הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode
15 במאי 2018
אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירומודולציה לטיפול באפילפסיה, כגון איזה אזור במוח ופרוטוקול גירוי מתאימים ביותר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפרוסות מוח של מכרסמים מייצגות מודל פשוט ומציאותי של מעגלי מוח בעוד שמערכי מיקרו-אלקטרודות מאפשרים נקודות תצפית מרובות במרחק ידוע בין אלקטרודות. להכנת ה-MEA, מורחים באופן שווה את חומר האיטום האלסטומרי על המשטח התחתון של תא ההקלטה, ומוודאים שאין בועות.
לאחר מכן, הרכיב את תא ההקלטה על ה-MEA בעזרת פינצטה, והפעל לחץ עדין. מורחים שכבת איטום סביב הגבול החיצוני של תא ההקלטה. לאחר מכן, הנח את מכלול ה-MEA/תא בסביבה סגורה ולחה, ותן לו להתרפא בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
להכנת ספסל ההקלטה, הגדר את האמבטיה החמה ל-32 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שפכו את ה- ACSF המחזיק לתאי האחיזה והחימום מראש. מבעבעים את התמיסות בתערובת של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני, ומסירים את כל הבועות הכלואות באמצעות פיפטה פסטר הפוכה.
שמור את תא האחיזה בטמפרטורת החדר, והנח את תא החימום המקדים באמבטיה החמה. הכינו פרוסות מוח אופקיות של ההיפוקמפוס-קליפת המוח על פי נהלים סטנדרטיים, ותנו להן להתאושש בתא ההחזקה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות לפחות. יוצקים 4AP ACSF לתא דגירה.
לאחר מכן, מבעבעים אותו בתערובת של 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני, ומסירים את כל הבועות הכלואות באמצעות פיפטה פסטר הפוכה. לאחר מכן, מכסים את החדר ומעבירים אותו לאמבטיה החמה. ודא שטמפרטורות ה-ACSF וה-4AP ACSF המתחממות מראש הן 30 עד 32 מעלות צלזיוס.
השתמש בפיפטה פסטר מזכוכית הפוכה כדי להעביר פרוסת מוח אחת לתוך תא החימום המקדים, ותן לרקמה לנוח במשך 25 עד 30 דקות. לאחר מכן, העבירו את פרוסת המוח לתא הדגירה 4AP ACSF, ותנו לה לנוח במשך 60 דקות. תן ל-4AP ACSF לזרום דרך צינור הזלוף לתוך עד שאין אוויר בפנים.
לאחר מכן, הפסק את זרימת הפתרון. הנח את שבב ה-MEA היבש בתוך ה-MEA ampחיים יותר, ואבטח את ראש המגבר. לאחר מכן, השתמש בפיפטה פסטר מפלסטיק כדי להעביר 4AP ACSF למאגר הכניסה והיציאה של תא ההקלטה.
אבטח את צינורית החימום למחזיק מגנטי, והנח את קצהו בתוך יציאת כניסת תא ההקלטה. לאחר מכן, חבר את המחזיק המגנטי לרצועה מגנטית על ראש המגבר MEA. חבר את צינור הזלוף לצינורית ואת הצינורית לתרמוסטט.
לאחר מכן, הנח את מחט היניקה במאגר היציאה. ודא שיש לחץ שלילי על ידי טבילת מחט היניקה לתוך ה-ACSF, ובדוק אם יש רעש יניקה קבוע בתדר נמוך. לאחר מכן, הגדר את ווסת הזרימה כך שיאפשר קצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה, והתחל לפענח.
ברגע שה-4AP ACSF זורם דרך הצינורית, הפעל את התרמוסטט. הגדר את צינורית החימום ל-37 מעלות צלזיוס ואת בסיס ה-MEA ל-32 מעלות צלזיוס כדי להשיג טמפרטורה של 32 עד 34 מעלות צלזיוס בתוך תא ההקלטה. לאחר מכן, הנח את אלקטרודת הייחוס החיצונית במאגר כניסת תא ההקלטה.
לאחר שרמת 4AP ACSF וטמפרטורת ההקלטה מתייצבים כרצונך, סובב את הזלוף ואת פקקי היניקה למצב כבוי כדי לעצור אותם באופן זמני. העבר במהירות פרוסת מוח אחת לתא ההקלטה של MEA באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית הפוכה. התאם את מיקומו באזור ההקלטה של המזרח התיכון ואפריקה לפי הצורך באמצעות פיפטת פסטר מלוטשת ומסולסלת או מברשת רכה, קומפקטית וקטנה.
הנח את עוגן ההחזקה על פרוסת המוח. הפעל מחדש את הזלוף והיניקה על ידי סיבוב פקקי העצירה שלהם בחזרה למצב מופעל. צלמו תמונה של פרוסת המוח באמצעות מצלמה המותקנת על במת מיקרוסקופ הפוכה.
לאחר מכן, הפעל את הסקריפט mapMEA בתוכנת המחשב כדי להפעיל את ממשק המשתמש הגרפי כדי למפות את האלקטרודות. לחצו על כפתור העיון כדי לטעון את התמונה של פרוסת המוח. ודא שאלקטרודת הייחוס מופיעה בעמודה העליונה של חצי הצד השמאלי של ה-MEA.
לאחר מכן, לחץ על הלחצן Activate Pointer. בחר את האלקטרודות העליונות והתחתונות בעמודה השמאלית ביותר של המערך כדי לסמן את קואורדינטות ה-XY ליישור תמונה ומיפוי אלקטרודות. מהתפריט הנפתח סוג פרוסה, בחר אופקי.
סמן את תיבת הסימון מבני ברירת מחדל. באמצעות הכפתורים הממוספרים מתחת לתמונת פרוסת המוח, בחרו את האלקטרודות שמתאימות להחזר ההשקעה, ולחצו על הכפתורים המתאימים בלוח המבנה כדי להקצות אותן. חזור על שלב זה עבור כל החזר על ההשקעה.
לאחר מכן, לחץ על כפתור שמור. התוכנה תיצור תיקיית תוצאות המכילה טבלה המדווחת על האלקטרודות והחזר ה-ROI שנבחרו. למחקר אלקטרופיזיולוגיה, הפעל את יחידת הגירוי לפחות 10 דקות לפני פרוטוקול הגירוי כדי לאפשר כיול וייצוב עצמי.
לאחר מכן, הפעל את תוכנת בקרת הגירוי, וודא שהסטימולטור ומגבר MEA מחוברים כהלכה, כפי שמצוין על ידי נורית ירוקה בפאנל הראשי של תוכנת בקרת הגירוי. הגדר את הגירוי בתצורה דו קוטבית. חבר את יחידת הגירוי לקרקע.
לאחר מכן, חבר את זוגות האלקטרודות במגע עם שכבת התאים הפירמידלית של ה-CA1/subiculum הפרוקסימלי בין אלה הממופים עם ה-script mapMEA. כדי להשיג נתונים, לחץ על כפתור ההפעלה בלוח הראשי של תוכנת ההקלטה. רשום לפחות ארבע הפרשות איקטליות.
לאחר מכן, הפעל בדיקת קלט/פלט מהירה כדי לזהות את עוצמת הגירוי הטובה ביותר. לשם כך, השתמש בפאנל הראשי כדי לתכנן דופק זרם חיובי-שלילי דו-פאזי מרובע עם משך של 100 מיקרו-שניות לשלב. בלשונית משרעת הדופק, הזן משרעת דופק ראשונית של 100 מיקרו-אמפר לשלב.
הגדר את דופק הגירוי ל-0.2 הרץ או נמוך יותר על ידי הוספת מרווח בין פולסים של חמש שניות או יותר. הגדל את משרעת הגירוי ב-50 עד 100 צעדים של מיקרו-אמפר בכל ניסוי עד שהגירוי יכול לעורר באופן אמין אירועים דמויי אינטריקטל בקליפת המוח הפרה-היפוקמפוסית. לאפנון חשמלי של איקטוגנזה לימבית, תכנת את יחידת הגירוי לספק את פרוטוקול הגירוי המעניין, והשתמש במשרעת הגירוי שזוהתה במהלך בדיקת הקלט/פלט.
לאחר הפסקת הגירוי, ודא את התאוששות הרשת למצב שלפני הגירוי על ידי רישום לפחות ארבע פריקות איקטליות. איור זה מציג את ההקלטות של פעילות ictal הנגרמת על ידי 4AP בקליפת המוח האנטורינלית ובקליפת המוח הפרירינלית במהלך מצב הבקרה, קצב תקופתי בהרץ אחד, ובמהלך ההתאוששות עם נסיגת הגירוי. גרף זה מציג את כימות ההשפעה של קצב תקופתי בהרץ אחד, מה שמצביע על הפחתה משמעותית של זמן ההצמדה הכולל במהלך הגירוי.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למקם במהירות ובצורה נכונה את פרוסת המוח על ה-MEA. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מניפולציה פרמקולוגית על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי תרומתם של נוירוטרנסמיטורים או תעלת יונים לפעילות אפילפטית ולהשפעה של נוירומודולציה.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור אינטראקציה של רשתות עצביות בבריאות וחולי בנוירון מתורבת כמו גם בפרוסות מוח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לתעד ולווסת חשמלית את הפעילות האפילפטית הנגרמת על ידי ארבעה אמינופירידינים בפרוסות מוח של מכרסמים בשילוב עם MEAs.
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה להקלטה ולמודולציה חשמלית של פעילות אפילפטופורמית המושרה על ידי 4-aminopyridine בפתחים של מוח מכרסמים, באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs). המערך הניסיוני מאפשר חיוניות ממושכת של הרקמה ומשתמש בממשק משתמש גרפי מותאם אישית למיפוי אלקטרודות ובחירת זוגות גירוי בזמן אמת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- מדעי המוח
- מחקר אפילפסיה
רקע
- שיטה זו עונה על שאלות קריטיות בני modulates-נוירומודולציה לטיפול באפילפסיה.
- פרוסות מוח של מכרסמים משמשות כמודל מפושט של מעגלי מוח.
- מערכי מיקרו-אלקטרודות מאפשרים תצפיות מרובות במרחקים ידועים בין האלקטרודות.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של פרוטוקולי גירוי לטיפול באפילפסיה.
- להערכת ההשפעות של מודולציה חשמלית על פעילות אפילפטופורמית.
- לספק מתודולוגיות מפורטות להקמה של ה-MEA ולהכנת פרוסות מוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה העיקרית היא שימוש בפתחים של מוח מכרסמים ex vivo ובמערכי מיקרו-אלקטרודות.
- פתחים של מוח מההיפוקמפוס והקליפה (Hippocampus-cortex) מוכנים ומודגנים עם 4-aminopyridine (4AP) כדי להשרות פעילות אפילפטופורמית.
- שלבים מתודולוגיים מרכזיים כוללים את התאוששות פתחי המוח, תנאי ההדגנה ובקרה מדויקת של הטמפרטורה במהלך הניסוי.
- ממשק המשתמש הגרפי המותאם מסייע במיפוי אלקטרודות ובהגדרות גירוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת ביצוע יעיל של הקלטה של פריקות איקטליות (ictal discharges) ואירועים דמויי אינטר-איקטליים באמצעות פרוטוקולים מתוכננים של גרייה דו-קוטבית.
- מיפוי אלקטרודות מוביל לבחירה אופטימלית של אזורי עניין (ROIs) עבור הגרייה.
- הממצאים ישביאו את ההבנה של מודולציה של מעגלי מוח הרלוונטית לאפילפסיה.
מסקנות
- מחקר זה מדגים שיטה יעילה לבחינת המודולציה של פעילות אפילפטופורמית המושרה על ידי 4AP.
- הממצאים תומכים ביישומים לפיתוח אסטרטגיות לטיפול באפילפסיה ובשיפור הבנתנו את הדינמיקה של מעגלים עצביים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת הערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות נוירומודולציה עבור אפילפסיה, על ידי אספקת מודל יציב וארוך טווח של פעילות אפילפטופורמית בpch פרוסות מוח של מכרסמים. היא תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטי של פרוטוקולי גרייה לפני בדיקה in vivo. הפלטפורמה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי אזורי מוח אופטימליים ופרמטרי גרייה לפיתוח DBS.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד של פעילות רשת אפילפטופורמית באזורי מוח מוגדרים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מודולציה חשמלית מתמשכת ומעקב אחר תגובת הרשת.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי פרוטוקולי גרייה המווסתים אירועים איקטליים באופן מהימן.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מייצר דפוסים אפילפטופורמיים יציבים וניתנים לשחזור הנמשכים מספר שעות, לצורך סריקה עקבית של תרכובות או גירויים.
- פלט כמותי: מאפשר מדידה של תדירות ומשך הפריקה האיקטלית כמדדי תגובה פרמקודינמית.
- סקילביליות: תואם למערכי רב-אלקטרודות לבדיקה מקבילה של תצורות גירוי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מודלים של פנוטיפים של אפילפסיה באונה הרקתית באמצעות פעילות המושרה על ידי 4AP בחתכים של ההיפוקמפוס והקורטקס.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי בדיקת השפעות נוירומודולציה על התאוששות הרשת.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקריטריוני go/no-go בהתבסס על הפחתה של אירועים דמויי פרכוסים המושרית על ידי גירוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לסריקה פרה-קלינית של נוירומודולציה, ובכך מאפשרת שיפור איטרטיבי של אסטרטגיות הגירוי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנוני רשת העומדים בבסיס התפשטות ומודולציה של פעילות אפילפטופורמית.
- סריקה: מספק תוצאות אלקטרופיזיולוגיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת פרמטרי סטימולציה תחת תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספק מדדים כמותיים, כגון משך ההתקף ומרווחים בין אירועים, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין תגובות רשת ברמת הפרוסה לתוצאות קליניות פוטנציאליות של DBS באמצעות מדדי התאוששות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר לבדיקת גישות נוירומודולציה מרובות במודל אפילפטופורמי סטנדרטי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי הפיכרה של תצפית ממושכת ויציבה על רשתות אפילפטיפורמיות תחת גרייה מבוקרת.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרפוזיה למינרית, בקרת טמפרטורה ומיפוי אלקטרודות בזמן אמת באמצעות GUI.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי הפחתת שיעורי כישלון בשלבים מאוחרים של פיתוח נוירומודולציה, הודות להבנה מכניסטית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום של פרוטוקולי גרייה מותאם-סיכון, המבוסס על דיכוי שחזורי של אירועים איקטליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, הכנת פרוסות מוח וטיפול ב-MEA.
- תלוי במערכות פרפוזיה, בבקרה על הטמפרטורה וביחידות בידוד גירויים להשגת הקלטות יציבות.
- מחייב סטנדרטיזציה של אוריינטציית הפרוסות, זמני הדגירה ופרוטוקולי הגירוי בין המשתמשים השונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים דורשת תיקוף של השראת פעילות אפילפטוגנית ודיוק במיפוי האלקטרודות.
- מגבלות מעשיות כוללות ניוון של האות בקצבי פרפוזיה נמוכים וסחף תרמי במהלך ניסויים ממושכים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Preparation of the MEA/Custom Chamber Assembly
1:15
Preparation of the Recording Bench
2:52
Preparation of the MEA Set-up
4:39
MEA Live Mapping
6:33
Recording and Electrical Modulation of the Epileptiform Activity
8:49
Results: Representative Experiment of Electrical Modulation of Ictogenesis Using Brain Slices Coupled to MEAs
9:21
Conclusion
