Name: אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: חקור את תפקיד תחבורת הפרוטונים באלקטרון חוץ-תאית ב-Shewanella oneidensis MR-1 באמצעות אפקט איזוטופי קינטי של דאוטריום. שיטה זו חושפת את ההשפעה על קינטיקת ההעברה האלקטרונית בחיידקים חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מענק הסיוע במיוחד קידום מחקר החברה יפן של קידום המדע (JSPS) KAKENHI גרנט מספר 24000010, 17H. 04969, ו JP17J02602, אותנו למשרד של חיל הים המחקר העולמי (N62909-17-1-2038). Y.T. היא עמיתת מחקר JSPS ונתמך על-ידי JSPS דרך התוכנית עבור המובילים לתואר שני בתי ספר (הצטיינות).

1. היווצרות ממבנה Biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 באלקטרודה איטו (איור 1)
הערה: כדי למנוע את הזיהום של הכור אלקטרוכימי עם חיידקים אחרים, כל התקשורת, סככה, ו רכיבים של הכור אלקטרוכימי צריכים לעקר מראש. כאשר באמצעות תאים oneidensis ס מר-1, בניית הכורים אלקטרוכימי, כל ההליכים וצריך להתנהל על ספסל נקי.
<ol><li>הטיפוח של oneidensis ס מר-1 תאים הערה: ממבנה biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 הוקמה ב איטו אלקטרודה בעקבות התנאים דיווח בעבר4.<ol>
<li>לגדול oneidensis ס מר-1 תאים, להוסיף מושבה אחת של מר ס oneidensis -גדל על צלחת אגר הכוללת לוריא-Bertani (ליברות) (20 גרם/ליטר) מה נשארתי אגר (15 גר'/ליטר) לתוך 15 מ"ל של מדיום ליברות (20 גרם/ליטר) ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה בתנאים אירוביים ברעידות-160 סיבובים לדקה 1.</li>
		<li>Centrifuge התליה תא ב 6,000 × g למשך 10 דקות ולאחר resuspend בגדר תא תוצאות ב-15 מיליליטר מוגדר בינוני (pH 7.8) (DM: NaHCO3 [2.5 g/L], CaCl2·2H2O [0.08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6-אייץ '2O [0.2 g/L], NaCl [10 גרם/L], ו- 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] חומצה ethanesulfonic [HEPES; 7.2 g/L]), שהושלם עם תמצית שמרים 0.5 g/L כמקור פחמן, ו 10 מ מ לקטט ויסודות עבור מר ס oneidensis -1 , בהתאמה.</li>
		<li>עוד יותר לטפח התליה תא aerobically ב 30 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות ברעידות-160 סיבובים לדקה, centrifuge שוב ב 6,000 × g עבור 10 דקות לשטוף בגדר תא הנובעת פעמיים עם מיט בינוני על ידי צנטריפוגה 10 דקות ב g 6,000 × לפני אלקטרוכימי הניסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקמת כור אלקטרוכימי שלוש-אלקטרודה (איור 1)<ol>
<li>לשים על מצע איטו כמו האלקטרודה עבודה בחלק התחתון של הכור.</li>
		<li>לאחר מכן, הוסף גליל זכוכית (קוטר של 2 ס מ), כיסוי טפלון (PTFE). ואז להוסיף Ag/AgCl (אשלגן כלורי רווי) ו חוט פלטינה לתוך הכור האלקטרודות הפניה, מונה, בהתאמה. הערה: כדי למנוע דליפת אוויר, פתרון, הכנס סדין גומי בוטיל בין כל אחד מהרכיבים.</li>
		<li>להוסיף מ 4.0 ל DM בתוספת 10 מ מ לקטט ולחלץ 0.5 g/L שמרים לתוך הכור אלקטרוכימי.</li>
		<li>לאחר שנוכח שיש אין זליגות הכור אלקטרוכימי, זרימת הגז חנקן לתוך הכור אלקטרוכימי מעל 20 דקות כדי לשמור על תנאים אנאירוביים בתוך הכור אלקטרוכימי. הערה: כדי למנוע זיהום, עם חיידקים אחרים, הגז לסנן לפני זורם לתוך הכור אלקטרוכימי.</li>
		<li>להתחבר הכור אלקטרוכימי potentiostat ולהחיל +0.4 V (לעומת אלקטרודת מימן סטנדרטי, היא) אל האלקטרודה איטו, שמירה על הטמפרטורה של הכור אלקטרוכימי ב 30 מעלות צלזיוס, באמצעות מערכת מחזור מים חיצוני. הערה: כדי למנוע את ההשפעה של שדה חשמלי חיצוני, הכור אלקטרוכימי צריך להיות ממוקם בתוך כלוב פאראדיי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפוח אלקטרוכימי של תאים מר-1 ס' oneidensis (איור 1 ו- 2 איור)<ol>
<li>להתאים את צפיפות התאים ההשעיה שהושג בשלב 1.1 צפיפות אופטית של 1.43 על 600 nm (OD600) עם מיט בתוספת שמרים ו לקטט 0.5 g/L 10 מ מ לחלץ. הערה: כדי לקבל את יתר הנכון600, חלות על השעיית תא OD600 ≤ 0.8 ספקטרומטר UV-vis לפני התאמת ה OD600 ל 1.43.</li>
		<li>להוסיף mL 0.3 של התליה תא לתוך הכור אלקטרוכימי דרך היציאה הזרקת באמצעות מזרק: ה OD600 לכור משתנה ל- 0.1. הערה: התוספת של 0.3 mL התליה תא עם יתר600 = 1.43 לתוך הכור אלקטרוכימי המכילה תוצאות בינוניות 4.0 מ"ל ב- 4.3 mL פתרון עם יתר600 = 0.1. כשמשתמשים אחרים כורים עם אמצעי אחסון שונה, חישוב צפיפות תא נדרש.</li>
		<li>המשך היישום פוטנציאליים-+0.4 V (לעומת היא) אל האלקטרודה איטו עבור 25 h. הערה: להיווצרות ממבנה biofilm חד שכבתי על אלקטרודה איטו, ודא כי הזרם המיוצר תערוכות של סטיית פחות מ 50% מאיור 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. החלפת תגובת שיקוע בינונית מיט טריים עם 10 מ מ לקטאט (איור 3)
<ol><li>עוצרים את פוטנציאל היישום, נתק את הכור אלקטרוכימי של potentiostat ואת מערכת מחזור מים.</li>
	<li>לקטט החלפת תגובת שיקוע בינונית מיט טריים עם 10 מ מ<ol>
<li>זרימת הגז חנקן לתוך בקבוק המכיל מיט עם לקטט 10 מ מ מעל 20 דקות כדי להסיר את החמצן של המדיום.</li>
		<li>הסר כל תגובת שיקוע בתוך הכור אלקטרוכימי באמצעות מזרק, תחת זורם גז חנקן (איור 3 א, ב'). הערה: כדי למנוע את שבירת את biofilm על האלקטרודה איטו על ידי גז חנקן, הגז צריך לזרום מעל פני השטח נוזלי.</li>
		<li>להוסיף מ 4.0 ל DM טריים המכילים לקטט 10 מ מ באמצעות מזרק (איור 3 c). הערה: כדי למנוע את שבירת את biofilm על האלקטרודה איטו, להזריק לאט המדיום לאורך החומה של הכור אלקטרוכימי. כדי לשמור את biofilm רטוב, יש להוסיף את המדיום מיד לאחר הסרת תגובת שיקוע. הזרקה של עד בינוני 1 דקות לאחר הסרת תגובת שיקוע לא משפיע על הייצור הנוכחי מ biofilm של מר ס oneidensis -1.</li>
		<li>שיפוע-הכור אלקטרוכימי כדי להסיר כל תגובת שיקוע מחובר לקיר של הכור אלקטרוכימי.</li>
		<li>חזור על צעדים 2.2.2-2.2.4 שלוש פעמים בסך הכל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לעצור את זרימת הגז ולהתחבר הכור אלקטרוכימי potentiostat שוב, החלה +0.4 V (לעומת היא) על האלקטרודה איטו-303 K...</li>
</ol>3. תוספת של דאוטריום מים כדי למדוד את KIE על תהליך EET (איור 4)
<ol><li>לאשר כי הייצור הנוכחית החל ממבנה biofilm טפט של oneidensis ס מר-1 הינה יציב, אין להגדיל במהירות. אם הזרם עולה בתלילות, המתן עד הנוכחי מייצבת תוך העלאה של 5% מעל 10 דקות. הערה: היווצרות של ממבנה biofilm חד שכבתי על אלקטרודה איטו ללא זיהום של זני חיידקים אחרים אושר ע י רצפים rDNA ותמונה סריקה אלקטרון מיקרוסקופיות של biofilm על אלקטרודה איטו, כפי שדווח בעבר4. עבור אישור של המגבלה קצב על ידי תהליך EET, לנטר את ההשפעה של הוספת והצוות מגשרים אלקטרונים כגון מיקרומטר 100 anthraquinone-1-סולפונאט (α-AQS). עיין בסעיף של נציג תוצאות וצור הפניה15 לפרטים נוספים.</li>
	<li>להוסיף 40 µL של אנאוקסיים 50% (v/v) ד2O לתוך הכור אלקטרוכימי באמצעות מזרק כך הריכוז הוא 0.5% (v/v) ד2O לכור. הערה: כדי למנוע נזק biofilm על ידי תוספת2O D, להזריק את D2O drop-wise.</li>
	<li>המתן הנוכחי לייצב, ולאחר להוסיף לאחר מכן D2O עד 4.0% (v/v). הערה: כדי לקבל את הערך KIE (היחס בין הייצור הנוכחי בנוכחות D2O ו- H2O), לבדוק את השפעת באותו אמצעי אחסון של H2O בנוסף על ההפקה הנוכחית.</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Manganese+in+Anaerobic+Respiration+-+Environmental+Significance%2C+Physiology%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Iron and Manganese in Anaerobic Respiration - Environmental Significance, Physiology, and Regulation.</a> Annu. Rev. Microbiol. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Bretschger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+production+and+metal+oxide+reduction+by+Shewanella+oneidensis+MR-1+wild+type+and+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Current production and metal oxide reduction by Shewanella oneidensis MR-1 wild type and mutants.</a> Appl Environ Microb. 73 (21), 7003-7012 (2007).</li>
<li>Richter, H., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2009/EE/B816647A">Cyclic voltammetry of biofilms of wild type and mutant Geobacter sulfurreducens on fuel cell anodes indicates possible roles of OmcB, OmcZ, type IV pili, and protons in extracellular electron transfer.</a> Energy Environ. Sci. 2 (5), 506-516 (2009).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochim. Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Strycharz, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/ee/c0ee00260g">Application of cyclic voltammetry to investigate enhanced catalytic current generation by biofilm-modified anodes of Geobacter sulfurreducens strain DL1 vs. variant strain KN400.</a> Energy Environ. Sci. 4 (3), 896-913 (2011).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Coursolle, D., Gralnick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+extracellular+respiratory+pathways+for+iron%28III%29+reduction+in+Shewanella+oneidensis+strain+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of extracellular respiratory pathways for iron(III) reduction in Shewanella oneidensis strain MR-1.</a> Front. Microbiol. 3, (2012).</li>
<li>Franks, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/-/content/articlehtml/2009/ee/b816445b">Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm.</a> Energy Environ. Sci. 2 (1), 113-119 (2009).</li>
<li>McLean, J. S., Ona, O. N., Majors, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+biofilm+imaging%2C+transport+and+metabolism+measurements+via+combined+nuclear+magnetic+resonance+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Correlated biofilm imaging, transport and metabolism measurements via combined nuclear magnetic resonance and confocal microscopy.</a> ISME J. 2 (2), 121-131 (2008).</li>
<li>Busalmen, J. P., Esteve-Nunez, A., Berna, A., Feliu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+cytochromes+wire+electricity-producing+bacteria+to+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">C-type cytochromes wire electricity-producing bacteria to electrodes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (26), 4874-4877 (2008).</li>
<li>Nakamura, R., Ishii, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Absorption+Spectra+and+Redox+Properties+of+C+Type+Cytochromes+in+Living+Microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Electronic Absorption Spectra and Redox Properties of C Type Cytochromes in Living Microbes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (9), 1606-1608 (2009).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiration-Linked+Proton+Translocation+Coupled+to+Anaerobic+Reduction+of+Manganese%28IV%29+and+Iron%28III%29+in+Shewanella+putrefaciens+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Respiration-Linked Proton Translocation Coupled to Anaerobic Reduction of Manganese(IV) and Iron(III) in Shewanella putrefaciens MR-1.</a> J. Bacteriol. 172 (11), 6232-6238 (1990).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.light.t.u-tokyo.ac.jp/e/2015/12/10/sp2015-9/">Extracellular Electron Transport Scarcely Accumulates Proton Motive Force in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Bull. Chem. Soc. Jpn. 88 (5), 690-692 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Saito, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cation-limited+kinetic+model+for+microbial+extracellular+electron+transport+via+an+outer+membrane+cytochrome+C+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+and+physicobiology%22%5BJournal%5D)">Cation-limited kinetic model for microbial extracellular electron transport via an outer membrane cytochrome C complex.</a> Biophysics and physicobiology. 13, 71-76 (2016).</li>
<li>Okamoto, A., Tokunou, Y., Shafeer, K., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton+Transport+in+the+Outer-Membrane+Flavocytochrome+Complex+Limits+the+Rate+of+Extracellular+Electron+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Proton Transport in the Outer-Membrane Flavocytochrome Complex Limits the Rate of Extracellular Electron Transport.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 56, 9082-9086 (2017).</li>
<li>Hammes-Schiffer, S., Stuchebrukhov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+Coupled+Electron+and+Proton+Transfer+Reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Theory of Coupled Electron and Proton Transfer Reactions.</a> Chem. Rev. 110 (12), 6939-6960 (2010).</li>
<li>Cleland, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+isotope+effects+to+determine+enzyme+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms.</a> J Biol. Chem. 278 (52), 51975-51984 (2003).</li>
<li>Kouzuma, A., Kasai, T., Hirose, A., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catabolic+and+regulatory+systems+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+involved+in+electricity+generation+in+microbial+fuel+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Catabolic and regulatory systems in Shewanella oneidensis MR-1 involved in electricity generation in microbial fuel cells.</a> Front. Microbiol. 6, (2015).</li>
<li>Kushner, D. J., Baker, A., Dunstall, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+uses+and+perspectives+of+heavy+water+and+deuterated+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J+Physiol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds.</a> Can. J Physiol. Pharm. 77 (2), 79-88 (1999).</li>
<li>Xie, X. S., Zubarev, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Low-Level+Deuterium+Enrichment+on+Bacterial+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effects of Low-Level Deuterium Enrichment on Bacterial Growth.</a> Plos One. 9 (7), e102071(2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+enhancement+of+bacterial+extracellular+electron+transport+involves+bound+flavin+semiquinones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Rate enhancement of bacterial extracellular electron transport involves bound flavin semiquinones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (19), 7856-7861 (2013).</li>
<li>Edwards, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+Linked+Flavin+Sites+in+Extracellular+Decaheme+Proteins+Involved+in+Microbe-Mineral+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Redox Linked Flavin Sites in Extracellular Decaheme Proteins Involved in Microbe-Mineral Electron Transfer.</a> Sci. Rep. 5, 11677(2015).</li>
<li>Saito, J., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616318898">Flavin as an Indicator of the Rate-Limiting Factor for Microbial Current Production in Shewanella oneidensis MR-1.</a> Electrochim. Acta. 216, 261-265 (2016).</li>
<li>Guo, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+Cr%28VI%29+by+Escherichia+coli+BL21+in+the+presence+of+redox+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Reduction of Cr(VI) by Escherichia coli BL21 in the presence of redox mediators.</a> Bioresource Technol. 123, 713-716 (2012).</li>
<li>Nealson, K., Saffarini, D., Moser, D., Smith, M. J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0167701294900051">A Spectrophotometric Method for Monitoring Tactic Responses of Bacteria under Anaerobic Conditions.</a> J Microbiol. Meth. 20 (3), 211-218 (1994).</li>
<li>Myers, C. R., Myers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+the+outer+membrane+cytochromes+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Lett.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of the outer membrane cytochromes of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Lett. Appl. Microbiol. 37 (3), 254-258 (2003).</li>
<li>Lower, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+Recognition+Force+Microscopy+Shows+that+Outer+Membrane+Cytochromes+OmcA+and+MtrC+Are+Expressed+on+the+Exterior+Surface+of+Shewanella+oneidensis+MR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibody Recognition Force Microscopy Shows that Outer Membrane Cytochromes OmcA and MtrC Are Expressed on the Exterior Surface of Shewanella oneidensis MR-1.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (9), 2931-2935 (2009).</li>
<li>Chen, X. X., Ferrigno, R., Yang, J., Whitesides, G. A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0204794">Redox properties of cytochrome c adsorbed on self-assembled monolayers: A probe for protein conformation and orientation.</a> Langmuir. 18 (18), 7009-7015 (2002).</li>
<li>McMillan, D. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+enzyme+orientation+and+electrode+topology+on+the+catalytic+activity+of+adsorbed+redox+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">The impact of enzyme orientation and electrode topology on the catalytic activity of adsorbed redox enzymes.</a> Electrochim. Acta. 110, 79-85 (2013).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>McGlynn, S. E., Chadwick, G. L., Kempes, C. P., Orphan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+activity+reveals+direct+electron+transfer+in+methanotrophic+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single cell activity reveals direct electron transfer in methanotrophic consortia.</a> Nature. 526 (7574), 531-535 (2015).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Nealson, K. H., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/celc.201402151/abstract">Bound Flavin Model Suggests Similar Electron-Transfer Mechanisms in Shewanella and Geobacter.</a> Chemelectrochem. 1 (11), 1808-1812 (2014).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavin+Redox+Bifurcation+as+a+Mechanism+for+Controlling+the+Direction+of+Electron+Flow+during+Extracellular+Electron+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Flavin Redox Bifurcation as a Mechanism for Controlling the Direction of Electron Flow during Extracellular Electron Transfer.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (41), 10988-10991 (2014).</li>
<li>Tokunou, Y., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.6b00349">Acceleration of Extracellular Electron Transfer by Alternative Redox-Active Molecules to Riboflavin for Outer-Membrane Cytochrome c of Shewanella oneidensis MR-1.</a> J Phys. Chem. C. 120 (29), 16168-16173 (2016).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/03/14/116475">Tracking electron uptake from a cathode into Shewanella cells: implications for generating maintenance energy from solid substrates.</a> bioRxiv. , 116475(2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

שלנו assay אלקטרוכימי של תאים שלמים יש כמה יתרונות טכניים לעומת חלבון אלקטרוכימיה. בעוד טיהור חלבון דורש הליכים גוזלת זמן רב שלבי, השיטה כולה-תא שלנו לוקח יום אחד של ביופילמים עצמית מאורגן לאחר תרבית תאים. כדי להשיג את האינטראקציה יציב בין אום c- Cyts האלקטרודה, אנחנו זקוקים רק עיקור, ניקוי של פני האלקטרודה; . זה לא דורש שינוי אלקטרודה עבור ארגון את הכיוון של חלבונים4, למשל, ס' oneidensis מר-1 ממהותם מצרף אל האלקטרודה, תוך המכוונת אום c- Cyts הכיוון אותו<sup cla...

בטכניקות אלקטרוכימיות לאפיין ישירות חלבון חמצון-חיזור תא החיידק ללא פגע לאחרונה הופיעו מאז הגילוי להפחתת מתכת זני חיידקים, כגון oneidensis ס מר-1 או Geobacter sulfurreducens PCA, אשר יש מתחמי ציטוכרום c-type הממברנה החיצונית (OM c-Cyts) נחשפים תא חיצוני1,2,3,4,5. אום c- Cyts מתווכים התחבורה אלקטרונים בשרשרת הנשימה סובסטרטים מוצק ממוקם extracellularly. העברה זו נחשבת אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET)1,6 , תהליך קריטי עבור מנרב המתעוררים, כגון חיידקים בתאי דלק6. לכן, כדי להבין קינטיקה EET הבסיסית של מנגנונים ואת זיקתה פיזיולוגיה מיקרוביאלי, אום c -Cyts נחקרו באמצעות תאים שלמים אלקטרוכימיה4,7, בשילוב עם מיקרוסקופ 8 , 9,10,ספקטרוסקופיה11וביולוגיה מולקולרית2,4. לעומת זאת, שיטות כדי לחקור את השפעת התחבורה הקטיון הקשורים EET, למשל, פרוטונים, על EET קינטיקה בתאים חיים בקושי הוקמו, למרות פרוטון תחבורה מעבר ממברנות חיידקי יש תפקיד קריטי איתות, הומאוסטזיס ואנרגיה ייצור12,13,14. בהווה ללמוד, נתאר טכניקה כדי לבחון את השפעת התחבורה פרוטון-קינטיקה EET בתא oneidensis ס מר-1 באמצעות כל-תא אלקטרוכימי מדידות, המחייב את הזיהוי של הצעד הגבלת קצב חיידקים הנוכחי הפקה15.
דרך ישירה אחת כדי להעריך את התרומה של פרוטון הובלה על EET המשויך הוא אפקט קינטי איזוטופ דאוטריום (KIE). KIE הוא מקהים השינוי ב קינטיקה העברת אלקטרונים על החלפת פרוטונים עם יונים דאוטריום, אשר מייצג את השפעת התחבורה פרוטון אלקטרון העברה קינטיקה16. התיאוריה של KIE עצמה הוכח גם באמצעות מדידות אלקטרוכימי עם אנזימים מטוהרים17. עם זאת, מאז הייצור הנוכחי ב ס oneidensis מר-1 היא תוצאה של תהליכים מגוונים, המשתנות מרובים,18, אחד יכול פשוט לזהות EET כתהליך הגבלת קצב. כדי לבחון את KIE על פרוטון תחבורה תהליכים בשילוב עם EET, עלינו לוודא כי ההפקה הנוכחית חיידקים מוגבל על ידי אלקטרון תחבורה באמצעות אום c- Cyts אל האלקטרודה. למטרה זו, החלפנו את הפתרון supernatant בינונית טריים המכילים ריכוז גבוה של חומצת החלב כמו תורם אלקטרון pH אופטימלי, בתנאי טמפרטורה לפני המדידה KIE; החלפת הזה שימש שני תפקידים: (1) קצב התהליכים המטאבוליים במעלה בהשוואה EET לבין (2) הושמט התאים שחיה תגובת שיקוע שוחררו את biofilm טפט של מר ס oneidensis -1 ב (אלקטרודה העבודה אינדיום בדיל-מסטול אוקסיד (ITO) אלקטרודה). פרוטוקול מפורט הציג מיועדת לסייע מתרגלים חדשים לשמור, לאשר כי התהליך EET הוא השלב שקובעים שיעור.

<table><tbody><tr><td>גליל זכוכית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, משמש ככיסוי הכור האלקטרוכימי</td></tr><tr><td>PTFE ובסיס</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, משמש ככיסוי ובסיס של הכור האלקטרוכימי</td></tr><tr><td>גומי Buthyl</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>בהתאמה אישית, מוכנס בין כל רכיב של כור אלקטרוכימי</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>משמש כיציאת הזרקה של אלקטרודה אלקטרודה</td></tr><tr><td>תחמוצת פח אינדיום (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>משמשת כאלקטרודה עובדת, אלקטרודה רוויה 5&Omega;/</td></tr><tr><td>sq Ag/AgCl KCl</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>משמשת כאלקטרודת ייחוס, &Phi; חוט פלטינה 0.30 מ"מ</td></tr><tr><td></td><td>The Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>משמש כאלקטרודה נגדית</td></tr><tr><td>מרק לוריא-ברטאני (LB), מילר</td><td>בקטון, דיצ'קינסון ושות'</td><td>244620</td><td>מדיום לגידול מוקדם של S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>אנתרקווינון-1-סולפונאט (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>פלבין מונונוקלאוטיד (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>משמש למדיום מוגדר (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>משמש ל-DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>משמש ל-DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>משמש עבור DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>משמש עבור</td></tr><tr><td>DM 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] חומצה אתנסולפונית (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>משמש לתמיסת נתרן</td></tr><tr><td>לקטט</td> DM <td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים בקטו</td><td>בקטון, דיצ'קינסון ושות'</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום (D, 99.9%)</td><td>מעבדות איזוטופ קיימברידג', בע"מ</td><td>תוסף DLM-4-PK</td><td>לניסויי אפקט איזוטופ קינטי</td></tr><tr><td>חממה</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>משמש לשייקר טרום גידול</td></tr><tr><td></td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>משמש למכונת</td></tr><tr><td>חיטוי</td> טרום טיפוח <td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>משמש לעיקור של הכור האלקטרוכימי והמדיום</td></tr><tr><td>ספסל נקי</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>משמש למניעת זיהום הכור האלקטרוכימי והמדיום בחיידקים אחרים</td></tr><tr><td>מפריד צנטריפוגות</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>מהירות סיבוב עד 6000 פעמים; g נדרש</td></tr><tr><td>מחולל גז חנקן</td><td>Puequ CO. בע"מ.</td><td>ניתן להשתמש גם בבלון גז חנקן</td> <td>PNTN-2</td> במקום מחולל גז</tr><tr><td>ספקטרומטר UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>משמש לאופטימיזציה של צפיפות התאים</td></tr><tr><td>Potentiostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>משמש להיווצרות ביופילם וניסויי אפקט איזוטופ קינטי</td></tr><tr><td>סירקולטור מים תרמיים</td><td>כאחד</td><td>TR-1A</td><td>משמש לתחזוקת הטמפרטורה של כור אלקטרוכימי</td></tr><tr><td>כלוב פאראדיי</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>משמש לניסויים אלקטרוכימיים</td></tr></tbody></table>

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר shewanella oneidensis -1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

ישיר זיהוי אלקטרוכימי של c-הקלד מתחמי ציטוכרום מוטבע בתוך הממברנה החיצונית חיידקי (הממברנה החיצונית c-הקלד ציטוכרום מתחמי; אום c- Cyts) יש לאחרונה הופיעו כשיטה הרומן השלם-תא אנליטי לאפיין התעבורה חיידקי אלקטרונים בשרשרת הנשימה אל החוץ תא, המכונה התעבורה אלקטרון חוץ-תאית (EET). בזמן מסלול וקינטיקה של זרימת אלקטרונים במהלך התגובה EET נחקרו, שיטה אלקטרוכימי תאים שלמים כדי לבחון את השפעת התחבורה הקטיון המשויך EET לא טרם הוקם. במחקר הנוכחי, דוגמה טכניקה הביוכימי לבחון את דאוטריום איזוטופ קינטי (KIE) על EET דרך אום c- Cyts באמצעות מודל ומה איתי, מר Shewanella oneidensis -1, הוא תיאר. ניתן להשיג את KIE על תהליך EET אם EET דרך אום c- Cyts משמש הצעד הגבלת קצב הייצור הנוכחי מיקרוביאלי. לשם כך, לפני התוספת של D2O, הפתרון supernatant הוחלף טריים המדיה המכילה כמות מספקת של התורם אלקטרון כדי לתמוך הקצב של תגובות חילוף החומרים במעלה הזרם, וכדי להסיר תאים פלנקטוניים מדים טפט biofilm על האלקטרודה עבודה. שיטות אלטרנטיביות כדי לאשר הגבלת הקצב את שלב הייצור הנוכחי מיקרוביאלית כמו EET דרך אום c- Cyts מתוארים גם. הטכניקה שלנו של assay אלקטרוכימי תאים שלמים על חקירת קינטיקה תחבורה פרוטון יכול להחיל על זני חיידקים אחרים electroactive.

לאחר 25 h של פוטנציאל היישום ב- +0.4 V (לעומת היא), ממבנה biofilm טפט הוקמה ב האלקטרודה עבודה של זכוכית ITO, אשר אושר קודם לכן ע י או של מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה או מיקרוסקופיה קונפוקלית4. המסלול הפעם נציג של הייצור הנוכחי של ה- S. oneidensis מר-1 במהלך היווצרות ממבנה biofilm טפט מוצג באיור2. למרות הנוכחי הפיצולים במדידה כל, המיוצר הנוכחי לא להפגין סטייה מעל 50% מהערך באיור 2 אם ממבנה biofilm טפט...

כאן אנו מציגים פרוטוקול של כל תא אלקטרוכימי ניסויים ללמוד את התרומה של פרוטון תחבורה לקצב התחבורה אלקטרון חוץ-תאית באמצעות cytochromes הממברנה החיצונית מתחם Shewanella oneidensis מר-1.

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבחון את התרומה של הובלת פרוטונים לקצב הובלת האלקטרונים החוץ-תאיים של חיידקים על ידי זיהוי אפקט האיזוטופ הקינטי של דאוטריום. השיטה שלנו חושפת את ההשפעה של הובלת פרוטונים על הקינטיקה של הובלת אלקטרונים חוץ-תאית או EET מחיידקים לאלקטרודה באמצעות ציטוכרומים מסוג c של הממברנה החיצונית. הבדיקה שלנו משקפת את ניהול הפרוטונים המקורי ב-EET מכיוון שהשתמשנו בחיידקים חיים ולא באנזים מטוהר.עם זאת, האתגר שלנו היה להסיר את הרעשים מתהליכים תאיים אחרים. אפקט האיזוטופ הקינטי של דאוטריום המכונה KIE הוא אחת הטכניקות הטובות ביותר לבחינת התרומה של הובלת פרוטונים על תהליך הובלת האלקטרונים הנלווה. כדי לגדל תאי Shewanella MR-1, העבירו מושבה אחת של התאים הגדלים על צלחת אגר ל-15 מיליליטר של מדיום LB.לגדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בתנאים אירוביים עם טלטול ב-160 סל"ד. צנטריפוגה את מתלה התא בכוח הכבידה פי 6,000 למשך 10 דקות. לאחר מכן, השעו מחדש את כדור התא שנוצר ב-15 מיליליטר של מדיום מוגדר, בתוספת 10 מילי-מולרי לקטט כמקור לפחמן ו-0.5 גרם לליטר תמצית שמרים כיסודות קורט לתאים.לאחר טיפוח נוסף של תרחיף התא באופן אירובי ב-30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות עם טלטול ב-160 סל"ד, צנטריפוגה שוב בכוח הכבידה פי 6,000 למשך 10 דקות. שטפו את כדור התא שנוצר פעמיים עם מדיום DM על ידי צנטריפוגה למשך 10 דקות בכוח הכבידה פי 6,000 לפני הניסוי האלקטרוכימי. כדי לבנות כור אלקטרוכימי בעל שלוש אלקטרודות, שים מצע ITO כאלקטרודה העובדת בתחתית הכור.לאחר מכן, הכנס גליל זכוכית ומכסה פוליטטרפלואורואתילן והכנס חוט פלטינה כאלקטרודת הנגד. לאחר מכן, הכנס אלקטרודת כסף כלוריד לכור כאלקטרודת הייחוס. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר DM בתוספת 10 מילי-מולרי לקטט ו-0.5 גרם לליטר תמצית שמרים לכור האלקטרוכימי.לאחר אישור שאין דליפה מהכור האלקטרוכימי, הזרם את גז החנקן לכור האלקטרוכימי במשך 20 דקות כדי לשמור על תנאים אנרוביים בתוך הכור האלקטרוכימי. חבר את הכור האלקטרוכימי לפוטנציוסטט והחל 0.4 וולט חיובי על אלקטרודת ה-ITO, תוך שמירה על הטמפרטורה של הכור האלקטרוכימי על 30 מעלות צלזיוס באמצעות מערכת זרימת מים חיצונית. כדי לבצע גידול אלקטרוכימי, התאם תחילה את צפיפות התאים של התרחיף לצפיפות אופטית של 1.43 ב-600 ננומטר עם DM בתוספת 10 מילי-מולרי לקטט ו-0.5 גרם לליטר תמצית שמרים.הוסף 0.3 מיליליטר של תרחיף התאים לכור האלקטרוכימי דרך יציאת ההזרקה באמצעות מזרק. ה-OD 600 בכור משתנה ל-0.1. המשך את היישום הפוטנציאלי ב-0.4 וולט חיובי לאלקטרודה ITO למשך 25 שעות.עצור את היישום הפוטנציאלי ונתק את הכור האלקטרוכימי מהפוטנציוסטט וממערכת זרימת המים. הזרימו את גז החנקן לבקבוק המכיל DM עם 10 מילי-מולרי לקטט במשך 20 דקות כדי להסיר חמצן מהמדיום. כעת, לאט ובעדינות רבה, הסירו את כל הסופרנטנט מתוך הכור האלקטרוכימי באמצעות מזרק מתחת לגז חנקן זורם.לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר DM טרי המכיל 10 מילי-מולרי לקטט באמצעות מזרק. הטה את הכור האלקטרוכימי כדי להסיר את כל הסופרנטנט על דופן הכור. חזור על שלבים אלה שלוש פעמים בסך הכל.עצור את זרימת הגז וחבר שוב את הכור האלקטרוכימי לפוטנציוסטט, תוך הפעלת 0.4 וולט חיובי על אלקטרודת ה-ITO ב-303 קלווין. אשר כי הייצור הנוכחי מביופילם חד-שכבתי של Shewanella MR-1 יציב ואינו גדל במהירות. אם הזרם עולה בתלילות יש להמתין עד שהזרם יתייצב עם עלייה של 5% במשך 10 דקות.לאט ובעדינות רבה, הוסף 40 מיקרוליטר של D2O אנוקסי 50 אחוז נפח לכור האלקטרוכימי באמצעות מזרק כך שהריכוז יהיה 0.5 אחוז נפח D2O בכור. כדי למנוע נזק לביופילם על ידי תוספת D20, הזריק את ה-D2O טיפה. המתן עד שהזרם יתייצב ולאחר מכן הוסף את ה-D2O עד 4.4 אחוזי נפח כדי לקבל את ערך ה-KI, שהוא היחס בין הייצור הנוכחי והנוכחות של D2O ו-H2O.בדוק את ההשפעה של אותו נפח של תוספת H2O על הייצור הנוכחי. כאן, הקו המוצק הוא התוצאה המייצגת לשינוי הזרם המיקרוביאלי הנגרם על ידי תוספת D2O. תוספת של D2O הפחיתה בחדות את הזרם המיקרוביאלי תוך 10 שניות, בעוד של-H20 כמעט ולא הייתה ירידה בזרם כפי שמוצג בקו המקווקו.כדי לאשר כי הירידה הנצפית בזרם על ידי D2O מיוחסת להובלת אלקטרונים דרך ציטוכרומים של הממברנה החיצונית, נעשה שימוש במתווך אלקטרונים מפזר. כאן תוספת של 100 מיקרו-מולארי אלפא-AQS הגדילה את הייצור הנוכחי ביותר מפי חמישה והייצור הנוכחי נותר ללא השפעה מתוספת D2O. תוצאות אלו מצביעות על כך שהקינטיקה של התגובות המטבוליות מהירה מספיק כך שתהליך העברת האלקטרונים החוץ-תאי מגביל את הקצב.שיטה חלופית להערכת זה היא הוספת מולקולת הפלבין לכור האלקטרוכימי. עלייה מיידית בזרם אנודי על ידי תוספת פלבין מצביעה על הגבלת קצב על ידי תהליך הובלת האלקטרונים דרך ציטוכרומים של הממברנה החיצונית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבחון את השפעת האיזוטופ הקינטי על תהליך הובלת האלקטרונים החוץ-תאי.הנקודה הקריטית ביותר להשגת אפקט האיזוטופ הקינטי בהצלחה היא להבהיר ולאשר את המצב שבו הובלת האלקטרונים דרך ציטוכרומים של הממברנה החיצונית מגבילה את קצב ייצור הזרם. בסרטון זה, הצגנו שתי שיטות לאישור מצב זה, תצפית על השינוי הנוכחי על ידי הוספת פלבין ועל ידי הוספת מתווך נוסף מפזר, כגון אלפא-AQS. לאחר אישור מגבלת הקצב, ניתן להשתמש במערכת זו לא רק לניסוי הדאוטריום אלא גם לאפיון ביוכימי של ציטוכרומים של הממברנה החיצונית.יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות ישים לבחינת חיידקים אלקטרואקטיביים אחרים, כל עוד תהליך הובלת האלקטרונים החוץ-תאי מגביל את הקצב. המתודולוגיה שלנו מספקת טכניקה בסיסית וכללית לחקירת תהליך הובלת האלקטרונים החוץ-תאית באמצעות ציטוכרומים של הממברנה החיצונית in vivo.

electrochemical-detection-deuterium-kinetic-isotope-effect-on

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים שיטת assay חיישן אלקטרוכימי לגילוי חיידקים מהיר והזדהות. Assay כרוך מערך חיישנים פונקציונליות עם בדיקות ללכוד oligonucleotide DNA ל( rRNA) רצפי מינים ספציפיים ריבוזומלי RNA. הכלאה כריך של rRNA היעד עם הבדיקה ללכוד ובדיקת גלאי דנ"א oligonucleotide peroxidase צמודת חזרת מייצרת נוכחית amperometric למדידה.

גילוי חיידקים וזיהוי באמצעות חיישנים אלקטרוכימיים

מקור: Tokunou, Y., et al, זיהוי אלקטרוכימי של השפעת איזוטופ קינטי של דאוטריום על הובלת אלקטרונים חוץ-תאית ב - Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה אלקטרוכימית של תא שלם כדי להעריך כיצד העברת פרוטונים משפיעה על הובלת אלקטרונים חוץ-תאית (EET) בחיידקים אלקטרואקטיביים. על ידי החלפת פרוטונים בדאוטרונים באמצעות תחמוצת דאוטריום, השיטה מודדת שינויים בזרם כדי לחשוף אפקט איזוטופ קינטי, ומדגישה את תפקיד תנועת הפרוטונים בוויסות זרימת האלקטרונים.

מדידת השפעת האיזוטופ הקינטי על הובלת אלקטרונים מיקרוביאלית באמצעות תחמוצת דאוטריום

אקסוזומים הם מבנים מיקרו-שלפוחיתיים הנמצאים בתוך נוזלים ביולוגיים שעלולים לשאת סמנים ביולוגיים חשובים להבחנה בין מחלות. כאן, נעשה שימוש בשיטה חדשה כדי לחלץ אקסוזומים באופן ספציפי ולבדוק במהירות את המטען האקסוזומי עבור מטרות RNA/חלבון לאחר שיבוש האקסוזומים באמצעות גלים מרובעים חשמליים מחזוריים לא אחידים.

איתור של Exosomal ביומרקר על ידי שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM)

פרוטוקול למדידת מוליכות חשמלית של חיים חיידקים פתוגנים המועברים במזון תחת תנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית מוצג.

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

המטרה של פרוטוקול זה היא לפקח spectrophotometrically טרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תחבורה ניצול אלקטרון חוץ-תאית acceptors לנתח אנזימטי אינטראקציות העלולות להתעורר עם אלה acceptors אלקטרון חוץ-תאית.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

באתר מיקרוביאלי העשרה או בחיי עיר הטיפוח-תרגול טכניקות יכול להקל את ניתוקה של taxa חיידקים קשה-עד-תרבות, במיוחד של סביבות נמוך-ביומסה או geochemically קיצוני. כאן, אנו מתארים את הגדרת אלקטרוכימי של ללא שימוש במקור כוח חיצוני כדי להעשיר את זני חיידקים המסוגלים אלקטרון חוץ-תאית תחבורה (EET).

הגדרת אלקטרוכימי העומד בפני עצמו להעשיר respiring אנודת חיידקים באתר

פרוטוקול זה מציג בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה (AST) תוך 2.5 שעות על ידי הדמיית פיזור ראמן מגורה בתא יחיד של חילוף החומרים של D2O. שיטה זו חלה על חיידקים בשתן או בסביבת דם שלמה, שהיא טרנספורמטיבית עבור AST פנוטיפי מהיר של תא יחיד במרפאה.

בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן של שילוב דאוטריום בחיידק יחיד

כטכניקה אנליטית, אלקטרוכימיה ננו-אימפקנטית, גישה חשובה יותר ויותר לספירה ואפיון של חלקיקים אלקטרו-לא פעילים בקנה מידה ננומטרי, סובלת מדיוק ירוד בשל התפלגות הזרם ההטרוגנית הנובעת מהשימוש שלה באולטרה-מיקרואלקטרודות. מתוארת כאן גישה כללית, המכונה "הפרעה אלקטרוקטליטית", המשפרת את הדיוק במדידות כאלה.

גודל אלקטרוכימי מדויק של חלקיקים אלקטרו-לא פעילים בודדים

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון העברת אלקטרונים חוץ-תאית מתווכת (EET) בחיידקי חומצה לקטית באמצעות מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית בעלת שני תאים. אנו מדגימים שיטה זו עם Lactiplantibacillus plantarum ומתווך חמצון-חיזור 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid ומספקים תיאור יסודי של הטכניקות האלקטרוכימיות המשמשות להערכת EET מתווך.

אפיון מעבר אלקטרונים חוץ-תאי מתווך בחיידקי חומצה לקטית עם מערכת ביואלקטרוכימית תלת-אלקטרודתית דו-תאית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בטרנזיסטורים אלקטרוכימיים אורגניים (OECTs) כדי לתרגם פעילות העברת אלקטרונים חוץ-תאית (EET) ב- Shewanella oneidensis לאותות חשמליים. מערכת OECT ההיברידית מספקת חוסן, רגישות ופוטנציאל משופרים לבדיקות מהירות בעלות תפוקה גבוהה, מה שהופך אותה לכלי יעיל למדידות EET.

תרגום פעילויות מעבר אלקטרונים חוץ-תאיות באמצעות טרנזיסטורים אלקטרוכימיים אורגניים

חקור את תפקיד תחבורת הפרוטונים באלקטרון חוץ-תאית ב-Shewanella oneidensis MR-1 באמצעות אפקט איזוטופי קינטי של דאוטריום. שיטה זו חושפת את ההשפעה על קינטיקת ההעברה האלקטרונית בחיידקים חיים.

אלקטרוכימי זיהוי של דאוטריום קינטי איזוטופ אפקט על חוץ-תאית אלקטרון התחבורה מר Shewanella oneidensis -1

גלה סרטונים נוספים