Name: מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למדו לנטר הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה בזמן אמת ב-C2C12 Myotubes באמצעות מדידות ספקטרופוטומטריות. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תחבורה אלקטרונים ואיזון אוקסידורדוקטיבי תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות תומס בל, לין Mattathil, מארק Mannino, Neej פאטל לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור של ארצות הברית פרס R15DK102122 במכון הלאומי של סוכרת, העיכול, מחלות כליה (NIDDK) ג'ונתן פישר. תוכן כתב היד הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את נופי הרשמי של NIDDK או מכוני הבריאות הלאומיים.

הערה: ראה איור 1 סקירה סכמטי של השלבים החשובים.
1. WST-1 צמצום Assay
<ol><li>לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד באמצעות תא סטנדרטי לתרבות הליכים7 בצלחת 96-ובכן ניצול שורות A-F.<ol>
<li>השתמש מדיום בידול בהיקף בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) בתוספת 2% הסוס סרום, פניצילין U/mL 100 ו- 0.1 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
		<li>בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, תוספת בידול מדיה בחומצה אסקורבית 100 מיקרומטר. לאפשר לתאים דגירה בתקשורת בידול עבור ~ 24-48 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מלאי פתרונות WST-1 ו- PMS.<ol>
<li>כדי להפוך את מלאי 10 מ מ של WST-1, להמיס 0.033 גר' WST-1 (הנוסחה משקל (FW): g 651.34/mol) ב 5 מ של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). חנות ב 4 º C.</li>
		<li>כדי להפוך את מלאי 5 מ מ של PMS, להמיס 0.0023 גר' PMS (FW: g 306.34/mol) ב- 1.5 מ"ל של יונים H2O (לשכפל2O). לאחסן ב-20 ° C, להגן מפני אור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 0.0108 גר' גלוקוזה עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ ל 11.4 של PBS או HEPES buffered תמיסת מלח (HBS; 20 מ מ HEPES נתרן מלח, 140 מ מ NaCl, 5 מ מ אשלגן כלורי, 2.5 מ מ MgSO4, 1 מ"מ CaCl2). הוסף µL 480 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- 48 µL של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.</li>
	<li>בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.</li>
	<li>בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם PBS. האחות התקשורת ולהוסיף 150 µL PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב. הערה: הבדיקה מתבצעת באמצעות תאים מצופים, מצורף. לפיכך, אין שום צנטריפוגה או השימוש של טריפסין בתהליך הכביסה.</li>
	<li>להוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL של פתרון WST-1 (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).</li>
	<li>למדוד את הערכים ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטרים את כל 10 דקות לשעה-438 ננומטר.</li>
	<li>אחרי הקריאה, תשאף בתקשורת ושוטפים כל טוב עם µL 150 ל- PBS. ואז מחוק לגמרי מגניב.</li>
	<li>לחשב את השינוי שחל ספיגת במשך כל על-ידי חיסור את ספיגת הראשוני עבור באר מ ספיגת בכל נקודת זמן על כך. תקן שינוי זה עבור שינוי ספיגת (אם בכלל) שנצפתה הבארות רקע (קרי, וולס עם פתרון assay אך לא תאים).</li>
	<li>לניתוח, לנרמל את הנתונים ספיגת למדידה שליטה 60 דקות או לשטוף וולס עם PBS או HBS ולאחר מכן לבצע bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון וזמינותו.</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA) תקן (נע בין 0.5-2 µL על העקומה רגיל, תלוי בדרגת זרימה של התאים) לבארות ריקות (שורות G ו- H), לאחר מכן להוסיף הכימית BCA כל בארות.</li>
	<li>לכמת את הנתונים באמצעות nmol של הפחתת WST-1 לכל µg של חלבון. שימוש 37 מ מ-1 ס מ-1 22 המקדם הכחדה עבור מופחתת WST-1-438 ננומטר.</li>
</ol>2. DPIP הפחתת Assay
<ol><li>לגדול, להבדיל C2C12 תאים חסיד עם ההליך אותו כשלב 1.1.</li>
	<li>להכין מלאי 10 מ מ DPIP פתרון כדלקמן. להמיס 0.029 גר' DPIP (FW: g 290.08/mol) ב- 10 מ"ל של לשכפל2O. אשר הריכוז של DPIP על ידי מדידת ספיגת על 600 nm עם ספקטרופוטומטרים. שימוש 1 מ-1 ס מ-1 23 המקדם הכחדה עבור DPIP מופחת ב 600 ננומטר. חנות ב 4 º C.</li>
	<li>להוסיף 0.0108 גר' גלוקוז 11.880 מ של PBS עבור ריכוז הסופי של 5 מ מ. להוסיף 120 µL 10 מ מ DPIP עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר.</li>
	<li>בעת פיקוח על ascorbate מעורבות tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. Aliquot אחד, להוסיף 6 µL של לשכפל2O ולחצו aliquot אחרים להוסיף 6 µL של 2 kU/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL.</li>
	<li>בעת פיקוח על מעורבות סופראוקסיד tPMET, לחלק את הפתרון aliquots 6 מ ל שני. כדי aliquot אחד, להוסיף µL 55 0.1 M KPO4 מאגר ולהוסיף את aliquot אחרים µL 55 של 6.5 kU/mL SOD עבור ריכוז סופי של 60 U/mL.</li>
	<li>האחות התקשורת ולשטוף בתאים µL 150 ל- PBS. האחות של PBS ולהוסיף µL 100 DPIP פתרון (-) השתילות או (-) אאו לעמודות 1-6 ולהוסיף 100 µL DPIP פתרון (+) השתילות או (+) או על עמודות 7-12 בצלחת 96-ובכן. השתמש שורות G ו- H וויל כפקדי רקע (קרי, לעקוב אחר שינוי בספיגת ב הכימית לבד בבארות ללא תאים).</li>
	<li>למדוד את ספיגת ב 600 nm באמצעות ספקטרופוטומטרים כל 10 דקות עבור ה 1 לכמת את השינוי שחל ספיגת ביחס הפקד בחלק הדומה צעדים 1.9-1.13 60 דקות.</li>
</ol>3. קביעת האלקטרון מופחת Acceptors סובסטרטים אאו או עשב
<ol><li>5.436 מ של PBS או HBS, להוסיף 240 µL 10 מ מ WST-1 עבור ריכוז סופי של מיקרומטר 400 ו- µL 24 של 5 מ מ PMS עבור ריכוז סופי של 20 מיקרומטר.<ol>
<li>עבור DPIP, להוסיף µL 60 10 מ מ DPIP, עבור ריכוז סופי של 100 מיקרומטר, 5.940 מ של PBS או HBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 100 µL של פתרון אחד טוב בצלחת 96-ובכן שטוח התחתונה בהיעדרו של תאים ולמדוד את ספיגת בספקטרופוטומטר-438 nm, עבור WST-1, או 600 nm, עבור DPIP.</li>
	<li>להוסיף חצי מן הבארות עבור ריכוז סופי של 100 μM µL 1 של 10 מ מ ascorbate. נטר את ספיגת עד זה מייצבת.</li>
	<li>על ייצוב, להוסיף 1 µL של 200 U/mL אאו עבור ריכוז סופי של 2 U/mL מכל קידוח או להוסיף 1 µL של קו 6/השתילות mL עבור ריכוז סופי של U/mL 60 לכל טוב ולנטר את ספיגת לשעה.</li>
</ol>

<ol><li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li>
<li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li>
<li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US8239207">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li>
<li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li>
<li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01279296">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li>
<li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89(2017).</li>
<li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li>
<li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li>
<li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li>
<li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2%2B+as+second+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li>
<li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho%280%29HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).</li>
<li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li>
<li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+oxygen+consumption%3A+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li>
<li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li>
<li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li>
<li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals%3A+functional+significance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane%2C+Cell+Surface%2C+and+Serum+NADH-Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li>
<li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb1958/41/6/41_6_1118/_article">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+New+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2%2C6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).</li>
<li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+%28WST-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li>
<li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li>
<li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+%28phenazine+methosulfate%29+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li>
<li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li>
<li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0,22&cluster=5895405450791166684">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt%2C+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan%3A+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li>
<li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li>
<li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+%28B-CPAP%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thyroid+research%22%5BJournal%5D)">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li>
<li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li>
<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הוצגו שתי שיטות ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors, WST-1 ו- DPIP, במבחני spectrophotometric לעקוב אחר tPMET, C2C12 myotubes. עם הצמיחה של שורות תאים בהליכים תרבות רגיל, קורא צלחת ספקטרופוטומטרים, אפשרי לעקוב אחר tPMET עם אלה acceptors אלקטרונים ב וזמינותו microplate פשוט. צמצום WST-1 הוא לשחזור מכל טוב-כדי-טוב בתוך וזמינותו, אבל יש השתנות היומיומית. המקדם היומיומית של וריאציה (CV) ניצול PBS כמו המאגר הוא 0.18 את קורות חיים ניצול HBS כמו המאגר הוא 0.23.
מן הספרות הקודם mPMS וחומר WST-1, אנחנו שש...

היכולת של ממברנות פלזמה מטוהרים להפחית אלקטרון acceptors הוביל התצוגה כי קרום פלזמה יש קיבולת של חמצון-חיזור הגלום1. ראיתי בעבר פטריות, צמחים, בעלי חיים, tPMET הוא תהליך משותף ל4,3,2,אורגניזמים מספר5. באופן ספציפי, תהליך זה הוכח שמר האפייה, בתאים הגזר, אריתרוציטים, לימפוציטים, אוסטאוסרקומה, מלנומה, מקרופאגים, שרירי השלד ו נויטרופילים2,3, 4 , 5 , 6 , 7. בתהליך כי המשלוחים אלקטרונים על פני קרום פלזמה כדי להפחית את חמצון חוץ-תאית, tPMET מעורב תאיים רבים, לרבות: תא-צמיחה-5,-8, תא הכדאיות9, ברזל חילוף החומרים10, התא איתות11,12,13, והגנה מפני14,12,מינים חמצן תגובתי15. בשל מעורבותו של tPMET תאיים רבים, חוסר איזון של tPMET יש כבר המשוערות לתרום להתפתחות של כמה מצבים בריאותיים חמורים, כולל סרטן16, מחלות לב וכלי דם17, וחילוף תסמונת18.
יש דרכים רבות כדי לפקח על העברת אלקטרונים על פני קרום פלזמה, אך הטכניקה הנפוצה ביותר היא להעריך את ההפחתה של אלקטרון חוץ-תאית acceptors באמצעות מבחני ערכי צבע מוחלטים. Acceptors אלקטרון חוץ-תאית נפוצים הם מלחי tetrazolium, DPIP, FeCN c19,ferricytochrome20. המלח tetrazolium הנפוץ ביותר הוא ידוע מלח הדור השני WST-119. תרכובת זו קל לנצל מבחני ערכי צבע מוחלטים לעומת הדור הראשון מלחי tetrazolium עקב שתי קבוצות סולפונאט, אשר מגבירים את מסיסות המים21. WST-1, בשילוב עם methosulfate 1-מתוקסי-phenazine מקבל אלקטרון ביניים (mPMS), מצטמצם העברת אלקטרונים יחיד שני אירועים. הפחתה זו משתנה מחמצנים את חלש בצבע של WST-1 ל-20,formazan יותר אינטנסיבי, צהוב22. WST-1 יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת של 37 x 103 מ-1ס מ-1, שמוביל וזמינותו גבוהים רגישות21,22. DPIP הוא מנוצל גם כמאשר אלקטרון חוץ-תאית לעקוב אחר tPMET. הוכח, כי DPIP יכול להיות מופחת extracellularly על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors23,24. עקב חוסר acceptors אלקטרון ביניים, DPIP יכול ישירות איסוף אלקטרונים של קרום פלזמה, בניגוד WST-124. בדומה DPIP, FeCN הוכח להיות מופחת extracellularly כדי ferrocyanide על ידי tPMET בלי הסיוע של אלקטרון ביניים acceptors19,24. בניגוד WST-1 ו- DPIP, FeCN יש מקדם נמוך הכחדה טוחנת המוביל אל רגישות וזמינותו נמוכה9. מקבל אלקטרון חוץ-תאית נפוץ אחר לעקוב אחר tPMET הוא ferricytochrome ג בדומה WST-1, ferricytochrome מגביר הפחתת c עם השימוש של מקבל אלקטרון ביניים, mPMS22. אבל בניגוד WST-1 בשיטת c ferricytochrome הוא פחות רגיש בשל רקע גבוה ואת מקדם נמוך הכחדה טוחנת22.
כאן אנו מציגים שיטה לניתוח בזמן אמת של tPMET באמצעות מבחני spectrophotometric. השיטה ניצלה את acceptors חוץ-תאית אלקטרון WST-1 ו- DPIP, כפי לשניהם יש מקדם גבוה הכחדה טוחנת בזמן להיות פחות יקר בהשוואה למטבע האחר נפוץ בשימוש acceptors חוץ-תאית אלקטרונים כגון ferricytochrome c. אנחנו מנוצל phenazine methosulfate (PMS) במקום mPMS יש להם האיפור כימי דומה ו PMS הוא הרבה פחות יקר. mPMS הוא יציב photochemically שהוא מאפיין חשוב עבור ערכת מסחרי צריך חיי מדף ארוכים. עם זאת, אנו עושים PMS טריים עבור כל assay, כך יציבות לא צריך להיות בעיה. אנו מציגים גם שיטה להערכת אנזימטי האינטראקציות האפשריות (ראה איור 1) בין אלקטרון חוץ-תאית מקבל אנזימים היכולה לשמש לאפיין עוד יותר את התהליך של tPMET. באופן ספציפי, אנזימים AO ו- SOD יכול לשמש לקבוע איזה חלק של tPMET הוא ascorbate תחבורה או שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית, שתי שיטות נפוצות האלקטרונים להיות מועבר על-פני קרום פלזמה.

<table><tbody><tr><td>C2C12 myoblasts</td><td>אוסף תרבות מסוג אמריקאי&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco - דל גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>קומפלקס סרום לבעלי חיים Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered</td><td>salt Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>15 ס"מ כלי תרבית</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחות תרבית באר</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-יודופניל)-3-(4-ניטרופניל)-5-(2,4-דיסולפופניל)-2H-טטרזוליום מלח נתרן (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>פנאזין מתוסולפט&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>חומצה L-אסקורבית</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>אסקורבט אוקסידאז&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>סופראוקסיד דיסמוטאז&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-דיכלורואינדופנול מלח נתרן&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מלח נתרן</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי הפטהידרט</td><td>סיגמא</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידרט</td><td>סיגמא</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Powerwave X-I</td><td>Biotek Insturments</td><td>הופסק&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spectronic Genesys 5 ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>PureGrade 96-well microplate, F-bottom, שקוף, לא מטופל, לא סטרילי</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>ברזל (II) כלוריד טטרהידראט</td><td>סיגמא</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>ברזל (II) סולפט הפטהידראט</td><td>סיגמא</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>היפוקסנטין</td><td>סיגמא</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>קסנטין אוקסידאז</td><td>סיגמא</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>הופסק&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי c2c12 myotubes

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה (tPMET) ממלא תפקיד הגנה על תאים מלחץ חותכות תאיים, כמו גם הגנה מפני נזק על ידי חמצון חוץ-תאית. תהליך זה של העברת אלקטרונים תאיים reductants כדי חמצון חוץ-תאית אינה מוגדרת היטב. כאן אנו מציגים מבחני spectrophotometric על ידי C2C12 myotubes לעקוב אחר tPMET ניצול acceptors את האלקטרונים חוץ-תאית: tetrazolium מסיסים במים מלח-1 (WST-1) ו- 2, 6-דיכלורופנול אינדופנול (DPIP או DCIP). באמצעות הפחתה של acceptors אלקטרונים אלה, אנו מסוגלים לעקוב אחר התהליך בניתוח בזמן אמת. עם התוספת של אנזימים כגון ascorbate אוקסידאז (AO), סופראוקסיד דיסמוטאז (SOD) מבחני, אנחנו ניתן לקבוע איזה חלק של tPMET עקב ייצור ייצוא או סופראוקסיד ascorbate, בהתאמה. בעוד WST-1 הוצגה כדי להפיק תוצאות יציב עם רקע נמוך, DPIP היה יכול להיות מחומצן מחדש לאחר התוספת של אאו, עשב, אשר הודגם עם ניתוח spectrophotometric. שיטה זו ממחישה assay spectrophotometric בזמן אמת, רב טוב, מהיר, עם יתרונות על פני שיטות אחרות ששימשו לעקוב אחר tPMET, כגון ferricyanide (FeCN) וצמצום c ferricytochrome.

סטטיסטיקה בוצעו עם ANOVA באמצעים חוזרות באמצעות תוכנה סטטיסטית RStudio25. גודל מדגם הם הצביעו על האגדות איור.
כדי לפקח על tPMET, C2C12 myotubes נוצלו יחד עם acceptors אלקטרון חוץ-תאית, WST-1 ו- DPIP. אאו שימש כדי לקבוע איזה חלק של WST-1 ו DPIP הפחתת נבע ascorbate בזרימת SOD שימש כדי לקבוע איזה חלק של הפחתת WST-1 היה עקב שחרור סופראוקסיד חוץ-תאית. כפי שמוצג באיור2, C2C12 myotu...

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לעקוב אחר תהליך הובלת האלקטרונים של ממברנת טרנס-פלזמה בזמן אמת באמצעות בדיקות ספקטרופוטומטריות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רדוקס בנוגע למנגנון הובלת האלקטרונים של ממברנת טרנס-פלזמה וכיצד נשמרת סביבת החמצון החיזור של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהבדיקה היא בדיקה ספקטרופוטומטרית מהירה בזמן אמת.כדי להתחיל, הושיבו תאי היצמדות C2C-12 פעמיים 10 עד 4 תאים לסנטימטר רבוע בשורות A עד F של צלחת באר 96, ואז כסו את התאים במצע גדילה. דגרו את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר 24 שעות בתרבית, יש לשאוב את אמצעי הגידול, לשטוף עם 150 מיקרוליטר PBS, להחליף במדיום התמיינות ולדגור על התאים למשך 24 עד 48 שעות נוספות.לאחר מכן, הכינו מלאי פתרונות WST-1 ו-PMS. הכינו תמיסת מלאי של 10 מילי-מולרית של WST-1 על ידי המסת 033 גרם של WST-1 בחמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, מערבול את הפתרון.לאחר מכן, הכינו את תמיסת המלאי של PMS על ידי המסת 0023 גרם PMS ב -1.5 מיליליטר מהמים המיוננים. מערבולת הפתרון. כדי להכין את תמיסת העבודה, הוסף גלוקוז ל- PBS כדי ליצור 11.4 מיליליטר של תמיסת גלוקוז של חמישה מילי-מולריות.לפתרון זה, הוסף 480 מיקרוליטר של תמיסת מלאי WST-1 לריכוז סופי של 400 מיקרו-מולרי WST-1 ו-48 מיקרוליטר של תמיסת מלאי PMS לריכוז סופי של 20 מיקרו-מולרי PMS. מערבולת את הפתרונות לערבב. לאחר מכן חלקו את התמיסה לשני אליקוטים של שישה מיליליטר.בהתאם לבדיקה, הוסף את הרכיבים הרלוונטיים המתוארים כאן. לאחר שהפתרונות מוכנים כעת, שאפו את אמצעי ההתמיינות מהתאים ושטפו אותם פעם אחת עם 150 מיקרוליטר PBS. הסר את ה-PBS והוסף 100 מיקרוליטר מ-aliquot אחד לעמודות 1 עד 6.והוסף 100 מיקרוליטר מ-aliquot 2 לעמודות 7 עד 12 מתוך 96 לוחית הבאר. הנח את צלחת 96 הבאר בקורא צלחות ומדוד את ערכי הספיגה כל 10 דקות למשך שעה ב-438 ננומטר. לאחר הקריאה הסופית, שאפו את המדיה ושטפו כל באר עם 150 מיקרוליטר PBS.לאחר מכן, שאפו את ה-PBS. לצורך ניתוח, חשב את השינוי בספיגה עבור כל באר על ידי הפחתת הספיגה הראשונית של הבאר מהספיגה בכל נקודת זמן מאוחרת יותר עבור אותה באר. תקן שינוי זה על סמך השינוי בספיגה שנצפה בבארות הרקע.לאחר תיקון הרקע, נרמל את נתוני הספיגה למדידות הבקרה של 60 דקות. לחלופין, נרמל לפי תכולת החלבון בכל באר באמצעות בדיקת חלבון BCA סטנדרטית. לבסוף, כמת את הנתונים כדי לקבל את כמות הפחתת WST-1 במיקרוגרם חלבון.כדי להתחיל בבדיקת הפחתת DPIP, גדל והבדיל תאי היצמדות C2C-12, כפי שמוצג עבור בדיקת הפחתת WST-1. לאחר מכן, הכינו תמיסת מלאי המכילה 10 מילי-מולרי DPIP על ידי המסת 029 גרם DPIP ב-10 מיליליטר מהמים המיוננים. ואז מערבל את התמיסה.אשר את הריכוז על ידי מדידת ספיגת התמיסה ב-600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כדי ליצור את פתרון העבודה, הוסף 120 מיקרוליטר מתמיסת מלאי DPIP של 10 מילי-מולרית ל-11.88 מיליליטר של תמיסה של חמש מילי-מולרית של גלוקוז ו-PBS לריכוז עבודה סופי של DPIP של 100 מיקרומולר. לאחר מכן, מערבול את הפתרון.לאחר מכן חלקו את התמיסה לשני שישה מיליליטר aliquots. בהתאם לבדיקה, הוסף את הרכיבים הרלוונטיים המתוארים כאן. לאחר שהפתרונות מוכנים כעת, שאפו את אמצעי ההתמיינות מהתאים ושטפו אותם פעם אחת עם 150 מיקרוליטר PBS.הסר את ה-PBS והוסף 100 מיקרוליטר מ-aliquot אחד לעמודות 1 עד 6, ו-100 מיקרוליטר מ-aliquot 2 לעמודות 7 עד 12 מתוך 96 לוחית הבאר. הנח את צלחת 96 הבאר בקורא צלחות ומדוד את ערכי הספיגה כל 10 דקות למשך שעה ב-600 ננומטר ונתח את הערכים המתקבלים כמתואר בניתוח בדיקת ההפחתה WST-1. כדי להתחיל, הכינו שני פתרונות.ראשית, הכינו שישה מיליליטר של 400 מיקרו-מולרי WST-1 ו-20 מיקרו-מולרי PMS ב-PBS. לאחר מכן הכינו שישה מיליליטר של תמיסה מיקרוטולרית של 100 של DPIP ו- PBS. הכן את צלחת 96 הבארות הראשונה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת WST-1/PMS לשורות A עד D בצלחת תחתונה שטוחה בהיעדר תאים, ומדוד את הספיגה בספקטרופוטומטר ב-438 ננומטר.לאחר מכן הכינו צלחת שנייה של 96 בארות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת DPIP לשורות A עד D בצלחת תחתונה שטוחה בהיעדר תאים, ומדדו את הספיגה בספקטרופוטומטר ב-600 ננומטר. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של 10 מילי-מולרי אסקורבט למחצית הבארות לריכוז סופי של 100 מיקרומולר. עקוב אחר הספיגה בצלחת עד שהיא מתייצבת.לאחר מכן, חזור על הפעולה עם DPIP. לאחר הייצוב, קבע אם מקבלי האלקטרונים המיוצרים הם מצעים. עבור אסקורבט אוקסידאז לסופר אוקסיד מתפרק, על ידי הוספת אסקורבט אוקסידאז או סופר אוקסיד מתפרק לכל באר ומעקב אחר שינוי הספיגה למשך שעה אחת.כדי לנטר את הובלת האלקטרונים של ממברנת טרנספלזמה, נעשה שימוש באסקורבט אוקסידאז כדי לחסום את ההשפעות של הפחתה מתווכת אסקורבט ונעשה שימוש בסופראוקסיד דיסמוטאז כדי לחסום הפחתה בתיווך סופראוקסיד כדי לקבוע איזה חלק מהפחתת WST-1 נובע מכל רכיב. עם תוספת של אסקורבט אוקסידאז, הפחתת WST-1 דוכאה בכ-30%, מה שמצביע על כך שכ-30% מהובלת האלקטרונים של ממברנת הטרנספלזמה נבעה מייצוא אסקורבט. עם תוספת של סופראוקסיד דיסמוטאז, הפחתת WST-1 דוכאה בכ-70%, מה שמצביע על כך שכ-70% מהובלת האלקטרונים של ממברנת הטרנספלזמה נבעה משחרור סופראוקסיד חוץ-תאי.כדי לקבוע אם DPIP מופחת הוא מצע לאסקורבט אוקסידאז או סופר אוקסיד דיסמוטאז, רמות ה-DPIP הופחתו עם חומצה אסקורבית. לאחר 20 דקות נוסף אסקורבט אוקסידאז, והספיגה נוטרה. ההתאוששות מראה כי DPIP מופחת הוא מצע לאסקורבט אוקסידאז.כאשר נוסף סופר אוקסיד דיסמוטאז, DPIP גם התחמצן מחדש, אם כי בקצב איטי יותר; לכן, DPIP מופחת הוא סובסטרט לאנזימים אלה ולא מקבל אלקטרונים חוץ-תאי מתאים לשימוש עם אנזימים אלה. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להפוך את כל הריאגנטים לטריים מדי יום.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של חמצון חיזור לחקור את הובלת האלקטרונים של ממברנת טרנספלזמה במגוון סוגי תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את הובלת האלקטרונים של ממברנת טרנספלזמה באמצעות מקבלי אלקטרונים חוץ-תאיים, כמו גם כיצד לקבוע אם מקבל האלקטרונים עשוי להוות מצע לאנזימים המשמשים בבדיקה.

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

תיאור של השיטה עבור פרופיל תפקיד המיטוכונדריה בתאים מסופק. הפרופיל המיטוכונדריה שנוצר מספק ארבעת הפרמטרים של הפונקציה המיטוכונדריה כי ניתן למדוד בניסוי אחד: קצב הנשימה הבסיסי, ה-ATP צמודות הנשימה, דליפה פרוטון, ויכולת מילואים.

פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

שריר שלד הוא חיוני לתנועה, והוא חנות החלבון העיקרית של הגופים. מדידות בריאות שרירים בתוך סי אלגנס מתוארות. שינויים פוטנציאליים למבנה שרירים ובתפקודם הוערכו באמצעות ה- GFP מקומי וצבעים קטיוני.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב C. elegans

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

השיטות המוצגות מספקות הוראות שלב אחר שלב לביצוע אוסף של בדיקות ספירומטריות מבוססות מיקרו-צלחת באמצעות מיטוכונדריה מבודדת מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר. מבחנים אלה מסוגלים למדוד שינויים/התאמות מכניסטיות בצריכת החמצן המיטוכונדריאלית במודל נפוץ של בעלי חיים.

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3  כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.

ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.

רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית

למדו לנטר הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה בזמן אמת ב-C2C12 Myotubes באמצעות מדידות ספקטרופוטומטריות. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני תחבורה אלקטרונים ואיזון אוקסידורדוקטיבי תאי.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

גלה סרטונים נוספים