שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות
May 31st, 2018
כאן אנו מציגים, ניגודיות שני פרוטוקולים נהגה decellularize רקמות הצמח: גישה מבוססת דטרגנט וגישה ללא חומרי ניקוי. שתי השיטות להשאיר מאחור את מטריצה חוץ-תאית של רקמות הצמח בשימוש, אשר אז יכול להיות מנוצל כמו פיגומים עבור יישומי הנדסת רקמות.
שיטות אלו יכולות לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-חומרים כגון פיתוח פיגום עם יכולות העברת נוזלים מצוינות עם אולטרה-מבנים מתוחכמים וייצור ניתן להרחבה. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שניתן ליישם אותן על רוב הצמחים לרקמות גזע ללא צורך בציוד מיוחד. ראשית, אספו דגימות טריות או קפואות של עלי F.hispida.
אחסן כל דגימה טרייה שנותרה במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. תן לעלה להישאר במים נטולי יונים בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס. השתמש באגרוף ביופסיה נקי כדי לחתוך את העלה לדיסקים בקוטר שמונה מילימטרים.
לאחר מכן, כדי לשטוף את דגימות העלים, דגרו אותן על צלחת טלטול במהירות נמוכה למשך חמש עד 10 דקות, במים נטולי יונים. לאחר מכן הכינו 10% משקל לפי נפח SDS במים נטולי יונים. לאחר הכנת תמיסת SDS, הניחו את דגימות העלים על צלחת פלסטיק.
לאחר מכן הוסף את תמיסת SDS כדי לכסות לחלוטין את הדגימות. מניחים את דגימות העלים הבולטים SDS, מכוסים, על צלחת ניעור כדי למנוע אידוי. לאחר מכן דגרו את דגימת העלים בטמפרטורת החדר למשך חמישה ימים.
לאחר חמישה ימי דגירה, החלף את תמיסת SDS במים נטולי יונים. דגרו את הדגימות שהושרו במים נטולי יונים למשך 10 עד 15 דקות על צלחת שייק. לאחר מכן, מערבבים חמישה מיליליטר של חומר פעילי שטח לא יוני עם 50 מיליליטר אקונומיקה.
הוסף תערובת זו ל -445 מיליליטר מים נטולי יונים. לאחר מכן יש את הדגימות בתמיסת האקונומיקה הטרייה הלא יונית שהוכנה. המשך להחליף את תמיסת האקונומיקה של פעילי שטח לא יוניים כל 24 שעות עד לניקוי הדגימות.
לאחר מכן השאירו את הדגימות המנוקות במים נטולי יונים למשך שתי דקות על צלחת ניעור. להסרת תאים ללא חומרי ניקוי, הכינו אקונומיקה בנפח של חמישה אחוזים בנפח בתמיסת נתרן ביקרבונט של 3% משקל בנפח. לאחר מכן, חממו את התמיסה ל-60 עד 70 מעלות צלזיוס על פלטה חמה בתוך קולט אדים.
ברגע שהתמיסה מגיעה לטמפרטורה הרצויה, יש להשרות את דגימות העלים. לאחר מכן הפחיתו את מהירות צלחת הערבוב כדי למנוע נזק לדגימות וחפשו את הדגימות שנוקו באופן גלוי והעבירו אותן מהאמבטיה בזהירות. לבסוף, דגרו את הדגימות במים נטולי יונים למשך דקה עד שתיים.
מכיוון שכל הדגימות שונות במהותן, מומלץ לבדוק את התקדמות הדה-סלולריזציה בערך כל 15 דקות כדי לוודא שהדגימות אינן נפגעות. פרמטרים של MTM, SAF ו-UTS נחקרים תחילה כדי לחקור את תכונות הפיגום הייחודיות של מיני P.aquatica ו-F.hispida. למעשה, כל שלושת הפרמטרים מציגים תכונות מכניות דומות הן בשיטות הדסלולריזציה המבוססות על חומרי ניקוי והן בשיטות ללא חומרי ניקוי.
עם זאת, המאפיין המכני של UTS של F.hispida מראה ערך ממוצע גבוה משמעותית באמצעות SDS ולא אקונומיקה לדה-סלולריזציה. תכולת ה-DNA הגנומית של מיני הצמחים המנוקים שנחקרו מופחתת משמעותית גם עם דה-סלולריזציה בהשוואה לדגימות הלא דה-סלולריות. לאחר מכן, הפעילות המטבולית של תירובלסטים עוריים אנושיים נמדדת גם בנוכחות פיגומי P.aquatica או Garcinia נטולי תאים.
מעניין שפיגומים על בסיס חומרי ניקוי גרמו להשפעה מופחתת על הפעילות המטבולית התאית, אך שטיפה עם מאגר Trishydrochloricde, ואחריו מדיום נטול סרום לאחר ניקוי SDS מפחיתה את ההשפעה על הפעילות המטבולית התאית בהשוואה לשטיפה במים נטולי יונים בלבד. לבסוף, הצמיחה של תאי הגזע המזנכימליים המוכתמים בסידן על פני השטח של מבנה העלה F.hispida מוצגת כאן. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקות אלה מסביבות שבעה ימים ועד 15 דקות בלבד כאשר הן מבוצעות כראוי.
בעת ביצוע הליכים אלה, חשוב לזכור לעקוב אחר הדגימות בזמן שהן מתפרקות מכיוון שהדגימות יכולות להשתנות מאצווה לאצווה, מה שעלול לגרום לזמני פינוי שונים. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם שיטות אחרות כגון דה-כימות או בדיקה מכנית כדי לענות על שאלות נוספות כגון באיזו מידה הדגימות מנוקות ולאילו רקמות אחרות הדגימות דומות מבחינה מכנית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סייעה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הנדסת הרקמות לייצר פיגומים הניתנים לביצוע.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע דה-סלולריזציה של רקמות צמחים לשימוש כפיגומים. אל תשכח שעבודה עם חומרי ניקוי ואדי אקונומיקה עלולה להיות מסוכנת ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן מתאים ושימוש במכסה אדים בעת ביצוע הליכים אלה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג ומשווה שני פרוטוקולים לדה-סלולאריזציה של רקמות צמחיות: גישה מבוססת חומר ניקוי וגישה ללא חומר ניקוי. שתי השיטות משמרות את המטריצה החוץ-תאית, אשר יכולות לשמש כשלדים ליישומי הנדסת רקמות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- חומרים ביולוגיים
- הנדסת רקמות
- ביולוגיה של צמחים
רקע
- טכניקות דה-סלולאריזציה הן חיוניות ליצירת שלדים.
- שלדים יכולים לשפר את יכולות העברת הנוזלים.
- ניתן ליישם שיטות אלו על רקמות גזע של צמחים שונות.
- אין צורך בציוד מיוחד לטכניקות אלו.
מטרת המחקר
- להשוות בין שיטות דה-סלולאריזציה מבוססות חומר ניקוי ושיטות ללא חומר ניקוי.
- להעריך את הפוטנציאל של מטריצות חוץ-תאיות מצמחים כשלדים.
- להתמודד עם אתגרים בפיתוח שלדים להנדסת רקמות.
שיטות בשימוש
- איסוף דגימות עלים טריות או קפואות של F.hispida.
- אחסון דגימות ב-20 מעלות צלזיוס.
- טבילת עלים במים מסוננים בטמפרטורה של 20 עד 25 מעלות צלזיוס.
- חיתוך העלים לדיסקים בקוטר שמונה מילימטרים באמצעות אגרוף ביופסיה.
תוצאות עיקריות
- שתי שיטות הדה-סלולאריזציה משמרות באופן יעיל את המטריצה החוץ-תאית.
- ניתן להשתמש בשלדים שנוצרו ביישומי הנדסת רקמות שונים.
- יכולות העברת הנוזלים של השלדים השתפרו.
- השיטות ניתנות להרחבה וחלות על רוב מיני הצמחים.
מסקנות
- טכניקות דה-סלולאריזציה מספקות שלדים קיימא להנדסת רקמות.
- לשתי השיטות יתרונות ייחודיים וניתן לבחור בהן בהתאם לצרכים ספציפיים.
- מחקר עתידי יכול לחקור יישומים נוספים של שלדים שמקורם בצמחים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Plant-derived scaffolds address critical biomaterials challenges in tissue engineering by offering scalable, biocompatible alternatives to autologous, synthetic, and animal-derived grafts. The described decellularization methods enable reproducible production of scaffolds with preserved extracellular matrix architecture, supporting fluid transfer and mechanical functionality essential for regenerative medicine applications. This positions plant-based systems as a strategic option for de-risking early-stage scaffold development in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of extracellular matrix contributions to scaffold biocompatibility and mechanical integrity.
- Operational Value: Provides standardized plant tissue preparation workflows applicable across species without specialized equipment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields scaffolds with quantifiable mechanical properties (UTS, MTM, SAF) for comparative biomaterial screening.
- Operational Value: Supports assay-ready scaffold production with low cellular metabolic impact, enabling reproducible cell-seeding experiments.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of human cell responses (e.g., dermal thyroblasts, mesenchymal stem cells) on plant-derived matrices.
- Operational Value: Offers dual-method flexibility (detergent-based vs. detergent-free) to optimize scaffold properties for specific tissue engineering endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
These decellularization methods integrate into the discovery continuum by providing preparatory scaffolds for cell-based assays, supporting progression from biomaterial screening to preclinical validation in tissue engineering workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding plant extracellular matrix suitability as a scaffold foundation.
- Screening: Delivers reproducible scaffolds with measurable mechanical and biological outputs for comparative evaluation.
- Analytics: Generates quantifiable data (genomic DNA reduction, metabolic activity, UTS) to inform scaffold selection criteria.
- Translational Research: Supports continuity from biomaterial discovery to preclinical testing via standardized scaffold production.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform-agnostic protocol adaptable to multiple plant species, enhancing resource efficiency across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in scaffold performance by decoupling cellular and extracellular matrix contributions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized incubation times, solution concentrations, and washing steps.
- Strategic Value: Lowers development barriers by eliminating need for specialized equipment, enabling broader lab adoption.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by providing scaffolds with tunable properties (e.g., UTS modulation via SDS vs. bleach).
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial handling and decellularization monitoring to prevent over-processing.
- Necessitates access to standard lab equipment (shake plate, hot plate, fume hood, biopsy punch) and reagents (SDS, bleach, sodium bicarbonate).
- Demands cross-team standardization of clearing endpoint assessment (e.g., visual inspection timing) to ensure batch consistency.
- Requires adaptation of incubation durations based on plant species and tissue thickness, as noted in sample variability observations.
- Involves safety considerations for handling detergents and bleach, including PPE use and fume hood operation during heated steps.
