Name: בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: למד בידוד אימונומגנטי של אוליגודנדרוציטים ראשוניים מעכברים ניאונטליים לחקר מיאלינציה ומחלות דמיאלינציה. שיטה זו מספקת טוהר תאים גבוה מ-80% תוך שעה אחת בלבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן האגודה לטרשת נפוצה הלאומית (RG4591A1/2) של מכון הבריאות הלאומי (R03NS06740402). המחברים מודים ד ר איוון הרננדז ואנשי המעבדה שלו על מתן שטח, ציוד וייעוץ.

העכברים השתמשו במחקר זה היו מטופלים בהתאם לקווים המנחים של המספר פרוטוקול SUNY Downstate רפואי מרכז חלוקה של מעבדה חיה משאבים (DLAR) 15-10492.
הערה: oligodendrocytes להפוך הראשי הם בודדו אותנו מהמתרחש neonatal (P5-P7 פראי-סוג C57Bl/6N) עכברים. בשלב זה, לא בשלה OLs מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים הבטחת תשואה גבוהה הסלולר. כל מאגר של יצירות ריאגנט זמינים בסוף הטבלה של חומרים.
1. Coverslips הכנה
הערה: פוליפוני-D-ליזין (PDL) / coverslips laminin מצופה להיות מוכנים לפני OL בידוד.
<ol><li>המקום #1 גרמנית זכוכית coverslips לתוך צינור חרוטי 50-mL ולהוסיף 35 מ ל 70% EtOH כדי לנקות אותם.</li>
	<li>סגור את הצינור, למקם אותו במיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך בעדינות נדנדה. יכול להיות מודגרות Coverslips בן לילה.</li>
	<li>למחוק את EtOH 70%.</li>
	<li>לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, להסיר את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.</li>
	<li>להוסיף 30-35 מ ל PDL 50 µg/mL coverslips בצינור 50-mL, מספיק כדי לכסות על coverslips.</li>
	<li>מקם את הצינור 50-mL המכיל את coverslips על מיקסר nutating, דגירה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 30 דקות תוך נדנדה בעדינות.</li>
	<li>לשטוף את coverslips 3 פעמים עם מים יונים, הסרת את המים בכל פעם עם השאיפה ואקום.</li>
	<li>להעביר את coverslips 60 מ מ פטרי המכילות מים יונים.</li>
	<li>השתמש טיפ פיפטה P200 כדי לארגן את coverslips כשכבה מכסה את כל פני השטח של הפטרי.</li>
	<li>. בזהירות, הסר את המים הכלים עם שאיפה ואקום.</li>
	<li>להסיר את המים סביב coverslips ולתת להן להתייבש למשך הלילה עם מכסה פתוח, תחת אולטרא סגול בשכונה. הערה: PDL מצופה coverslips זכוכית דקה ניתן לאחסן ב 4 ° C בפטרי סטריליות עד שלושה חודשים.</li>
	<li>מקם את coverslips לוחות 24-. ובכן, אחד לכל טוב, באמצעות מלקחיים בסדר.</li>
	<li>להעביר את coverslips מרכז טוב מוודא שהקצוות אל תיגע בקיר של הבאר.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של 10 µg/mL laminin מעורבבת עם B27NBMA (ראה טבלה של חומרים) מתחיל במרכז של כל coverslip והעברתו בצורה מעגלית, לכיוון הקצוות כדי לכסות את כל האזור. הערה: כיוון laminin מעורב OL תחזוקה ומקדם בידול לתוך OLs בוגרת, היא גורם חשוב של הישרדות OL in vitro לקשרי תרבות41,42,43,44.</li>
	<li>דגירה על צלחת 37 ° C החממה ב- 5% CO2 לפחות שעה או עד OLs מוכנים ציפוי.</li>
</ol>2. העכבר דיסוציאציה קליפת המוח
<ol><li>להקריב כמחנכת 5-7-יום הישן C57Bl/6N העכבר הגורים ע י עריפת ראשו מהירה עם מספריים בעבר נוקה ב-70% אתנול. הערה: מוחי cortices מ- 5-6 עכברים neonatal הגורים שימשו כל הכנה. בממוצע, מוח העכבר אחת מניבה 1-1.5 x 106 OLs.</li>
	<li>לחתוך את העור בקרקפת לאורך הקו האמצעי עם מספריים קטנות ויבתר ומשכו לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>לחתוך את הגולגולת בקפידה לאורך הקו האמצעי החל מפתיחת מאחורי הגולגולת לכיוון האזור חזיתית, מרימים עם המספריים כדי למנוע נזק למוח. לאחר מכן, באמצעות פתיחת מאחורי הגולגולת לחתוך לכיוון כל ארובת העין לאורך הבסיס של הגולגולת.</li>
	<li>השתמש בסדר מלקחיים בעדינות להקניט את cortices מן המוח האמצעי ולהעביר אותם לצלחת תרבות רקמות 60 מ מ המכיל 7 מ של B27NBMA. חזור על הצעדים 2.2 דרך 2.4 כל המוח, צירוף של cortices גזור.</li>
	<li>להעביר את cortices תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ חדש המכיל 5 מיליליטר דיסוציאציה מאגר (B27NBMA, פפאין U/mL 20-30 ו- 2,500 U DNase אני).</li>
	<li>חותכים לקוביות את cortices לחתיכות קטנות של 1 מ מ3 באמצעות סכין #15 אזמל, תקופת דגירה של 20 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל בסרום הצמיחה שור (מביע רק) כדי לעצור את התגובה אנזימטיות.</li>
	<li>להעביר את cortices יחד עם כלי התקשורת דיסוציאציה צינור חרוטי 15-mL באמצעות pipet סרולוגית 10 מ.</li>
	<li>בעדינות נתחיל לנתק את רקמת המוח על-ידי pipetting לאט לאט למעלה, למטה 6 - 8 פעמים באמצעות pipet סרולוגית 10-mL, באמצעות טיפול למזער את בועות.</li>
	<li>לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות ולהעביר את תגובת שיקוע ל צינור טריים.</li>
	<li>להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/2500 U DNase I הרקמה גלולה.</li>
	<li>השתמש פיפטה סרולוגית 5 מ ל לנתק בעדינות על רקמת המוח בזמן pipetting למעלה ולמטה 6 - 8 פעמים. להיות זהירים כדי למזער את בועות.</li>
	<li>לאפשר את חתיכות רקמה להתפשר על 2-3 דקות.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase I הרקמה גלולה.</li>
	<li>בעדינות מביצועם על רקמת המוח באמצעות טיפ pipet P1000, תוך pipetting את המיקס של מדיה, במוח רקמות למעלה ולמטה. חזור על השלבים 2.13 ו 2.14 עד אין נתחים גדולים של רקמות להישאר או עד B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase מוטשת, מה שיבוא קודם. להיות זהירים כדי למזער את בועות.</li>
	<li>ההשעיה תא בריכה עם supernatants הקודם.</li>
	<li>מניחים מסננת תא 70-מיקרומטר בשפופרת 50-mL. שימוש pipet סרולוגית 10-mL, להעביר את התליה תא במאגר בעדינות מסננת תא 70-מיקרומטר.</li>
	<li>לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.</li>
	<li>למחוק את מסננת התא. להביא את אמצעי האחסון 30-mL עם B27NBMA המכיל 10% מביע רק/DNase אני.</li>
	<li>העברה התליה תא שני צינורות חרוט 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. תגובת שיקוע יהיה מעונן בגלל שאריות תאים. להוסיף 3 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% מביע רק כדי בגדר.</li>
	<li>בזהירות מביצועם בגדר התא באמצעות pipet של P1000. להביא את אמצעי האחסון 15 מ"ל עם B27NBMA המכיל 10% BGS.</li>
	<li>לעבור התליה תא מעל מסננת תא מיקרומטר 40 טריים.</li>
	<li>לשטוף את מסננת תא על-ידי הוספת 1 מ"ל של B27NBMA המכיל 10% BGS. למחוק את מסננת התא.</li>
	<li>להביא את אמצעי האחסון 30 מ עם B27NBMA המכיל 10% BGS.</li>
	<li>העברה התליה תא צינורות חרוט 2 x 15-mL. Centrifuge התליה תא 10 דקות ב- 200 x g.</li>
	<li>להסיר את מרבית תגובת שיקוע מבלי להשאיר את התאים ייחשף לאוויר. Resuspend תא כדורי ב 5 מ של תא מגנטי קר קרח, מיון מאגר (MCS).</li>
</ol>3. קביעת ספירת התאים ואת הכדאיות
<ol><li>לדלל µL 100 של התליה תא עם 400 µL של פתרון Trypan Blue צינור 1.5-mL microcentrifuge כדי להשיג לדילול 1:5 ב- 0.4% (w/v).</li>
	<li>מרכז זכוכית מכסה מעל hemocytometer קאמרית, מילוי התאים שני עם µL 10 של דילול תאים באמצעות פיפטה P10 והימנעות תמלא יותר מדי. הפתרון יעברו תחת הזכוכית המכסה על ידי נימיות.</li>
	<li>מניחים את hemocytometer על הבמה מיקרוסקופ והתאימו את המוקד באמצעות הגדלה X 40. הערה: תא ספירת נרשמים באמצעות מונה ידניים בכל חמש משבצות (ארבע הפינות, מרכז אחד). רק כלכלית תאים סופגים את צבען ומופיעים כחול, בעוד בשידור חי, תאים בריאים מופיעים עגול, השבירה, אינם סופגים לצבוע בצבע כחול, המאפשר קביעת מספר התאים הכולל ובר קיימא למיליליטר.</li>
</ol>4. בידוד של O4+ oligodendrocytes להפוך
<ol><li>Centrifuge התליה תא ב 200 g x 10 דקות.</li>
	<li>בזהירות למחוק את תגובת שיקוע באמצעות שאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 90 µL מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 הכולל תאים ואחריו התוספת של 10 µL של אנטי-O4 חרוזים לכל עונה 1 פרק 107 תאים.</li>
	<li>מערבבים את התא ההשעיה, חרוזים על ידי מצליף בעדינות את הצינור 15-mL חרוט עם האצבע 4 - 5 פעמים.</li>
	<li>דגירה לערבב למשך 15 דקות ב 4 ° C, מצליף הצינור חרוט 15-mL עם האצבע timesevery 4-5 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את התערובת על-ידי הוספת בעדינות 2 מ של מאגר תקליטנים לכל עונה 1 פרק 107 תאים הצינור. Centrifuge את המיקס ב 200 g x 10 דקות.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע באמצעות בקפידה השאיפה ואקום, הימנעות מחשיפה של תאי האוויר. Resuspend בגדר תא ב- 500 µL MCS מאגר עבור כל התאים7 עונה 1 פרק 10.</li>
	<li>לצרף מפריד מגנטי עמדה הפרדה מגנטית. לצרף עמודת בחירה במפריד מגנטי ומניחים על מסננת תא 40 µm יוליאנוס. מקום שני 15-mL או שפופרת אחת של חרוט 50-mL מתחת לעמודת ההפרדה כדי לאסוף את הזרימה.</li>
	<li>מראש יש לשטוף את 40-מיקרומטר תא מסננת והפרדה העמודה עם 3 מ"ל של מאגר תקליטנים ותנו המאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.</li>
	<li>הוסף את התמהיל של הבולם תא וחרוזים מסננת את התא, לתוך עמודת בחירה.</li>
	<li>לשטוף את מסננת תא 40 מיקרומטר עם 1 מ"ל של מאגר תקליטנים.</li>
	<li>למחוק את מסננת תא ולתת את התמהיל של תאים, חרוזים, מאגר לרוץ דרך העמודה מבלי לתת לו להתייבש.</li>
	<li>לשטוף את העמודה ההפרדה 3 פעמים עם 3 מ"ל של MCS מאגר זמן 1 עם OL תפוצת המדיה.</li>
	<li>הסר את העמודה ההפרדה המפריד מגנטי, במהירות למקם אותו לתוך צינור חרוטי 15-mL ולהוסיף מיד 5 מיליליטר OL תפוצת המדיה.</li>
	<li>במקום פומפה על גבי העמודה ולדחוף בחוזקה כדי לשטוף את התאים שכותרתו לתוך הצינור חרוט 15-mL.</li>
	<li>הסר µL 100 של השעיה תא לקבוע ספירת התאים ואת הכדאיות באמצעות Trypan Blue ו- hemocytometer כמצוין בסעיף 3. הערה: תא הכדאיות מעל 80% נחשב מקובל להמשיך עם התרבות של OLs, אך הכדאיות גדול מ- 90% היא אופטימלית.</li>
</ol>5. ציפוי של O4 מבודד+ oligodendrocytes להפוך
<ol><li>לדלל התליה תא התשוקה יופיצ צפיפות (5 x 105 תאים לכל coverslip) באמצעות מדיה התפשטות OL. הערה: OL זריעה צפיפות הוא מאוד חשוב, אז צפיפות תאים מתאים יש לאשר באמצעות מיקרוסקופ תרביות רקמה לפני שתמשיך. זריעה צפיפות מתחת 10,000 תאים/coverslips עלול להוביל הישרדות cell המסכן. -ציפוי צפיפות-OL 10,000 כדי 25,000, בידול מורפולוגי הוא איטי45. אנחנו צלחת OLs-צפיפות זריעה לפחות 50,000 תאים coverslips כדי להבטיח הישרדות cell.</li>
	<li>הזז את הצלחות 24-ובכן המכיל coverslips מצופה laminin של חממה מכסה המנוע תרביות רקמה.</li>
	<li>הסר laminin של כל coverslip ולהחליף אותו עם µL 100 של השעיה OL.</li>
	<li>דגירה OLs בחממה 37 °C/5% CO2 לתקופה מקסימלית של 45 דקות על מנת לקדם OL הדבקה על coverslips.</li>
	<li>לאחר דגירה, הסר את הצלחות 24-ובכן החממה. להציף את כל טוב של צלחת 24-ובכן עם 500 µL OL תפוצת המדיה.</li>
	<li>מקם את OLs בחזרה בחממה 37 °C/5% CO2 עבור 24 שעות נוספות.</li>
	<li>24 שעות לאחר ציפוי של OLs, להסיר את תפוצת המדיה, תחליף עם OL מדיה בידול כדי ליצור בידול.</li>
	<li>למקם את OLs בחזרה בחממה, אל תסיר עד התאים מוכן עבור קיבעון. הערה: שינויים ב- pH פוגמים עבור OLs ו להקטין את הכדאיות התא, ולכן יש להימנע מיותר הסרה של תרבויות OLs מתוך החממה.</li>
</ol>6. immunofluorescence מכתים
<ol><li>איתור תא סמני פני השטח (NG2, O1 ו- O4) להסיר לתקשורת מן הבארות.</li>
	<li>להוסיף 250 µL של העכבר ליפידים supernatants המכיל נוגדנים ראשי O1 (מדולל)13 ו- O4 (מדולל)13 , ארנב polyclonal נגד NG2 (1:150 מעורבבת עם B27NBMA). הערה: אם נוגדנים anti-O1 ו- anti-O4 זמינים מסחרית כדי לשמש, מומלץ לנצל את דילולים שהוצעה על ידי היצרן.</li>
	<li>דגירה התאים עם נוגדן ראשוני למשך 45 דקות מקסימום בחממה2 37 °C/5% CO.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 0.05% Tween-20/1 X PBS. לתקן את התאים paraformaldehyde 4% (4% PFA) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>לדלל עז מצומדת אלקסה 488 אנטי עכבר IgM או ארנב אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.</li>
	<li>הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>זוגי מכתים איתור סמנים פנימית (GFAP), להסיר 0.05% Tween-20/1 X PBS התאים ו- permeabilize/בלוק עם בלוק/permeabilization מאגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. אחרת המשך לשלב 6.17.</li>
	<li>להסיר לחסום/permeabilization מאגר ולהוסיף 250 µL עוף אנטי-GFAP (1: 100) מדולל במאגר בלוק/permeabilization.</li>
	<li>דגירה התאים עם אנטי-GFAP לשעה בטמפרטורת החדר. רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>לדלל עז מצומדת אלקסה 594 עוף אנטי איג משני נוגדנים (1:400) ב- B27NBMA.</li>
	<li>הסר 0.05% ל- PBS Tween-20/1 X coverslips. דגירה התאים עם נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>רחץ שלוש פעמים במשך חמש דקות כל עם 0.05% Tween-20/1 X PBS.</li>
	<li>Counterstain עם 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) והר התאים עם antifade הרכבה המדיה המכילה דאפי.</li>
	<li>תן coverslips לרפא בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תמונה התאים ויטראז'ים עם מיקרוסקופ epifluorescence. הערה: ב פרוטוקול זה, התאים היו עם תמונה בהגדלה X 40 באמצעות זמן חשיפה אחידה.</li>
</ol>

המחברים יש אין גילויים.

תקשורת זו, אנו מציגים שיטת הבידוד יעיל של תרבויות אוליגודנדרוציטים עכבר לא בוגר נקיים במיוחד. לעומת פרוטוקולים שפורסמו בעבר39,40, שיטה זו הניבה טוהר גבוהה יותר עם רמה נמוכה יותר של GFAP-חיוביות האסטרוציטים ואחוז נמוך מאוד של תאים אחרים שאינם מאופיין. חשוב לציין שאלו הן ילדותי OLs ביצע כבר לשושלת oligodendroglial. לפיכך, תאים אלה לא יהיה שימושי עבור חקר השלבים המוקדמים של בידול.
אחד השינויים מכל פרוטוקול Dincman40</sup...

Oligodendrocytes להפוך (OLs) הם תאים myelinating של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. הבידוד והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך בסביבה בחוזקה מוסדר הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה2 . פעולה זו דורשת יעיל וחזק אוליגודנדרוציטים בידוד ותרבות שיטה3. במחקר זה, ניצלנו הביטוי של סמן משטח תא אוליגודנדרוציטים ייחודי ליישם טכניקה בידוד ששונה הוא מהיר ולא ספציפי.
ארבעה שלבים של התבגרות אוליגודנדרוציטים זוהו, כל אחד מאופיין על-ידי הביטוי של סמני פני שטח התא ייחודי עבור כל שלב התפתחותי (איור 1). סמנים אלה פני שטח התא ניתן לזהות על ידי נוגדנים ספציפיים4,5, והוא יכול לשמש כדי לבודד OLs בשלבים מסוימים. בשלב הראשון, אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) יש את היכולת להתרבות, להעביר, במיוחד לבטא פקטורי גדילה נגזר טסית קולטן (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, פרוטאוגליקן NG27,8 , polysialic חומצה-עצבי תא אדהזיה מולקולה9 ושומן-חומצה-מחייב חלבון 7 (FABP7)10. OPCs יש מורפולוגיה דו קוטבי עם כמה תהליכים קצר שמקורם הפולנים מנוגדות בגוף התא, אשר מאפיינת של תאים עצביים קודמן11.
<img alt="דיאגרמת התבגרות אוליגודנדרוציטים; שלבים עם סמנים: OPC, Preoligodendrocyte, לא בוגר, בוגר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="דיאגרמת התבגרות אוליגודנדרוציטים; שלבים עם סמנים: OPC, Preoligodendrocyte, לא בוגר, בוגר."> איור 1: ביטוי של סמני פני שטח התא במהלך ההתפתחות אוליגודנדרוציטים העכבר. OLs תא סמני פני שטח כגון A2B5, GalC (נתיבים1), NG2, O4 ו PDGF-Rα ניתן לבודד oligodendrocytes להפוך בשלב התפתחותי מסוים ספציפי באמצעות נוגדנים ייחודיים.   <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
בשלב השני, OPCs להצמיח preoligodendrocytes ולבטא את קרום התא לא רק סמנים OPC, אלא גם את sulfatide (sulfated galactolipid) מזוהה על-ידי O4 נוגדן12,13, את החלבון GPR1714, להתקיים עד השלב אוליגודנדרוציטים ילדותי (OL). בשלב זה, preoligodendrocytes להרחיב תהליכים קצר multipolar. Preoligodendrocytes הם השלב OL הגדולות ביום כמחנכת 2 (P2) בחומר הלבן במוח של עכבר ועכבר עם אוכלוסיה קטנה של OLs לא בוגר15.
בשלב השלישי, OLs ילדותי להמשיך אקספרס O4, לאבד את הביטוי של סמנים A2B5 ו- NG2, להביע את galactocerebroside C16. בשלב זה, מחויבים השושלת oligodendroglial וחקירות להפוך לתאי mitotic פוסט עם סניפים זמן כחוד17,18. לא בוגר OL מהווים יותר מ- 80% של החומר הלבן מכרסמים-P7, בשלב זה התאים MBP+ הראשון הם נצפו15,19,20,21. לכן, בידוד של OLs-P7 יכול להבטיח תשואה גבוהה הסלולר.
בשלב הסופי והרביעית של פיתוח OL, בוגר OLs חלבונים myelinating אקספרס (חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), המיאלין הקשורים גליקופרוטאין (מג) ו המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א)22,23 ,24,25,26. בשלב זה, בוגרת להרחיב ממברנות הזה קומפקטי טופס enwrapping מעילי פרווה סביב האקסונים וחקירות מסוגלים שעוטף. זה עולה בקנה אחד עם התצפית כי במוח החולדה, העכבר, תאים MBP+ הופכים יותר ויותר שופע P1419,20,21.
מאז הבידוד הראשון של אוליגודנדרוציטים על ידי Fewster ועמיתיו בשנת 196727, יושמו מספר שיטות עבור בידוד של OLs מ למכרסמים CNS כולל28,immunopanning29,30, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניצול תא השטח הספציפי אנטיגנים28,31, צנטריפוגה הדרגתיות דיפרנציאלית32,33,34,35 שיטה חזק המבוסס על הדבקות דיפרנציאלית של CNS שונה עכשיו, דונלד36,37. עם זאת, קיימות שיטות יש מגבלות, במיוחד במונחים של טוהר, תשואה, הזמן הנדרש כדי לבצע את ההליכים38. לכן, שיטות בידוד יעיל יותר oligodendrocytes להפוך נדרשים.
בנייר זה, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו על-ידי אמרי. et al. 39 ו. Dincman et al. 40 ומספק של טוהר הכנה אוליגודנדרוציטים מעל 80% בכ-4 שעות.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל פיפטים סרולוגיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל Luer-Loc tip</td><td>BD, Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית רקמות 24 בארות</td><td>Falcon</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; מסננת תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטים סרולוגיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ צלחות תרבית רקמות</td><td>פלקון</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאים M</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgM (H+L) נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב IgM (H+L) נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 עיזים נגד עוף IgG (H+L) נוגדן משני</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>Anti-O4 חרוזים- Anti-O4MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrin Human</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Autofil מכלול מסנן בקבוק עליון שלם, מסנן 0.22um, 250 מ"ל</td><td>USA Scientific</td><td>6032-1101</td><td></td></tr><tr><td>Autofil מסנן בקבוק שלם הרכבה, מסנן 0.22um, 250 מ"ל</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>Sigma</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>סרום צמיחת בקר (BGS)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-ביוטין</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Desoxyribonuclease I (DNAse I)</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי עם מצלמת Olympus DP70</td><td>Olympus</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>אזמל חד פעמי נוצה</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית גרמניים, עובי #1, קוטר 12 מ"מ עגול</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP נוגדן</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר מדעי</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מפריד מגנטי - MACS multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מפריד מגנטי-מפריד MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22& יחידת מסנן m</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה- להאריך זהב עם DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-ציסטאין (NAC)</td> <td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>למינין עכבר טבעי</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td> <td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2 נוגדן</td><td>Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>PBS ללא Ca2+ ו-Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>סיגמא</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון</td><td>סיגמא</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>פוטרסין</td><td>סיגמא</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>עמודת בחירה-עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>סיגמא</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>יסודות קורט B</td><td>קורנינג</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>Triiodothyronine (T3)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 מ"ל נוירובזאלי בינוני A; תוסף B27 של 10 מ"ל; 1 מ"ל פרימוצין; 1.25 מ"ל גלוטמקס; מסננים, מעקרים ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C עד השימוש.</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 מ"ל B27NBMA; 3 מ"ל סרום צמיחת בקר</td></tr><tr><td>מלאי תמיסת CNTF (10 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>הזמנה מפפרוטק (450-50). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשוי להשתנות מאצווה לאצווה) במאגר (למשל DPBS + 0.2% BSA). אחסן בטמפרטורה של -80 & מעלות צלזיוס פתרון עבודה (10 ומיקרו; גרם/מ"ל, 1000X) 1. יש לבצע 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) בתמיסת DPBS ולעקר מסנן. 2. לדלל מלאי ראשי aliquot ל-10&micro; גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS. 3. אליקוט (20&מיקרו; l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי. 4. אחסן את הכמויות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי d-ביוטין (50 ומיקרו; גרם/מ"ל; 5000X)</td><td></td><td></td><td>השעיית d-ביוטין (Sigma-B4639) ב-H2O מזוקק כפול ב-50 מיקרו; גרם/מ"ל (למשל 2.5 מ"ג ב-50 מ"ל של ddH2O). השעיה מחדש עשויה לדרוש כמות נכבדה של תסיסה/מערבולת, או התחממות קלה לזמן קצר ב-37 מעלות צלזיוס. אם ה-d-ביוטין עדיין לא מסיס, זה בסדר להרכיב פחות מרוכז (למשל 10&micro; גרם/מ"ל), וכדי להוסיף נפח גבוה יותר ל-B27NBMA (1/1000), במקום 1/5000). יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr>פתרון <td></td><td></td><td>מלאי DNase I</td><td>1. ממיסים ב 12,500 U Deoxyribonuclease I / ml ב- HBSS צונן על קרח. 2. מסננים לעקר על קרח 3. Aliquot ב-200 ומיקרו; l ולהקפיא למשך הלילה ב -20 מעלות צלזיוס 4. אחסן את המינון בטמפרטורה של -20 עד -30 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>דולבקו s תמיסת מלח חוצצת פוספט (ללא Ca2+ ו-Mg2+)</td><td></td><td></td> <td>ממיסים את השקית בליטר מים כדי להניב 1 ליטר מדיום ב-9.6 גרם אבקה לליטר מדיום. יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי פורסקולין (4.2 מ"ג/מ"ל; 1000X)</td><td></td><td></td><td>הוסף 1 מ"ל של DMSO סטרילי ל-50 מ"ג פורסקולין בבקבוק (Sigma-F6886) ופיפטה עד להשעיה מחדש. מעבירים לשפופרת צנטריפוגה של 15 מ"ל ומוסיפים 11 מ"ל של DMSO סטרילי כדי להביא ל-4.2 מ"ג/מ"ל. Aliquot (למשל 20 &micro; l) ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>האנק' מלחים מאוזנים (HBSS) (סיגמא</td><td></td><td></td><td>1. למדוד 900 מ"ל מים (טמפרטורה 15-20 ודג; ג) בגליל ומערבבים בעדינות. 2. מוסיפים את העוצמה ומערבבים עד להמסה. 3. יש לשטוף את האריזה המקורית בכמות קטנה של מים כדי להסיר את כל שאריות האבקה. 4. הוסף לפתרון בשלב 2. 5. הוסף 0.35 גרם נתרן ביקרבונט (7.5% משקל/נפח) עבור כל ליטר של נפח סופי. 6. ממשיכים לערבב עד להמסה. 7. התאם את ה-pH של המאגר תוך כדי ערבוב ל-0.1-0.3 יחידות מתחת ל-pH= 7.4 מכיוון שהוא עלול לעלות במהלך הסינון. מומלץ להשתמש ב-1N HCl או 1N NaOH כדי להתאים את ה-pH. 8. הוסף מים נוספים כדי להביא את הנפח הסופי ל-1L. 9. יש לעקר על ידי סינון באמצעות ממברנה בעלת נקבוביות של 0.22 מיקרון. 10. יש לאחסן בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת מלאי אינסולין (4000 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td></td><td></td> <td>להפשיר את הבקבוק ולקבל 25 & מיקרו; l לכל צינור מיקרו-צנטריפוגה ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> למינין <td>הפשרה איטית של למינין בקור (2& מעלות; C עד 8&deg; ג) כדי למנוע היווצרות ג'ל. לאחר מכן, מכניסים לצינורות פוליפרופילן. יש לאחסן ב-5&00 מעלות; C עד -20&deg; C במכסים (למשל 20 ומיקרו; l) ואין להקפיא/להפשיר שוב ושוב. ניתן לאחסן למינין בטמפרטורות אלה עד שישה חודשים.</td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td>מיון תאים מגנטי (MCS)</td><td>הכן את התמיסה המכילה תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), pH 7.2 ו-0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA), 0.5 מ"מ EDTA, 5& גרם/מ"ל אינסולין, 1 גרם/ליטר גלוקוז. עיקור והסרת גז על ידי סינון המאגר על ידי העברתו דרך 0.22 ומיקרו; מ פילטר מילקס. אחסן את המאגר ב-4&deg; C עד לשימוש</td></tr><tr><td>בתמיסת מלאי N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC) (5 מ"ג/מ"ל; 1000X)</td><td></td><td></td><td>יש להמיס N-אצטיל-L-ציסטאין (Sigma-A8199) במינון של 5 מ"ג/מ"ל ב-DMEM (למשל 50 מ"ג NAC ב-10 מ"ל B27NBMA). לסנן לעקר ולעקר (למשל 20 ומיקרו; l). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פתרון מלאי NT3 (1 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>מלאי ראשי: הזמנה מפפרוטק (450-03). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשויות להשתנות מאצווה לאצווה), במאגר (למשל DPBS + 0.2% BSA). אחסן ב-80&deg;C. מלאי עבודה (1&micro; גרם/מ"ל; 1000X): 1. יש לבצע 0.2% BSA בתמיסת DPBS ולעקר מסנן. 2. לדלל מלאי מאסטר aliquot ל-1 &micro; גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (למשל 20&micro; l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי. 4. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פתרון מלאי PDGF (10 ומיקרו; גרם/מ"ל; 1000X)</td><td></td><td></td> <td>מלאי ראשי: הזמנה מפפרוטק (100-13A). איפור ב-0.1 עד 1 מ"ג/מ"ל לפי היצרן הוראות (עשויות להשתנות מאצווה לאצווה) במאגר (למשל DPBS) + 0.2% BSA). אחסן ב-80&deg;C. מלאי עבודה (1&micro; גרם/מ"ל; 1000X): 1. יש לבצע 0.2% BSA בתמיסת DPBS ולעקר מסנן. 2. לדלל מלאי מאסטר aliquot ל-1&micro; גרם/מ"ל בסטרילי, צונן 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquot (למשל 20&micro; l/tube) ולהקפיא בחנקן נוזלי. 4. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין (1 מ"ג/מ"ל; 100X)</td><td></td><td></td><td>השהה מחדש פולי-D-ליזין, משקל מולקולרי 70-150 kD (Sigma P6407) ב-0.5 מ"ג/מ"ל ב-0.15M חומצה בורית pH 8.4 (למשל 50 מ"ג במאגר בוראט 50 מ"ל). סינון, עיקור וסימון (למשל 100&micro; l/tube). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. לפני השימוש, יש לדלל את ציר ה-100X (1 מ"ג/מ"ל) ל-50 ומיקרו; גרם/מ"ל במים סטריליים.</td></tr><tr>מצע <td></td><td></td><td>התפשטות אוליגודנדרוציטים</td><td>ראה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">טבלה משלימה 1</a></td></tr><tr><td>מדיית</td><td></td><td></td> התמיינות אוליגודנדרוציטים <td>ראה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">טבלה משלימה 1</a></td></tr><tr><td>תוספת סאטו (100X)</td><td></td><td></td><td>ראה <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">טבלה משלימה 1</a></td></tr><tr><td>הפניות: רשימת הריאגנטים והמתכונים אומצה מהפרוטוקולים שתוארו בעבר על ידי Emery et al. 2013 (Emery, B. & דוגאס, ג'יי סי טיהור תאי שושלת אוליגודנדרוציטים מקליפת העכבר על ידי אימונופאנינג. קולד ספרינג הארב פרוטוק. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) ו-Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. בידוד של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים של עכבר קליפת המוח. J שיטות נוירושי. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

הבידוד יעיל וחזק והתרבות של ראשי oligodendrocytes להפוך (OLs) הוא כלי בעל ערך לצורך המחקר במבחנה של הפיתוח של oligodendroglia, כמו גם הביולוגיה של אונים כגון טרשת נפוצה, Pelizaeus-Merzbacher-כמו מחלה (PMLD). כאן, אנו מציגים פשוטה, בחירה יעילה שיטת הבידוד immunomagnetic של שלב O4 3+ preoligodendrocytes תאים מן הגורים עכברים neonatal. מאז ילדותי OL מהווים יותר מ 80% של החומר הלבן מכרסם-מוח ביום כמחנכת 7 (P7) שיטה זו בידוד לא רק מבטיחה תשואה גבוהה הסלולר, אלא גם הבידוד ספציפי של OLs כבר מחויבים השושלת oligodendroglial, להקטין אפשרות לבודד תאים מזהמים כגון האסטרוציטים ותאים אחרים מהמוח העכבר. בשיטה זו הוא שינוי של טכניקות שדווחו בעבר, ומספק אוליגודנדרוציטים טוהר הכנה מעל 80% בכ-4 שעות.

מטרת מחקר זה היתה להקים שיטה בידוד משופר עבור O4+ העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך הדורשים מניפולציה שפחות של תאי היעד. ההליך כולו של המתת חסד של הגורים ציפוי של התאים coverslips לוקח כ 4 שעות, הנתונים המוצגים כאן מייצגים 3 ניסויים עצמאית. לאחר רקמת דיסוציאציה, ממוצע של 4.3 ± 0.46 x 107 תאים היו מבודדים עבור ניסוי עצמאית, עם יכולת הקיום של 91% ± 5.6%. לאחר בידוד immunomagnetic באמצעות אנטי-O4 מתויג גרגרי מגנטי ממוצע של ± 0.38 x 10 6.96 OLs התקבלו (1-1.5 ...

אנו מתארים את הבידוד immunomagnetic של העכבר הראשי oligodendrocytes, המאפשרת בידוד מהיר ולא ספציפי של תאי במבחנה לתרבות.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להשתמש בבידוד אימונומגנטי כדי לבחור אוליגודנדרוציטים חיוביים O4 מגורי עכברים יילודים לניתוח תרבית מבחנה שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח הקשורות לחקר מחלות המשפיעות על מיאלין ומיאלינציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מקלה על הכנת תרבית אוליגודנדרוציטים סופית בטוהר של יותר מ -80% תוך שעות של כשעה.התחילו במספריים קטנים לחיתוך העור לאורך קו האמצע של הקרקפת של עכבר יום חמישי עד שבע לאחר הלידה. משוך את דש העור כדי לחשוף את הגולגולת, וחתוך את הגולגולת בזהירות לאורך קו האמצע מהפתח בגב לאזור הקדמי. מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת, חתכו לכיוון כל ארובת עין לאורך בסיס העצם והשתמשו במלקחיים עדינים כדי להרחיק בעדינות את קליפת המוח האמצעי.לאחר מכן, העבירו את קליפת המוח לצלחת תרבית רקמה בגודל 60 מילימטר המכילה שבעה מיליליטר של B-27 Neurobasal A Medium. לאחר שכל המוחות נאספו, העבירו את קליפות המוח לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה בגודל 60 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה, והשתמשו בלהב אזמל מספר 15 כדי לחתוך את קליפות המוח לקוביות מילימטר אחד. דגרו את חלקי המוח באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למשך 20 דקות.לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של סרום צמיחת בקר כדי לעצור את התגובה האנזימטית. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, העבירו את תמיסת הרקמה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר ונתקו בעדינות את רקמת המוח שש עד שמונה פעמים עם פיפטינג. הניחו לגושי הרקמה המנותקים להתייצב במשך שתיים-שלוש דקות.לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של Neurobasal A Medium, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I לרקמות, והשתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לנתק בעדינות את הרקמות עם יותר פיפטינג. אתה מבין, כוח הפיפטינג המתאים הוא חיוני כדי להבטיח תפוקה גבוהה של תאים ברי קיימא.אם פיפטינג קשה מדי, הכדאיות עשויה להיות נמוכה. בעוד שאם פיפטינג עדין מדי, התשואה התאית עשויה להיות נמוכה. הניחו לחתיכות הטישו להתייצב עוד שתיים-שלוש דקות.לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה, והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום נוירו-בזאלי A טרי, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I לרקמה. נתקו בעדינות את רקמת המוח עם קצה פיפטה P-1000 עד שלא נשאר גוש גדול של רקמה, והקפידו להימנע מבועות. השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לסנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ולהביא את הנפח הסופי של התרחיף החד-תאי ל-30 מיליליטר עם מדיום נוירו-בסיסי טרי, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I.פיצול תרחיף התא לשני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר, ולגלול את התאים העצביים על ידי צנטריפוגה.הסירו את כל ה-5 עד 10 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט עכור והוסיפו לתאים שלושה מיליליטר של Neurobasal A Medium בתוספת סרום צמיחת בקר. השעו מחדש בזהירות את כדור התאים והביאו את הנפח הסופי עד 15 מיליליטר עם Neurobasal A Medium טרי המכיל סרום צמיחת בקר 10%. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, והביא את הנפח הסופי עד 30 מיליליטר עם Neurobasal A Medium טרי המכיל סרום צמיחת בקר 10%.לאחר מכן, פצלו את תרחיף התאים המסוננים בין שני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. והשעו מחדש את הכדורים ב-2.5 מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים קרים כקרח לפני איגום התאים. לאחר הספירה, צנטריפוגה שוב את התאים, והשעיה מחדש של הגלולה ב-90 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים טריים לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים.לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של חרוזי אנטי-04 לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים, וערבבו את תמיסת התאים בתנועה עדינה. לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תנועה עדינה כל חמש דקות, הוסף בעדינות שני מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטי לכל פעם 10 לשבעת התאים לשטיפה על ידי צנטריפוגה, והשליך את הסופרנטנט על ידי שאיבת ואקום זהירה. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים טריים לכל פעם 10 לשבעת התאים, והנח עמודת מיון חרוזים מגנטיים בגודל מתאים לתוך המפריד המגנטי המתאים לו.הנח מסננת של 40 מיקרון על העמוד ושטוף מראש את המסננת עם שלושה מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטי, ותן למאגר לעבור דרך העמודה מבלי לתת לעמודה להתייבש. הוסף את התאים למסננת, ולאחר מכן שטיפה של מיליליטר אחד עם מאגר מיון תאים מגנטי. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים בכל שטיפה, ופעם אחת עם מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים.לאחר מכן, העבירו את העמוד לצינור של 15 מיליליטר, והשתמשו בבוכנה כדי לשטוף מיד חמישה מיליליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים טרי דרך העמוד. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לצפיפות ציפוי מתאימה, ולהחליף את הלמינין מהחלקות כיסוי מצופות מראש בצלחת של 24 בארות עם 100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים. דגרו את האוליגודנדרוציטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך לא יותר מ-45 דקות כדי לקדם הידבקות אוליגודנדרוציטים להחלקות הכיסוי.לאחר מכן, הציפו כל באר של צלחת 24 הבארות ב-500 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים למשך 24 שעות. למחרת, החליפו את הסופרנטנטים במדיום התמיינות אוליגודנדרוציטים, והחזירו את התאים לאינקובטור עד שהם מוכנים לקיבוע. 24 שעות לאחר הציפוי, התאים נראים דו-קוטביים או תלת-קוטביים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מאפיין אופייני של אוליגודנדרוציטים מתרבים בשלב מוקדם.צביעה אימונופלואורסצנטית מראה כי 24 שעות לאחר הציפוי, רוב הפרה-אוליגודנדרוציטים הללו מדגימים גם תיוג NG2 ו-O4, בעוד שתיוג עם GFAP ונוגדנים נגד 01 הם הרבה פחות נפוצים, מה שמרמז על כך שרוב התאים בשלב זה הם פרה-אוליגודנדרוציטים עם מעט אוליגודנדרוציטים לא בשלים או בוגרים. לאחר 72 שעות, המורפולוגיה של האוליגודנדרוציטים נראית מורכבת יותר מאשר ב-24 שעות, ויש שכיחות נמוכה בהרבה של תאים חיוביים לסמן האוליגודנדרוציטים המוקדם, NG2. כמו כן, רוב התאים מדגימים תיוג O4, וכמעט מחצית מהתאים נצבעו לנוגדנים 01 בשלב זה, מה שמרמז על כך שהתאים מתמיינים לפנוטיפ בוגר יותר.יש לציין כי נוכחותם של אסטרוציטים נותרה נמוכה ביותר. תוצאות אלה מצביעות על כך שלאורך זמן, אוליגודנדרוציטים מבודדים אימונו-מגנטית מסוגלים להתמיין במבחנה לשלב השלישי של ההתבגרות עם זיהום מועט מאוד של סוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוליגודנדרוציטים ראשוניים מגורי עכברים יילודים באמצעות בידוד חיסוני מגנטי.לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.

rapid-specific-immunomagnetic-isolation-mouse-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי CD11b, כולל מיקרוגליה, ממוחות של גורי עכברים באמצעות מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית. רקמות המוח הומוגניות כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים, אשר מודגרים עם מיקרו-חרוזים מצופים נוגדנים נגד CD11b, ולאחר מכן הפרדה מבוססת עמודה מגנטית כדי לטהר את אוכלוסיית התאים CD11b+.

בידוד מגנטי של תאי מיקרוגליה ממוחות של גורי עכברים

סרטון זה מדגים טכניקה לבידוד וטיפוח תאים מקדימים אוליגודנדרוציטים (OPC) מקליפת המוח של גור העכבר.

בידוד וטיפוח תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים מקליפת המוח של גור עכבר

סרטון זה מדגים שיטה לבידוד תאי אוליגודנדרוציטים ראשוניים מתרחיף תא עצבי המתקבל מגור עכבר באמצעות הפרדה מגנטית. הטכניקה עושה שימוש בחרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים ספציפיים לאנטיגנים אוליגודנדרוציטים, המאפשרים בידוד סלקטיבי של תאים אלה.

בידוד אוליגודנדרוציטים ראשוניים באמצעות חרוזים אימונומגנטיים

סרטון זה מדגים פרוטוקול לחילוץ תאי מיקרוגליאה מנגעים דה-מיאלינציה במוחות עכברים באמצעות מיון תאים מגנטיים. הפרוטוקול כולל ניתוח רקמת המוח הפגועה המכילה תאי מיקרוגליה, טיפול ברקמה עם אנזימים ספציפיים לקבלת תרחיף חד-תאי, ושימוש בחרוזים מגנטיים ספציפיים לקולטן מיקרוגליה כדי לבודד את תאי המיקרוגליה.

בידוד מיקרוגליה מנגעי דה-מיאלינציה במוח עכבר באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.

בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד וטיהור מיקרוגליה ראשונית במודלים של בעלי חיים של מחלות דה-מיאלינציה, תוך שימוש במיון תאים המופעלים על ידי מגנטים.

בידוד של מיקרוגליה ראשונית של עכבר על ידי מיון תאים המופעלים מגנטית במודלים של בעלי חיים של Demyelination

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

למד בידוד אימונומגנטי של אוליגודנדרוציטים ראשוניים מעכברים ניאונטליים לחקר מיאלינציה ומחלות דמיאלינציה. שיטה זו מספקת טוהר תאים גבוה מ-80% תוך שעה אחת בלבד.

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

גלה סרטונים נוספים