Name: זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: חקור שיטת ChIP-seq בתאים מועטים לניתוח קישור גנומי רחב של Olig2 בתאי קדם-אוליגודנדרוציטים ממוח עכבר. השיטה מאפשרת חקר רגולציה תעתיקית ומנגנונים אפיגנטיים בהתמיינות תאים עצביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JQW, XD, RCDD ו- YY נתמכו על ידי מענקים נבחרת מוסדות של בריאות R01 NS088353; 1R21AR071583 גרנט NIH-01; קרן Staman אוגילבי קרן-אנדרטת הרמן; היוזמה המוח UTHealth ואת CTSA UL1 TR000371; מענק מן האוניברסיטה של טקסס מערכת מדעי המוח מכון המחקר Neurotechnology (גרנט #362469).

<ol><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+control+of+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+Long+Non-coding+RNAs+in+Purified+Cell+Types+from+the+Brain+Reveals+Functional+LncRNA+in+OPC+Fate+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination.</a> PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).</li>
<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J Vis Exp. (10), e562(2007).</li>
<li>Emery, B., Dugas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+lineage+cells+from+mouse+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+signaling+and+olig1%2F2+interact+to+regulate+the+differentiation+and+maturation+of+adult+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells.</a> Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Team, R. C. <a target="_blank" href="https://www.gbif.org/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical-computing">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2015).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).</li>
<li>Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+depth+and+coverage%3A+key+considerations+in+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Kheradpour, P., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+and+characterization+of+regulatory+motifs+in+ENCODE+TF+binding+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).</li>
<li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Raskatov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NF-kappaB-dependent+gene+transcription+using+programmable+DNA+minor+groove+binders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).</li>
<li>Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReMap+2018%3A+an+updated+atlas+of+regulatory+regions+from+an+integrative+analysis+of+DNA-binding+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2017).</li>
<li>Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTRD%3A+a+database+of+transcription+factor+binding+sites+identified+by+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).</li>
<li>Kulakovskiy, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOCOMOCO%3A+a+comprehensive+collection+of+human+transcription+factor+binding+sites+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).</li>
<li>Gerstein, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+regulatory+network+derived+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data.</a> Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

ג'ין בתרבית של רגולציה רשתות הם מורכבים מאוד. שבב-seq היא שיטה חזקה לחקור אינטראקציות חלבון-DNA הגנום כולו. פרוטוקול זה כולל כיצד לבצע Olig2 שבב-seq באמצעות מספר נמוך של OPCs מטוהרים מוח העכבר (נמוך כמו 20 אלף תאים לכל תגובה). הצעד הראשון מפתח עבור פרוטוקול זה הוא הטיהור של OPCs של מוח העכבר על ידי immunopanning עם נוגדנים PDGFRα. עבור בחירת חיובי OPCs עם PDGFRα מצופה לוחות, לאגד PDGFRα לעיתים קרובות חלש OPCs מצופה לוחות. גם לאחר מספר שוטף, יש עדיין נותרו כמה תאים שאינם מחסידי. חשוב לבדוק שהתאים שאינם מחסידי לאחר כל D-PB...

חשוב ללמוד את החלבון (או החלבונים) ה-DNA כריכות, הסימנים epigenetic לבנות רשתות בקרה רגולטריות תעתיק המעורבים בתהליכים ביולוגיים שונים. במיוחד, איגודי גורמי שעתוק לדנ א הגנומי יכול לשחק תפקיד חשוב של הכונה, הבידול תא, לבין התפתחות רקמת. כלי רב עוצמה עבור הלומדים את תקנה תעתיק ואת מנגנוני epigenetic הוא immunoprecipitation כרומטין (ChIP). עקב התקדמות מהירה הטכנולוגיה רצף של הדור הבא, שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) משמש עבור הניתוחים של חלבון-DNA כריכות, סימני epigenetic1. עם זאת, פרוטוקול תקני seq שבב דורש כ-20 מיליון תאים לכל תגובה, מה שהופך את היישום של טכניקה זו קשה כאשר מספר התא מוגבל, כגון תאים בודדים ראשי אוכלוסיות תאים נדיר.
אוליגודנדרוציטים שושלת התאים כולל אוליגודנדרוציטים קודמן תאים (OPCs) ו אוליגודנדרוציטים מופצים באופן נרחב ברחבי המוח, הם חיוניים עבור ההתפתחות והתפקוד של המוח. כסוג של קודמן תאים, OPCs מסוגלים התחדשות עצמית והן בידול. OPCs לא רק לשמש אבות עבור oligodendrocytes להפוך אלא גם לשחק תפקיד חשוב הפצת אותות עצביים בהתקשרות עם סוגים אחרים של תאים במוח2. מחקרים קודמים הראו כי פיתוח אוליגודנדרוציטים מוסדר על ידי גורמי שעתוק שושלת היוחסין הספציפי כגון3,Olig2 ו- Sox104. גורמי שעתוק אלה נמצאו כדי לאגד האזורים יזם או שיפור של כמה גנים חיוניים כדי להשפיע על הביטוי שלהם במהלך אוליגודנדרוציטים מפרט ובידול. עם זאת, מאתגרות לזיהוי DNA קשירה של חלבון (או החלבונים) עניין בבחריפות מטוהרים OPCs ראשי עם מספר מאוד מצומצם של תאים.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לחקור באופן שיטתי את immunoprecipitated דנ א גנומי על ידי Olig2 ב העכבר מטוהרים OPCs בקנה מידה הגנום כולו באמצעות שבב-seq טכניקה. OPCs של מוח העכבר היו בחריפות מטוהרת על-ידי immunopanning, המשמשים ניסוי שבב ללא התפשטות בתוך חוץ גופית. מספר מוגבל של OPCs יכולה להיות מושגת על ידי immunopanning, והוא די לניסויים שבב-seq סטנדרטי. במסמך זה, פרוטוקול שבב-seq נמוך-תא עם יהיה נמוך ככל 20 אלף תאים לכל שבב תגובה עבור גורמי שעתוק מתואר. בקצרה, צולבים התאים היו lysed, sonicated על ידי מכשיר sonication להטיה של כרומטין. כרומטין הוטו, נדגרה עם נוגדנים Olig2, כמו גם חלבון חרוזים מצופים A, כדי לזרז Olig2 נוגדנים מאוגד הדנ א. לאחר • תנאי של חרוזים מצופים של חלבון ו- cross-linking הפוכה, דנ א גנומי משהחמיר נוגדן Olig2 היה טהור על ידי מיצוי פנול-כלורופורם. המוצר הסופי היה לכמת, נתון T-עוקב, פריימר חישול החלפת תבנית והסיומת, התוספת של מתאמי, הגברה, בחירת גודל הספרייה, טיהור צעדים לבניית ספריה שבב-seq.
לאחר רצף, ניתחנו את איכות הקריאות raw המדגם שהוכנו עם נוגדן פקטור שעתוק Olig2 והן את דגימת הבקרה. באיכות נמוכה בסיסי זוגות, מתאם המכילה לקרוא קטעים נגזמו. קריאות הבא, החתוך היו המיושר הגנום הפניה העכבר. האזורים גנומית זה היו באופן משמעותי מועשר עבור קריאות שבב, לעומת הדגימה שליטה, אותרו כמו פסגות. פסגות משמעותית, המייצג אתרי קישור פקטור שעתוק פוטנציאליים, מסוננים, דמיינו בדפדפן הגנום.
ראוי לציין, השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה ניתן באופן כללי על שבב-seq גורמים אחרים תמלול עם כל סוג התא של מספרים מוגבלת.

<table><tbody><tr><td><חזק>מגיב / ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia לקטין 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-PDGFRa נוגדן</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של רקמות עצביות (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות</td><td></td> <td>Accutase STEMCELL# 07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td> <td># 15596026</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-NG2 כונדרויטין סולפט פרוטאוגליקן נוגדן</td><td>Millipore</td> <td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Pico מכשיר סוניקציה</td><td>Diagenode</td> <td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>ערכת MicroChIP אמיתית</td><td>דיאגנוד</td> <td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1, v/v)</td> <td>תרמו Fisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ניקוי ג'ל ו-PCR של NucleoSpin</td><td>MACHEREY-NAGEL</td><td># 740609-Quant-iT</td><td></td></tr><tr><td>PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>ערכת DNA SMART ChIP-Seq</td><td>Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>פיקו-ירוק</td><td>תרמו פישר</td> <td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>תרמו פישר</td> <td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR תערובת מאסטר ירוקה</td><td>מעבדות ביו-ראד</td> <td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>פישר סיינטיפיק</td> <td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (P / S)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>תוסף N-2</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17502048</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B-27</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Sigma</td><td># I6634</td><td>הכן תמיסת אינסולין של 0.5 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 5 מ"ג אינסולין ב-10 מ"ל מים ו-50 &mu; l של 1 N HCl.</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, מתאים לתרבית תאים (BSA)</td><td>Sigma</td><td># A4161</td><td>הכן תמיסת BSA 4% על ידי המסת 4 גרם BSA ב-100 מ"ל D-PBS והתאם את ה-pH ל-7.4</td></tr><tr><td>חלבון בסיסי של גורם גדילה פיברובלסטים, רקומביננט אנושי (bFGF)</td><td>EMD Millipore</td><td># GF003</td><td></td></tr><tr><td>HUMAN PDGF-AA</td><td>VWR</td><td># 102061-188</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין</td><td>VWR</td><td># IC15017510</td><td>הכן תמיסת פולי-D-ליזין של 1 מ"ג/מ"ל על ידי המסת 10 מ"ג פולי-D-ליזין ב-10 מ"ל מים ודלל 100 פעמים בעת השימוש.</td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים של פלקון, סטריליים, קורנינג, 100x15 מ"מ</td><td>VWR</td><td># 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>כלי פטרי חד פעמיים של פלקון, סטריליים, קורנינג, 150x15 מ"מ</td><td>VWR</td> <td># 25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 10X, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>פישר מדעי</td> <td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td> <td># 07050</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>השגת מדדי בקרת איכות של קריאות גולמיות וחתוכות</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td> <td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>חיתוך וסינון קריאות</td></tr> <tr><td>גולמיותGENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>גנום ייחוס לעכבר</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td><td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td>יישור קורא לגנום ייחוס</td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td><td>[13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>המרת קובץ SAM לפורמט BAM</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>יצירת ספריית תגים והערות לאזורים גנומיים מועשרים עם סמלי גנים</td></tr><tr><td>R 3.2.2</td><td>[15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>תכנות סקריפטים ופונקציות ריצה</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>יצירת עלילת מתאם צולב גדיל</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>מציאת אזורים של העשרת ChIP על גבי</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td> <td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>אריתמטיקה גנומית</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>המרת קובץ bedGraph לדפדפן IGV bigwig</td></tr><tr><td>2.3.58</td><td>[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>הדמיה וגלישה של שיאים משמעותיים של ChIP-seq תוכנית</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>Spreasheet</td></tr><tr><td>הרשימה השחורה של ENCODE</td><td>https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td>סינון שיאים</td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.</td><td></td><td>המרת קובץ bedGraph למסד</td></tr><tr><td>הנתונים של המוטיבים של bigwig ENCODE</td><td>[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>מסד נתונים מוטיבים מקיף הנדרש להעשרת מוטיבים</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td><td>[20] http://meme-suite.org/index.html ניתוח</td><td></td><td>העשרת מוטיבים וגילוי מוטיבים</td></tr> <tr><td>שמות פריימרים המשמשים להעשרת מוטיבים </td><td></td><td></td><td><רצפי פריימר חזקים> המשמשים עבור qPCR</td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGGTTATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCAGCCTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCTGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTTGGAGGAAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R:</td><td></td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACGGTACTCCT</td></tr></tbody></table>

זיהוי אתרים פקטור שעתוק olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר pdgfrα + תאים על-ידי immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

בתרבית של תאים, שעתוק גנים מוסדר באופן ספציפי סוג התא על ידי פעולת הגומלין בין גורמים תעתיק עם הדנ א. גורמי שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין נחשבים ממלאים תפקידים חיוניים ב מפרט תא ובידול במהלך הפיתוח. שבב בשילוב עם רצפי DNA תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) נעשה שימוש נרחב כדי לנתח אתרי קישור ברמת הגנום של גורמי שעתוק (או שלה מורכב משויכת) ל- DNA גנומי. עם זאת, מספר גדול של תאים נדרשים עבור אחד שבב התגובה השגרתית, מה שהופך את זה קשה ללמוד מספר מוגבל של התאים הראשי מבודד או אוכלוסיות תאים נדיר. כדי להבין את מנגנון רגולטורי של שעתוק ספציפיים שושלת היוחסין אוליגודנדרוציטים מוצג גורם Olig2 העכבר בחריפות מטוהרים OPCs, שיטה מפורטת באמצעות שבב-seq לזהות את האתרים ברמת הגנום מחייב Olig2 (או Olig2 מורכבים). ראשית, הפרוטוקול מסביר כיצד לטהר את האלפא קולטן גורם גידול נגזר טסית דם (PDGFRα) OPCs חיובי מן מוח העכבר. בשלב הבא, נוגדן Olig2 מתווכת שבב, ספריית הבנייה מבוצעות. החלק האחרון מתאר את תוכנת bioinformatic של הליכים המשמשים לניתוח Olig2 שבב-seq. לסיכום, מאמר זה מדווח שיטה לנתח את איגודי ברמת הגנום של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 במוח בחריפות מטוהרים OPCs.

נמוך-תא שבב-seq בוצעה, bioinformatic ניתוחים נעשו כדי לחקור את האינטראקציות פוטנציאלי של גנים ברמת השעתוק גורם Olig2 עם ה-DNA גנומי במוח בחריפות מטוהרים OPCs. איור 1 מראה כללי זרימת עבודה הן את ניסיוני והן ההליכים ניתוח נתונים. ב פרוטוקול זה, המוח עכברים כמחנכת היו הפומבית להשעיה תא בודד. לאחר רקמת הדיסוציאציה immunopanning בוצעה לטהר את OPCs באמצעות נוגדן PDGFRα. איור 2 מציג את העשרת משמעותית של PDGFRα, ביטוי קטן של נוירון סמן T...

כאן אנו מציגים פרוטוקול אשר נועד לנתח את הגנום כולו הכריכה של הגורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2) בתאי המוח בחריפות מטוהרים אוליגודנדרוציטים קודמן (OPCs) על-ידי ביצוע כרומטין נמוך-תא immunoprecipitation (ChIP) , ספריית הכנה, תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים bioinformatic.

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לנתח את הקישור בכל הגנום של גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2 בתאי מבשר אוליגודנדרוציטים במוח מטוהרים באופן חריף על ידי ביצוע אימונופאנינג, משקעים חיסוניים של כרומטין תאים נמוכים, ריצוף תפוקה גבוהה וניתוח נתונים ביואינפורמטיים. שיטה זו היא כלי רב עוצמה לחקר ויסות שעתוק ומנגנונים אפיגנטיים ברחבי הגנום, הממלאים תפקידים חשובים בהתמיינות והתפתחות התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ישימה באופן נרחב ב-ChIP-seq של גורמי שעתוק אחרים עם כל סוג תא במספרים מוגבלים, כולל תאים ראשוניים מטוהרים באופן חריף ללא התפשטות במבחנה.מי שידגים את ההליך יהיה יאנאן יו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. היא מחברת שותפה של מאמר זה. כדי לבחור את התאים החיוביים ל-PDGFR-אלפא, הכינו צלחת אחת ל-immunopanning.הכן שתי צלחות נוספות לתאי אנדותל ודלדול מיקרוגליה. לאחר מכן, מצפים צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר ב-30 מיקרוליטר של אימונוגלובולין נגד חולדות עיזים. לאחר מכן, ערבבו את הצלחת על מנת להבטיח שכל שטח הצלחת מכוסה באופן שווה בתמיסת הציפוי.השאירו את צלחת הפטרי למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לדלל 40 מיקרוליטר של נוגדן נגד PDGFR-אלפא של חולדות עם 12 מיליליטר DPBS המכילים 0.2% אלבומין בסרום בקר. לאחר מכן, שטפו את הצלחת המצופה G של אימונוגלובולין עם 10 מיליליטר של 1X DPBS במשך שלוש פעמים רצופות.לאחר מכן, דגרו את הצלחת המצופה אימונוגלובולין G עם תמיסת נוגדנים PDGFR-alpha בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, הוסף בזהירות DPBS לאורך הדופן הצדדית של הצלחת כדי לשטוף את הצלחת המצופה נוגדנים נגד PDGFR-אלפא שלוש פעמים. אל תפריע למשטח המצופה של הצלחת.לאחר מכן, השתמש ב-20 מיליליטר DPBS עם 2.3 מיקרוגרם למיליליטר של BSL-1 כדי לצפות שתי צלחות פטרי של 15 סנטימטר למשך שעתיים. לאחר הדגירה, הוסף בזהירות 20 מיליליטר DPBS לאורך הדופן הצדדית של הצלחת כדי לשטוף את צלחת BSL-1 שלוש פעמים. אל תפריע למשטח המצופה.לאחר הכביסה, צנטריפוגה את המתלה החד-תאי ב -300 פעמים גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, הוסף 15 מיליליטר של מאגר חיסון לכדור התא. לאחר מכן, דגרו את התרחיפים החד-תאיים משני מוחות עכברים ברצף על שתי צלחות פטרי מצופות BSL-1.לאחר מכן, השאירו את הצלחות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מערבבים את הצלחת כל חמש דקות במהלך הדגירה. לאחר מכן, סובב בעדינות את הצלחת כדי לאסוף את כל התאים שאינם נדבקים מתרחיף התאים.לאחר מכן, זרעו את התאים על הצלחת המצופה בנוגדנים PDGFR-אלפא של החולדה. דוגרים את הצלחת למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. בתום 45 דקות, סובבו שוב את הצלחת.לאחר מכן, השלך את מתלה התאים. לאחר מכן, שטפו את הצלחת עם DPBS שמונה פעמים כדי להסיר את התאים שאינם נדבקים. בדוק את הצלחת במיקרוסקופ.לאחר מכן, הוסף תמיסת ניתוק תאים על הצלחת המצופה נוגדן PDGFR-אלפא של חולדה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. בינתיים, נער את הצלחת כדי לעקור את התאים הדבקים, ובדוק אותה במיקרוסקופ.לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -300 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את גלולת התא עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית תאים OPC. לאחר מכן, ספרו את התאים בשיטת אי הכללת הטריפן הכחול בהמוציטומטר.לאחר ספירה בהמוציטומטר, הוסף 20,000 OPCs מטוהרים במיליליטר אחד של מדיום תרבית תאי OPC לתגובת ChIP. לאחר מכן, הוסיפו 27 מיקרוליטר של 36.5% פורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. פעולה זו תתקן את התאים.לאחר 10 דקות, הוסף 50 מיקרוליטר של 2.5 גליצין מולארי על התאים הקבועים למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הוספת הגליצין תפסיק את הקישור ההדדי DNA-חלבון. לאחר מכן, שטפו את התאים הצולבים עם מיליליטר אחד של מאגר HBSS עם קוקטייל מעכב פרוטאז.לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים במכונת צנטריפוגה מקוררת מראש ב-300 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר קישור צולב של ה-OPCs המטוהרים, יש לשטוף את התאים הצולבים באמצעות תמיסת HBSS קרה כקרח, ולבצע את שאר שלבי ה-ChIP בארבע מעלות, אחרת הנוגדן לא יכול לזרז את ה-DNA הגנומי כראוי. לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של מאגר ליזה שלם לכדור התא, והשאיר על קרח למשך חמש דקות.לאחר מכן, פיפטה 75 מיקרוליטר של מאגר HBSS קר כקרח עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, גזור את הכרומטין של התא ליזאט במערכת סוניקציה מקוררת מראש עם חמישה מחזורים של 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי בתוכנית. לאחר גזירת הכרומטין, צנטריפוגה את התא ליזאט ב-14,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.בסוף הצנטריפוגה, אוספים את הסופרנטנט. לאחר מכן, יש לדלל 100 מיקרוליטר מהכרומטין הגזוז בנפח שווה של מאגר ChIP קר כקרח עם מעכב פרוטאז. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של נוגדן ארנב נגד Olig2 ל -180 מיקרוליטר של הכרומטין הגזוז המדולל.דגרו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס ב-40 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזי חלבון מצופים A שטופים מראש לצינור התגובה ChIP בחדר קר. שוב, דגרו את צינורות ה-ChIP בארבע מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות על הגלגל המסתובב.לאחר שעתיים, השאר את צינור התגובה ChIP על המדף המגנטי למשך דקה. לאחר מכן, שטפו את כדור החרוזים עם 100 מיקרוליטר של ארבעה מאגרי כביסה כל אחד למשך ארבע דקות על גלגל מסתובב בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה לגלולת החרוזים.דגרו את צינור התגובה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. לאחר שהדנ"א הדו-גדילי עובר דנטורציה, יש לזרחן את הקצה התלת-ראשוני של ה-DNA החד-גדילי על ידי הוספת פוספטאז אלקליין שרימפס. לאחר מכן, הוסף זנב פולי-T ל-DNA החד-גדילי באמצעות טרנספראז דאוקסי-נוקלאוטידיל טרנספראז.לאחר מכן, חישול פריימר ה-DNA poly-dA לתבנית ה-DNA החד-גדילית. לאחר מכן, הגדל את ספריית רצף ה-ChIP באמצעות פריימרים קדימה ואחורה לאינדקס. מספר מחזורי ה-PCR להכנת הספרייה תלוי בכמות ה-DNA ההתחלתי.הכנת ספרייה טובה דורשת כימות מדויק של כמות ה-DNA הקלט. יותר מדי או מעט מדי מחזורי PCR יכולים להשפיע על ריכוז הספרייה, כמו גם על המורכבות, מה שמוביל לחפצי PCR. השתמש בחרוזים פרמגנטיים כדי לבחור את השברים הנעים בין 250 ל-500 זוגות בסיסים מספריית רצף ה-ChIP המוגברת ב-PCR.השתמש במכשיר אלקטרופורזה של נימי שבב מיקרופלואידיים כדי לבחון את איכות ספריית רצף ה-ChIP שנבחרה. כדי להעריך את טוהר ה-OPCs האימונופניים, מבוצעים מחקרי צביעה חיסונית. בשימוש בנוגדני NG2 של סמן שושלת OPC, הוא מראה שרוב התאים האימונופניים של נוגדני PDGFR-alpha הם חיוביים ל-NG2.לאחר מכן, PCR כמותי נעשה כדי לאמת את ההעשרה של PDGFR-alpha. התרשים שהתקבל מראה ביטוי מועט של Tuj1, סמן עצבי המצביע על העשרה משמעותית של PDGFR-alpha בהשוואה לתאי המוח המנותקים. תוצאות דומות מתקבלות המראות ביטוי מועט עבור כל הסמנים האחרים, כגון GFAP, Mog ו-Mbp, מה שמעיד על העשרה של PDGFR-alpha.לאחר מכן, מנתחים את איכות ספריית רצף ה-ChIP. האלקטרופרוגרמה מייצגת שיא ברור עבור גורם השעתוק של Olig2 הנע בין 250 ל-500 זוגות בסיסים לאחר בחירת הגודל של מוצר ה-PCR של הספרייה. כאן, ההיסטוגרמה מציגה את שיבוט התג, כדי לאמת את מדדי בקרת האיכות שהתקבלו לפני שיא השיחות.הסרגל מציין שיותר מ-90% מהקריאות ממופות למיקום גנומי אחד בלבד. לאחר מכן, מתקבלת עלילת מתאם גדיל, המתארת שיא מועשר המתאים לאורך השבר השולט. בתרשים, הקווים האדומים מייצגים את אורך הקריאה ב-50 זוגות בסיסים ואת אורך השבר ב-130 זוגות בסיסים, בהתאמה, ובכך מצביעים על נתונים באיכות גבוהה.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור אתר קשירת DNA ברחבי הגנום של גורמי שעתוק וחלבונים אחרים בתאים ראשוניים או בתאים נדירים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לטהר OPCs ראשוניים ממוח העכבר על ידי אימונופאנינג וכיצד לבצע ניסוי ChIP-seq על ידי שימוש במספר נמוך של תאים.

identifying-transcription-factor-olig2-genomic-binding-sites-acutely

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

ציוץ הוא טכניקה חדשנית ומהירה למפות אתרי הקישור הגנומי של RNAs noncoding ארוכות (lncRNAs). השיטה מנצלת את הייחודיות של תחושת אנטי oligonucleotides ריצוף כדי לאפשר ספירה של lncRNA הנכנס אתרים הגנומי.

בידוד הכרומטין על ידי טיהור RNA (ציוץ)

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP), שהיא טכניקה קלאסית להדגמת אינטראקציות חלבון-דנ"א. טכניקה זו משמשת לזיהוי גני מטרה בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית בבני אדם.

בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין: טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתאים

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת המשקעים החיסוניים של הכרומטין כדי לזהות אתרי קישור חלבונים באזורים ספציפיים של הדנ"א הגנומי של תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים באמצעות משקעים חיסוניים סלקטיביים של מקטעי כרומטין הקשורים לחלבון. שיטה זו מסייעת לחקור את האינטראקציה של מספר חלבונים רגולטוריים, כולל גורמי שעתוק המעורבים בבקרת גנים.

משקעים חיסוניים של כרומטין לזיהוי אתרי קישור חלבוני מטרה בדנ"א גנומי

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) הוא הלוקמיה הנפוץ ביותר בעולם המערבי. גורמי שעתוק NFAT הן הרגולטורים חשוב של פיתוח והפעלה סוגי תאים רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול לשימוש של כרומטין immunoprecipitation (ChIP) בתאי CLL אדם לזיהוי גנים היעד הרומן של NFAT2.

כרומטין Immunoprecipitation Assay לזיהוי NFAT2 הרומן גנים היעד בלוקמיה לימפוציטית כרונית

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

תחומים עם הפרעה מהותית חשובים לתפקוד גורם שעתוק היתוך אונקוגני. כדי למקד חלבונים אלה באופן טיפולי, נדרשת הבנה מפורטת יותר של מנגנוני הרגולציה המועסקים על ידי תחומים אלה. כאן, אנו משתמשים בתעתיק כדי למפות תכונות מבניות חשובות של תחום EWS שהופרע באופן מהותי בסרקומה יואינג.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

חקור שיטת ChIP-seq בתאים מועטים לניתוח קישור גנומי רחב של Olig2 בתאי קדם-אוליגודנדרוציטים ממוח עכבר. השיטה מאפשרת חקר רגולציה תעתיקית ומנגנונים אפיגנטיים בהתמיינות תאים עצביים.

זיהוי אתרים פקטור שעתוק Olig2 מחייב גנומית בחריפות מטוהר PDGFRα + תאים על-ידי Immunoprecipitation נמוך-תא כרומטין רצף ניתוח

גלה סרטונים נוספים