Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

Xiaomin Dong; Raquel Cuevas-Diaz Duran; Yanan You; Jia Qian Wu

doi:10.3791/57547

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFRα+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

Full Text

9,717 Views

12:29 min

April 16, 2018

DOI: 10.3791/57547-v

Xiaomin Dong¹, Raquel Cuevas-Diaz Duran¹, Yanan You¹, Jia Qian Wu¹

¹The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine,University of Texas Health Science Center

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for analyzing the genome-wide binding of oligodendrocyte transcription factor 2 (Olig2) in acutely purified brain oligodendrocyte precursor cells (OPCs). The method includes low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP), high-throughput sequencing, and bioinformatic data analysis, aiming to enhance our understanding of transcriptional regulation and epigenetic mechanisms involved in cell differentiation.

Key Study Components

Area of Science

Genomics
Cell Differentiation
Transcriptional Regulation

Background

Oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are critical for myelination in the central nervous system.
Understanding the binding patterns of transcription factors like Olig2 can reveal insights into the differentiation processes.
This protocol facilitates the study of transcriptional dynamics in primary cells.
The ability to use low-cell numbers is advantageous for studies with limited samples.

Purpose of Study

To analyze the genome-wide binding of Olig2 in OPCs.
To demonstrate a robust method for studying transcriptional regulation.
To provide insights into the epigenetic mechanisms influencing OPC differentiation.

Methods Used

The main platform utilized is low-cell chromatin immunoprecipitation (ChIP) combined with high-throughput sequencing.
The biological model involves acutely purified OPCs derived from mouse brains.
Key steps include immunopanning for cell purification and a series of centrifugation and incubation procedures for ChIP.
Critical steps involve cross-linking and chromatin shearing to ensure effective antibody binding.
Analysis is supported by bioinformatic techniques to process sequencing data.

Main Results

The protocol enables the investigation of Olig2 binding patterns across the genome.
Insights into transcriptional regulation and epigenetic influences on OPC differentiation are obtained.
Findings may lead to a better understanding of remyelination processes in neurological conditions.
The method demonstrates robustness for studying other transcription factors in similar conditions.

Conclusions

This study enables detailed analysis of transcription factor dynamics in primary neural cells.
It highlights the protocol's versatility for various transcription factors and limited cell populations.
These findings contribute to a deeper understanding of cellular differentiation mechanisms and potential therapeutic targets.

Frequently Asked Questions

What is the advantage of using low-cell chromatin immunoprecipitation?

Low-cell chromatin immunoprecipitation allows researchers to analyze transcription factor bindings with limited cell numbers, making it ideal for primary cells obtained from small samples.

How is the biological model implemented in this study?

The model involves acutely purified oligodendrocyte precursor cells derived from mouse brains, isolating these cells for precise analysis.

What types of data can be obtained using this method?

This method provides data on genome-wide transcription factor binding, enabling insights into regulatory networks and epigenetic mechanisms.

Can this method be adapted for other transcription factors?

Yes, the protocol is designed to be broadly applicable for analyzing other transcription factors in diverse cell types.

What are the critical steps involved in the chromatin immunoprecipitation process?

Key steps include cross-linking, chromatin shearing, antibody binding, and rigorous washing to ensure specificity in the precipitation of target DNA.

כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לנתח את הקישור בכל הגנום של גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 בתאי מבשר אוליגודנדרוציטים במוח מטוהרים באופן חריף על ידי ביצוע אימונופאנינג, משקעים חיסוניים של כרומטין תאים נמוכים, ריצוף תפוקה גבוהה וניתוח נתונים ביואינפורמטיים. שיטה זו היא כלי רב עוצמה לחקר ויסות שעתוק ומנגנונים אפיגנטיים ברחבי הגנום, הממלאים תפקידים חשובים בהתמיינות והתפתחות התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה באופן נרחב ב-ChIP-seq של גורמי שעתוק אחרים עם כל סוג תא במספרים מוגבלים, כולל תאים ראשוניים מטוהרים באופן חריף ללא התפשטות במבחנה.

מי שידגים את ההליך יהיה יאנאן יו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. היא מחברת שותפה של מאמר זה. כדי לבחור את התאים החיוביים ל-PDGFR-אלפא, הכינו צלחת אחת ל-immunopanning.

הכן שתי צלחות נוספות לתאי אנדותל ודלדול מיקרוגליה. לאחר מכן, מצפים צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר ב-30 מיקרוליטר של אימונוגלובולין נגד חולדות עיזים. לאחר מכן, ערבבו את הצלחת על מנת להבטיח שכל שטח הצלחת מכוסה באופן שווה בתמיסת הציפוי.

השאירו את צלחת הפטרי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לדלל 40 מיקרוליטר של נוגדן נגד PDGFR-אלפא של חולדות עם 12 מיליליטר DPBS המכילים 0.2% אלבומין בסרום בקר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת המצופה G של אימונוגלובולין עם 10 מיליליטר של 1X DPBS במשך שלוש פעמים רצופות.

לאחר מכן, דגרו את הצלחת המצופה אימונוגלובולין G עם תמיסת נוגדנים PDGFR-alpha בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, הוסף בזהירות DPBS לאורך הדופן הצדדית של הצלחת כדי לשטוף את הצלחת המצופה נוגדנים נגד PDGFR-אלפא שלוש פעמים. אל תפריע למשטח המצופה של הצלחת.

לאחר מכן, השתמש ב-20 מיליליטר DPBS עם 2.3 מיקרוגרם למיליליטר של BSL-1 כדי לצפות שתי צלחות פטרי של 15 סנטימטר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הוסף בזהירות 20 מיליליטר DPBS לאורך הדופן הצדדית של הצלחת כדי לשטוף את צלחת BSL-1 שלוש פעמים. אל תפריע למשטח המצופה.

לאחר הכביסה, צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב -300 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, הוסף 15 מיליליטר של מאגר חיסון לכדור התא. לאחר מכן, דגרו את התרחיפים החד-תאיים משני מוחות עכברים ברצף על שתי צלחות פטרי מצופות BSL-1.

לאחר מכן, השאירו את הצלחות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים את הצלחת כל חמש דקות במהלך הדגירה. לאחר מכן, סובב בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את כל התאים שאינם נדבקים מתרחיף התאים.

לאחר מכן, זרעו את התאים על הצלחת המצופה בנוגדנים PDGFR-אלפא של החולדה. דוגרים את הצלחת למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. בתום 45 דקות, סובבו שוב את הצלחת.

לאחר מכן, השלך את מתלה התאים. לאחר מכן, שטפו את הצלחת עם DPBS שמונה פעמים כדי להסיר את התאים שאינם נדבקים. בדוק את הצלחת במיקרוסקופ.

לאחר מכן, הוסף תמיסת ניתוק תאים על הצלחת המצופה נוגדן PDGFR-אלפא של חולדה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בינתיים, נער את הצלחת כדי לעקור את התאים הדבקים, ובדוק אותה במיקרוסקופ.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים OPC. לאחר מכן, ספרו את התאים בשיטת אי הכללת הטריפן הכחול בהמוציטומטר.

לאחר ספירה בהמוציטומטר, הוסף 20,000 OPCs מטוהרים במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי OPC לתגובת ChIP. לאחר מכן, הוסיפו 27 מיקרוליטר של 36.5% פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. פעולה זו תתקן את התאים.

לאחר 10 דקות, הוסף 50 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי על התאים הקבועים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוספת הגליצין תפסיק את הקישור ההדדי DNA-חלבון. לאחר מכן, שטפו את התאים הצולבים עם מיליליטר אחד של מאגר HBSS עם קוקטייל מעכב פרוטאז.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים במכונת צנטריפוגה מקוררת מראש ב-300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר קישור צולב של ה-OPCs המטוהרים, יש לשטוף את התאים הצולבים באמצעות תמיסת HBSS קרה כקרח, ולבצע את שאר שלבי ה-ChIP בארבע מעלות, אחרת הנוגדן לא יכול לזרז את ה-DNA הגנומי כראוי. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר ליזה שלם לכדור התא, והשאיר על קרח למשך חמש דקות.

לאחר מכן, פיפטה 75 מיקרוליטר של מאגר HBSS קר כקרח עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, גזור את הכרומטין של התא ליזאט במערכת סוניקציה מקוררת מראש עם חמישה מחזורים של 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי בתוכנית. לאחר גזירת הכרומטין, צנטריפוגה את התא ליזאט ב-14,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בסוף הצנטריפוגה, אוספים את הסופרנטנט. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהכרומטין הגזוז בנפח שווה של מאגר ChIP קר כקרח עם מעכב פרוטאז. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדן ארנב נגד Olig2 ל -180 מיקרוליטר של הכרומטין הגזוז המדולל.

דגרו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס ב-40 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזי חלבון מצופים A שטופים מראש לצינור התגובה ChIP בחדר קר. שוב, דגרו את צינורות ה-ChIP בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות על הגלגל המסתובב.

לאחר שעתיים, השאר את צינור התגובה ChIP על המדף המגנטי למשך דקה. לאחר מכן, שטפו את כדור החרוזים עם 100 מיקרוליטר של ארבעה מאגרי כביסה כל אחד למשך ארבע דקות על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה לגלולת החרוזים.

דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שהדנ"א הדו-גדילי עובר דנטורציה, יש לזרחן את הקצה התלת-ראשוני של ה-DNA החד-גדילי על ידי הוספת פוספטאז אלקליין שרימפס. לאחר מכן, הוסף זנב פולי-T ל-DNA החד-גדילי באמצעות טרנספראז דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז.

לאחר מכן, חישול פריימר ה-DNA poly-dA לתבנית ה-DNA החד-גדילית. לאחר מכן, הגדל את ספריית רצף ה-ChIP באמצעות פריימרים קדימה ואחורה לאינדקס. מספר מחזורי ה-PCR להכנת הספרייה תלוי בכמות ה-DNA ההתחלתי.

הכנת ספרייה טובה דורשת כימות מדויק של כמות ה-DNA הקלט. יותר מדי או מעט מדי מחזורי PCR יכולים להשפיע על ריכוז הספרייה, כמו גם על המורכבות, מה שמוביל לחפצי PCR. השתמש בחרוזים פרמגנטיים כדי לבחור את השברים הנעים בין 250 ל-500 זוגות בסיסים מספריית רצף ה-ChIP המוגברת ב-PCR.

השתמש במכשיר אלקטרופורזה של נימי שבב מיקרופלואידיים כדי לבחון את איכות ספריית רצף ה-ChIP שנבחרה. כדי להעריך את טוהר ה-OPCs האימונופניים, מבוצעים מחקרי צביעה חיסונית. בשימוש בנוגדני NG2 של סמן שושלת OPC, הוא מראה שרוב התאים האימונופניים של נוגדני PDGFR-alpha הם חיוביים ל-NG2.

לאחר מכן, PCR כמותי נעשה כדי לאמת את ההעשרה של PDGFR-alpha. התרשים שהתקבל מראה ביטוי מועט של Tuj1, סמן עצבי המצביע על העשרה משמעותית של PDGFR-alpha בהשוואה לתאי המוח המנותקים. תוצאות דומות מתקבלות המראות ביטוי מועט עבור כל הסמנים האחרים, כגון GFAP, Mog ו-Mbp, מה שמעיד על העשרה של PDGFR-alpha.

לאחר מכן, מנתחים את איכות ספריית רצף ה-ChIP. האלקטרופרוגרמה מייצגת שיא ברור עבור גורם השעתוק של Olig2 הנע בין 250 ל-500 זוגות בסיסים לאחר בחירת הגודל של מוצר ה-PCR של הספרייה. כאן, ההיסטוגרמה מציגה את שיבוט התג, כדי לאמת את מדדי בקרת האיכות שהתקבלו לפני שיא השיחות.

הסרגל מציין שיותר מ-90% מהקריאות ממופות למיקום גנומי אחד בלבד. לאחר מכן, מתקבלת עלילת מתאם גדיל, המתארת שיא מועשר המתאים לאורך השבר השולט. בתרשים, הקווים האדומים מייצגים את אורך הקריאה ב-50 זוגות בסיסים ואת אורך השבר ב-130 זוגות בסיסים, בהתאמה, ובכך מצביעים על נתונים באיכות גבוהה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור אתר קשירת DNA ברחבי הגנום של גורמי שעתוק וחלבונים אחרים בתאים ראשוניים או בתאים נדירים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לטהר OPCs ראשוניים ממוח העכבר על ידי אימונופאנינג וכיצד לבצע ניסוי ChIP-seq על ידי שימוש במספר נמוך של תאים.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos