בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא להשתמש בבידוד אימונומגנטי כדי לבחור אוליגודנדרוציטים חיוביים O4 מגורי עכברים יילודים לניתוח תרבית מבחנה שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח הקשורות לחקר מחלות המשפיעות על מיאלין ומיאלינציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מקלה על הכנת תרבית אוליגודנדרוציטים סופית בטוהר של יותר מ -80% תוך שעות של כשעה.

התחילו במספריים קטנים לחיתוך העור לאורך קו האמצע של הקרקפת של עכבר יום חמישי עד שבע לאחר הלידה. משוך את דש העור כדי לחשוף את הגולגולת, וחתוך את הגולגולת בזהירות לאורך קו האמצע מהפתח בגב לאזור הקדמי. מהפתח בחלק האחורי של הגולגולת, חתכו לכיוון כל ארובת עין לאורך בסיס העצם והשתמשו במלקחיים עדינים כדי להרחיק בעדינות את קליפת המוח האמצעי.

לאחר מכן, העבירו את קליפת המוח לצלחת תרבית רקמה בגודל 60 מילימטר המכילה שבעה מיליליטר של B-27 Neurobasal A Medium. לאחר שכל המוחות נאספו, העבירו את קליפות המוח לתוך צלחת תרבית רקמה חדשה בגודל 60 מילימטר המכילה חמישה מיליליטר של מאגר דיסוציאציה, והשתמשו בלהב אזמל מספר 15 כדי לחתוך את קליפות המוח לקוביות מילימטר אחד. דגרו את חלקי המוח באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 למשך 20 דקות.

לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של סרום צמיחת בקר כדי לעצור את התגובה האנזימטית. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, העבירו את תמיסת הרקמה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר ונתקו בעדינות את רקמת המוח שש עד שמונה פעמים עם פיפטינג. הניחו לגושי הרקמה המנותקים להתייצב במשך שתיים-שלוש דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת טרייה. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטר של Neurobasal A Medium, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I לרקמות, והשתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לנתק בעדינות את הרקמות עם יותר פיפטינג. אתה מבין, כוח הפיפטינג המתאים הוא חיוני כדי להבטיח תפוקה גבוהה של תאים ברי קיימא.

אם פיפטינג קשה מדי, הכדאיות עשויה להיות נמוכה. בעוד שאם פיפטינג עדין מדי, התשואה התאית עשויה להיות נמוכה. הניחו לחתיכות הטישו להתייצב עוד שתיים-שלוש דקות.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה, והוסיפו שלושה מיליליטר של מדיום נוירו-בזאלי A טרי, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I לרקמה. נתקו בעדינות את רקמת המוח עם קצה פיפטה P-1000 עד שלא נשאר גוש גדול של רקמה, והקפידו להימנע מבועות. השתמש בפיפטה של 10 מיליליטר כדי לסנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרון לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר, ולהביא את הנפח הסופי של התרחיף החד-תאי ל-30 מיליליטר עם מדיום נוירו-בסיסי טרי, בתוספת סרום צמיחת בקר ו-DNase I.פיצול תרחיף התא לשני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר, ולגלול את התאים העצביים על ידי צנטריפוגה.

הסירו את כל ה-5 עד 10 המיקרוליטרים האחרונים של סופרנטנט עכור והוסיפו לתאים שלושה מיליליטר של Neurobasal A Medium בתוספת סרום צמיחת בקר. השעו מחדש בזהירות את כדור התאים והביאו את הנפח הסופי עד 15 מיליליטר עם Neurobasal A Medium טרי המכיל סרום צמיחת בקר 10%. סנן את תמיסת התא דרך מסננת תאים של 40 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, והביא את הנפח הסופי עד 30 מיליליטר עם Neurobasal A Medium טרי המכיל סרום צמיחת בקר 10%.

לאחר מכן, פצלו את תרחיף התאים המסוננים בין שני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. והשעו מחדש את הכדורים ב-2.5 מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים קרים כקרח לפני איגום התאים. לאחר הספירה, צנטריפוגה שוב את התאים, והשעיה מחדש של הגלולה ב-90 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים טריים לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים.

לאחר מכן, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של חרוזי אנטי-04 לכל אחד כפול 10 לשבעת התאים, וערבבו את תמיסת התאים בתנועה עדינה. לאחר 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תנועה עדינה כל חמש דקות, הוסף בעדינות שני מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטי לכל פעם 10 לשבעת התאים לשטיפה על ידי צנטריפוגה, והשליך את הסופרנטנט על ידי שאיבת ואקום זהירה. השעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים טריים לכל פעם 10 לשבעת התאים, והנח עמודת מיון חרוזים מגנטיים בגודל מתאים לתוך המפריד המגנטי המתאים לו.

הנח מסננת של 40 מיקרון על העמוד ושטוף מראש את המסננת עם שלושה מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטי, ותן למאגר לעבור דרך העמודה מבלי לתת לעמודה להתייבש. הוסף את התאים למסננת, ולאחר מכן שטיפה של מיליליטר אחד עם מאגר מיון תאים מגנטי. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של מאגר מיון תאים מגנטיים בכל שטיפה, ופעם אחת עם מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים.

לאחר מכן, העבירו את העמוד לצינור של 15 מיליליטר, והשתמשו בבוכנה כדי לשטוף מיד חמישה מיליליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים טרי דרך העמוד. לאחר הספירה, יש לדלל את התאים לצפיפות ציפוי מתאימה, ולהחליף את הלמינין מהחלקות כיסוי מצופות מראש בצלחת של 24 בארות עם 100 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים. דגרו את האוליגודנדרוציטים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך לא יותר מ-45 דקות כדי לקדם הידבקות אוליגודנדרוציטים להחלקות הכיסוי.

לאחר מכן, הציפו כל באר של צלחת 24 הבארות ב-500 מיקרוליטר של מדיום התפשטות אוליגודנדרוציטים למשך 24 שעות. למחרת, החליפו את הסופרנטנטים במדיום התמיינות אוליגודנדרוציטים, והחזירו את התאים לאינקובטור עד שהם מוכנים לקיבוע. 24 שעות לאחר הציפוי, התאים נראים דו-קוטביים או תלת-קוטביים במיקרוסקופ ניגודיות פאזה, מאפיין אופייני של אוליגודנדרוציטים מתרבים בשלב מוקדם.

צביעה אימונופלואורסצנטית מראה כי 24 שעות לאחר הציפוי, רוב הפרה-אוליגודנדרוציטים הללו מדגימים גם תיוג NG2 ו-O4, בעוד שתיוג עם GFAP ונוגדנים נגד 01 הם הרבה פחות נפוצים, מה שמרמז על כך שרוב התאים בשלב זה הם פרה-אוליגודנדרוציטים עם מעט אוליגודנדרוציטים לא בשלים או בוגרים. לאחר 72 שעות, המורפולוגיה של האוליגודנדרוציטים נראית מורכבת יותר מאשר ב-24 שעות, ויש שכיחות נמוכה בהרבה של תאים חיוביים לסמן האוליגודנדרוציטים המוקדם, NG2. כמו כן, רוב התאים מדגימים תיוג O4, וכמעט מחצית מהתאים נצבעו לנוגדנים 01 בשלב זה, מה שמרמז על כך שהתאים מתמיינים לפנוטיפ בוגר יותר.

יש לציין כי נוכחותם של אסטרוציטים נותרה נמוכה ביותר. תוצאות אלה מצביעות על כך שלאורך זמן, אוליגודנדרוציטים מבודדים אימונו-מגנטית מסוגלים להתמיין במבחנה לשלב השלישי של ההתבגרות עם זיהום מועט מאוד של סוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד אוליגודנדרוציטים ראשוניים מגורי עכברים יילודים באמצעות בידוד חיסוני מגנטי.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע שעות, אם היא מבוצעת כראוי. תודה שצפית. בהצלחה בניסויים שלך.