פרוטוקול שלפוחית היניקה לימודים אדם T-cell האחזור תגובות In Vivo

המטרה הכוללת של סרטון זה היא להדגים את שיטת ההיזכרות העורית של שלפוחית היניקה המאפשרת לנו לקצור תאי T וציטוקינים ספציפיים לאנטיגן המייצגים את התגובה החיסונית הנרכשת in vivo. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור תגובות תאיות וחסינות נרכשת בבני אדם. היתרון העיקרי של טכנולוגיה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לקצור תאי T ספציפיים לאנטיגן ישירות מאתר התגובה החיסונית בשיטה לא פולשנית ובטוחה יחסית.

העיקרון הבסיסי של היזכרות עורית הוא הפקדת אנטיגן בשכבת העור של העור. אצל אנשים עם זיכרון חיסוני קיים של האנטיגן, תאי T ינדדו לאתר התגובה ויגרמו לתגובה חיסונית מקומית שבה תאי T ספציפיים מורחבים ומתמיינים באופן משובט באתרם. אינדוקציה של שלפוחיות יניקה על תגובה זו מאפשרת לנו לקצור את תאי ה- T הספציפיים הללו כמו גם את הציטוקינים המיוצרים in vivo.

בהדגמת וידאו זו, אנו משתמשים ב-PPD כאנטיגן הזיכרון שלנו. PPD משמש בדרך כלל לאבחון זיהום מיקובקטריום טוברקולוזיס. אבל, זה גם גורם לתגובות עור אצל אנשים שחוסנו בעבר בחיסון BCG, כפי שתראו בסרטון זה.

החומרים לבדיקת העור של טוברקולין כוללים ספוגיות אלכוהול, מזרק מיליליטר אחד עם מחט קצרה בגודל 27 עד 30, ותמיסה של PPD שאושרה לשימוש בבני אדם. השתמש בתמיסת PPD של 20 יחידות טוברקולין למיליליטר. יש לחטא את הבקבוקון באמצעות ספוגית אלכוהול.

ושימו לב שההרכב עשוי להשתנות בין היצרנים. לאחר מכן אתר את מקום ההזרקה בצד הגחון של האמה של המתנדב וחטא את האזור באמצעות ספוגית אלכוהול. השתמש במזרק סטרילי של מיליליטר אחד עם מחט קבועה בגודל 29, 12 מילימטר.

מערבבים בעדינות ושואפים 0.1 מיליליטר מתמיסת ה- PPD. וודא שאין בועות גלויות. לחץ על העור וכוון את המחט בזווית של חמש עד חמש עשרה מעלות כשהשיפוע פונה כלפי מעלה.

הכנס את קצה המחט לשכבת העור וודא שהקצה כמעט גלוי דרך האפידרמיס. יש להזריק לאט תמיסת PPD של 0.1 מיליליטר. אם מנוהל נכון, תופיע מיד פפולה של שישה עד עשרה מילימטרים.

הפפולה נעלמת לאחר כעשר דקות. תצהירים מרובים של PPD אפשריים, אך עשויים לדרוש אישור אתי נוסף. אם ניתנות שתי זריקות, שאפו להפרדה מקסימלית תוך שמירה על מרחק טוב מאזור המרפק ושורש כף היד.

תגובת העור הקלינית מופיעה במהלך 24 השעות הראשונות ומלווה בתחושת גירוד. מדוד את גודל תגובת העור 48 עד 72 שעות לאחר ההזרקה. כאשר מעריכים את התגובה, חשוב למדוד את המשך הזמן ולא את האריתמה.

משש את נפיחות הכובע בעזרת האצבע. לאחר מכן סמנו את שולי העיכוב בעזרת עט כדורי. לבסוף, השתמש בסרגל רך כדי למדוד את קוטר העיכוב ושים לב לתוצאות במילימטרים.

לאחר שבעה ימים, הגיע הזמן לגרום לשלפוחית היניקה. לאינדוקציה של שלפוחית היניקה של העור, השתמש במשאבת ואקום עם תא יניקה מחובר. השתמש במכשיר זמין מסחרית או במכשיר מותאם אישית.

חשוב לציין, המשאבה צריכה להיות מתכווננת בטווח של מינוס 20 עד מינוס 40 קילופסקל ולספק לחץ שלילי יציב ואמין. החלק התחתון של תא היניקה מורכב מפלטה עם חור קטן שנמצא במגע עם העור. לצלחות עשויים להיות חורים בודדים או מרובים וניתן ליישם גדלים שונים על מנת להתאים לתגובת העור.

החלק העליון של החדר אמור לאפשר ניטור חזותי של השלפוחית. לפני האינדוקציה, יש לחטא את העור ואת צלחת החדר. ודא שהזרוע נחה בנוחות.

חבר ואבטח את החדר, כאן באמצעות רצועות מתכווננות. מרכז תגובת העור צריך להיות גלוי דרך חור הצלחת התחתונה. הפעל את מכשיר היניקה והתאם את הלחץ השלילי למינוס 20 קילופסקל.

לאחר שלושים דקות יש להגביר את הלחץ למינוס 25 קילופסקל. לאחר 60 דקות, הגדל עוד יותר את הלחץ למינוס 30 קילופסקל. ושמור על הלחץ כאן עד שנוצרת שלפוחית אחת במלואה.

שלב השראת השלפוחית אורך בדרך כלל כשעה עד שלוש שעות. כאשר היווצרות השלפוחית בפועל מתרחשת בהדרגה במהלך 30 הדקות האחרונות, כפי שמודגם כאן במהירות גבוהה. אם יש סימנים של קרע שלפוחית או דימום, מומלץ לשחרר לאט את הלחץ ולהפסיק את האינדוקציה מוקדם.

שלפוחיות עשויות להופיע כשלפוחיות מיזוג בודדות או מרובות. התהליך קשור לעתים קרובות לתחושת גירוד. לאחר היווצרות השלפוחית במלואה, שחרר את הלחץ והסר בזהירות את תא היניקה.

בשלפוחיות המושרות כהלכה, שכבת האפידרמיס מופרדת במלואה משכבת העור של העור, ומשאירה חלל מלא בנוזל. הגן על השלפוחית על ידי מריחת תחבושת רכה על אזור העור שמסביב והנחת מכסה קשיח על השלפוחית, כאן מצינור פלסטיק של 15 מיליליטר. אבטח את הפקק על ידי סרט לא אלרגני ואחריו תחבושת רכה ונמתחת.

הנחו את המתנדב לשמור על חבישת המגן למשך הלילה. למחרת, הסר בזהירות את התחבושת וחטא את אזור השלפוחית באמצעות תרסיס. השתמש במזרק סטרילי של 2 מיליליטר עם מחט בגודל 23 כדי לקצור את תכולת השלפוחית.

הכנס את המחט לצד הצדדי העליון של גג השלפוחית ושאף לאט את הנוזל. הימנע מלגעת ברצפת החלל, אך הקפד לקצור את כל הנוזלים מכיוון שנפח השלפוחית עשוי להיות נמוך, כמו בדוגמה זו. השלפוחית שקרסה, תתרפא ללא צלקות.

הוסף תחבושת מגן מעל השלפוחית. לאחר מכן העבירו את נוזל השלפוחית לצינור סטרילי. סובב במשך ארבע דקות בחום של 600 גרם באמצעות צנטריפוגה שולחנית.

לאחר מכן, קצרו את הסופרנטנט ותלו מחדש את כדור התא ב-500 מיקרוליטר של מדיום תא. התאים הטריים מוכנים כעת לספירה ולניתוח נוסף. ניתן להשתמש בתאי שלפוחית יניקה לניתוח מבחנה, כגון ציטומטריית זרימה.

בניסוי זה עם מתנדבים שחוסנו ב-BCG, תפוקת התאים נעה בין 15,000 ליותר מ-200,000 תאים לשלפוחית. כאן, בודדנו תאים משלפוחית יניקה בודדת וגירינו את התאים עם PPD במבחנה ואחריו ציטומטריית צביעה וזרימה. לשם השוואה, עשינו ניתוח מקביל על PBMCs מאותו מתנדב מחוסן PCG.

בפאנלים, אתה רואה אוכלוסיות של תאי T חיוביים CD4 צבועים לייצור בין-תאי של TNF-אלפא, אינטרפרון-גמא ו-IL2. אצל מתנדב זה, למעלה מ-30% מתאי ה-T החיוביים ל-CD4 שבודדו מהעור היו ספציפיים לאנטיגן. ב-PBMCs, חלק זה היה פחות מ-1%יתר על כן, פרופילי הציטוקינים הבודדים של תאי שלפוחית ייצגו הן את תאי הזיכרון המרכזיים והן את תאי ה-T האפקטיביים, מה שממחיש כיצד שיטה זו מאפשרת לנו לחקור תגובות זיכרון ארוכות טווח שנוצרו in vivo.

כאן, איור A ממחיש שניתן לנתח נוזל המתקבל משלפוחיות יניקה עבור ציטוקינים המיוצרים in vivo. באיור B, גידלנו תאים שהתקבלו משלפוחיות יניקה במשך ארבעה ימים בנוכחות מיקובקטריום טוברקולוזיס, מה שממחיש כיצד תאי שלפוחית יניקה מסוגלים לייצר אינטרפרון-גמא ו-TNF alpha ex vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לגרום ולקצור תאים משלפוחיות יניקה לאחר שקיעת אנטיגן עורית.

בהדגמה זו השתמשנו באנטיגן בעל רלוונטיות מיוחדת בתחום חקר השחפת. אבל, העקרונות הבסיסיים של מתודולוגיה זו יכולים להיות שימושיים בתחומי החסינות הנרכשת, או בניסויים החוקרים סוכני מיקוד של תאי T. כמו כן, אנא זכרו שאתיקה ובטיחות הם בראש סדר העדיפויות בעבודה עם מתנדבים אנושיים.

זכור גם שעבודה עם דגימות אנושיות עלולה להיות מסוכנת וכי יש להקפיד תמיד על אמצעי זהירות במעבדה.