לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לאפיין שלושה מדורים של מיקרוביום השורש, האדמה, הריזוספרה והאנדוספרה של השורש, באמצעות פרופיל קהילתי של גן ה-RNA הריבוזומלי 16S. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח באקולוגיה מיקרוביאלית, כגון הגורמים הביוטיים והאביוטיים שהם המניעים המשמעותיים של מבנה המיקרוביום. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מתקננת כל שלב, החל מהפרדת השורש והריזוספרה ועד חילוץ ה-DNA ועד הכנת ספריית ריצוף.

מי שידגים את ההליך הזה יהיה טיוזדיי סימונס, סטודנט לתואר שני במעבדת קולמן-דר. כדי להתחיל בפרוטוקול, אסוף דגימות אדמה בתפזורת עם אספן ליבת אדמה מעוקר באתנול כדי להשיג אדמה נקייה משורשי צמחים. אוספים ליבה כ -23 עד 30 סנטימטרים מבסיס הצמח.

לאחר מכן, העבירו את האדמה לשקית ניילון, הפכו את האדמה להומוגניזציה על ידי ניעור עדין של השקית, העבירו כמות של 600 מיליגרם מדגימת האדמה לתוך צינור אחד של שני מיליליטר, והניחו מיד את הצינור של שני מיליליטר על קרח יבש עד למיצוי ה-DNA. כדי לאסוף את השורש והריזוספרה, השתמש באת מעוקרת באתנול כדי לחפור את הצמח, תוך הקפדה להשיג כמה שיותר מהשורש. מנערים בעדינות את עודפי האדמה מהשורשים עד שיש כשני מילימטרים של אדמה הנצמדת למשטח השורש.

עבור צמחים גדולים, השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך תת-חתך מייצג של שורשים, ולהניח מינימום של 500 מיליגרם של רקמת שורש לבקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר. הוסף מספיק מאגר להסרת אפיפיטים כדי לכסות את השורשים, ולאחר מכן הנח מיד את הדגימה על קרח יבש. כדי להפריד את הריזוספרה מהשורשים, הפשירו את דגימת השורש על קרח, ולאחר מכן עשו סוניקציה של דגימות השורש.

העבירו את השורשים לצינור צונן ונקי של 50 מיליליטר בעזרת מלקחיים סטריליים. אין להשליך את הצינור המקורי עם חיץ ואדמה. זה מכיל את שבר הריזוספרה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את הצינור המכיל את המאגר והריזוספרה. שפכו את הסופרנטנט, והניחו את שבר הריזוספרה בקרח יבש. כדי לשטוף את השורשים, הוסיפו לשבר השורש כ -20 מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס מים סטריליים.

שוטפים את השורש על ידי ניעור נמרץ במשך 15 עד 30 שניות, ואז מסננים את המים. השתמש במרית סטרילית כדי להעביר במהירות 250 מיליגרם של אדמה וריזוספרה לצינורות איסוף נפרדים המסופקים בערכת בידוד DNA מסחרית להפקת אדמה, ולאחר מכן המשך באמצעות פרוטוקול ספק הערכה. לאחר הפליטה, אחסן את ה-DNA במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שמוכן להמשיך להכנת ספריית האמפליקון, ולאחר מכן חלץ DNA מדגימות השורש.

מצננים מרגמה ועלי מעוקרים בעזרת חנקן נוזלי. מדדו 600 עד 700 מיליגרם של רקמת שורש, והניחו את הרקמה לתוך המרגמה והוסיפו בזהירות מספיק חנקן נוזלי כדי לכסות את השורשים. טוחנים את השורשים לחתיכות קטנות.

המשך בתהליך הוספת חנקן נוזלי וטחינה לפחות פעמיים, תוך שמירה על עקביות בין הדגימות, עד שהשורשים הופכים לאבקה דקה. במהירות, לפני שאבקת השורש מתחילה להפשיר, השתמש במרית סטרילית כדי להעביר את אבקת השורש לצינורות של 1.5 מיליליטר שקולים מראש על קרח. רשום את משקל הצינור והאבקה.

השתמש במרית סטרילית כדי להעביר במהירות 150 מיליגרם של אבקת שורש לצינור האיסוף המסופק בערכת בידוד ה-DNA המסחרית המיועדת למיצוי מהאדמה, ולאחר מכן המשך בבידוד DNA באמצעות פרוטוקול ספק הערכה. הכן תערובת מאסטר PCR מספקת כדי להגביר כל דגימת DNA בשלוש עותקים. יוצקים את תערובת המאסטר למאגר פיפטה רב-ערוצי סטרילי בנפח 25 מיליליטר, ומחלקים 66 מיקרוליטר של תערובת מאסטר לכל באר של צלחת PCR חדשה של 96 בארות.

לאחר מכן, הוסף שישה מיקרוליטרים של חמישה ננוגרם למיקרוליטר DNA מלוח ה-DNA המנורמל לצלחת התערובת הראשית. לאחר מכן, הוסף לצלחת המאסטר 1.5 מיקרוליטר של פריימר קדימה של 10 מיקרומולרי, כך שלכל עמודה יש ברקוד קדימה שונה, ו-1.5 מיקרוליטר של פריימר הפוך של 10 מיקרומולרי, כך שלכל שורה יש ברקוד הפוך שונה. מכסים את הצלחת בסרט, וסובבים את הצלחת לזמן קצר ב-3,000 RCF.

השתמש בפיפטה רב ערוצית כדי לערבב בעדינות את התוכן, ואז לחלק אותם לשלוש צלחות עם 25 מיקרוליטר של תערובת תגובה, ולכסות את הצלחות בסרט PCR. הגבירו את ה-DNA בכל צלחת באמצעות מחזור-תרמי. לאחר ההגברה, אגד את שלושת לוחות השכפול לצלחת אחת של 96 בארות.

באמצעות גיליון אלקטרוני ממוחשב, חשב את הנפח של 100 ננוגרם של כל דגימה, כמו גם את הנפח הממוצע עבור כל הדגימות. עבור כל מוצר PCR ריק, הוסף את הנפח הממוצע המחושב לצינור יחיד של 1.5 מיליליטר. עבור הדגימות המוגברות בהצלחה, אסוף 100 ננוגרם מכל דגימה לאותו צינור, ולאחר מכן מדוד את ריכוז המוצר המאוגד באמצעות פלואורומטר שולחני, והוציא 600 ננוגרם של DNA במים בדרגה מולקולרית לנפח סופי של 100 מיקרוליטר בשפופרת של 1.5 מיליליטר.

אחסן את המוצר הנותר בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. לפני טיהור ה-DNA של 600 ננוגרם, הכינו 600 מיקרוליטר של אתנול טרי של 70%. עקוב אחר תהליך טיהור ה-PCR שנקבע באמצעות חרוזים פרמגנטיים.

נענע את צינור החרוזים המגנטיים כדי להשעות מחדש את החרוזים שמתיישבים לתחתית. הוסף נפח 1x, 100 מיקרוליטר של תמיסת חרוזים לכמות של 600 ננוגרם של DNA. מערבבים היטב את התמיסה והחרוזים על ידי פיפטינג 10 פעמים.

לאחר ערבוב יסודי, דגרו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הנח את הצינור על המעמד המגנטי למשך שתי דקות או עד שהתמיסה פנויה כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. שמור את הצינור במעמד, שאב את הסופרנטנט השקוף בזהירות מבלי לגעת בחרוזים המגנטיים, והשליך אותו.

השאירו את הצינור במעמד, הוסיפו 300 מיקרוליטר של אתנול 70% לצינור, ודגרו את החרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. שאפו החוצה את האתנול והשליכו אותו. חזור על תהליך זה והסר את כל האתנול לאחר הכביסה השנייה.

הסר את הצינור מהמעמד המגנטי וייבש את התכולה באוויר למשך חמש דקות. מוסיפים 30 מיקרוליטר מים בדרגה מולקולרית לחרוזים המיובשים, ומערבבים על ידי פיפטינג 10 פעמים. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.

החזר את הצינור למעמד המגנטי למשך דקה אחת כדי להפריד את החרוזים מהתמיסה. מעבירים את האלואט לצינור חדש. מדוד את הריכוז הסופי של ה-DNA הנקי והמאוגד באמצעות פלואורומטר שולחני.

לדלל אליקוט ל-10 ננו-מולרי בנפח סופי של 30 מיקרוליטר או לריכוז ולנפח המועדף על ידי מתקן הריצוף. לאחר שלב ההגברה, בוצע ריצוף כדי לקבוע את הרכב קהילת החיידקים של כל דגימה. יישור של רצף ה-PNA לכל גן RNA ריבוזומלי כלורופלסט ומיטוכונדריאלי 16S עבור הצמח המארח שנחקר לא אמור לחשוף אי התאמות.

אי התאמה בודדת לרצף ה-PNA של 13 זוגות הבסיסים יכולה להפחית באופן דרסטי את היעילות, כמו במקרה של רצף ה-PNA של הכלורופלסט המסופק וגן ה-RNA הריבוזומלי של כלורופלסט 16S של Lactuca sativa, או חסה. מכיוון שכמות שווה של DNA מוגבר נאספה לכל דגימה, מספר זוגי של קריאות, התואמות לטקסוני חיידקים, התקבל לכל דגימה לאחר ריצוף, ממוינות על סמך האינדקס הברקוד שלהן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו עבור שמונה צמחים תוך כשמונה שעות.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב להיות עקבי בין הניסויים. פרטים קטנים כמו שינויים בשיטת מיצוי ה-DNA ותערובת מאסטר PCR יכולים להציג הטיה. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מטא-טרנסקריפטומיקה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו מיקרובים פעילים, ואילו גנים הם מבטאים?

אל תשכח שעבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים בעת ביצוע הליך זה.