מכן, התאים מודגרים בנוכחות ריכוזים הולכים וגדלים של דופמין עם גלוקוז של 20 מילימולארי. האינסולין המופרש מנורמל לערך הממוצע של אחוז האינסולין המקסימלי מכל באר. העלילה מראה כי דופמין מעכב GSIS, ובכך מצביע על החשיבות התפקודית של קולטנים דופמינרגיים ב-GSIS.

תרשים זה מראה כי ברומוקריפטין, תרופה לסוכרת מסוג 2, חזק יותר בגרימת GSIS מאשר דופמין. תרשים זה מראה שעם עלייה בריכוז של קווינפירול, אגוניסט D2, למרות שהוא פחות יעיל מברומוקריפטין, מראה עוצמה דומה כמו דופמין בגירוי GSIS. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע עד חמש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לפיפט בזהירות ובעקביות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות אחרות כמו בדיקת AMP HDRF מחזורית על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו השפעות תרופות דופמינרגיות על איתות במורד הזרם. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום חילוף החומרים לחקור מסלולי הפרשה אנדוקריניים אחרים הן בשורות תאים אימורטליים והן באיי הלבלב.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד במדויק הפרשת אינסולין מתאים באמצעות HDRF.