Name: הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למד הכנת אוליגומרים של β-עמילואיד A11-חיוביים וניתוח כמותם בנקודה סופג. שיטה זו פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור למחקר נוירופרמקולוגי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (U1503223, 81673407, 21475131), פרויקט המחקר מיושם על טכנולוגיה ללא מטרות רווח של פרובינציית Zhejiang (2016C 37110), Ningbo הבינלאומי המדע והטכנולוגיה פרויקט (2014D 10019), הקבוצה חדשנות עירונית Ningbo של מדעי החיים ואת הבריאות (2015C 110026), Ningbo Sci & טק לפרויקט משותף עושר (ג 2017 50042), Li Dak סכום ייפ Yio הסנטר קנת Li ימית ביולוגיות פיתוח הקרן, וקרן ק ג וונג מגנה באוניברסיטת Ningbo.

1. פתרון הכנה
הערה: ראה טבלה של חומרים עבור ריאגנט מקורות.
<ol><li>להכין פתרון 5% אלבומין שור (BSA) על-ידי הוספת 5 g של BSA 100 מ של מים מזוקק פעמיים. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין פתרון A11 נוגדן אנטי אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של הפתרון BSA 5%. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין פתרון 6E10 נוגדן anti-Aβ (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין פתרון OC נוגדן anti-fibrillar אוליגומר (1:1, 000) על-ידי הוספת 10 µL של פתרון מניות נוגדן 10 מ"ל של 5% BSA פתרון. מערבבים אותם לחלוטין על-ידי vortexing. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להכין באגירה טריס מלוחים (TBS) מניות פתרון על-ידי הוספת 24 גרם של טריס בסיס ו- g 88 של NaCl 1,000 מיליליטר מים מזוקק פעמיים. להתאים את ה-pH ל 7.4. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד 3 חודשים.</li>
	<li>להכין תמיסת מלח באגירה טריס והפתרון Tween-20 (TBST) על-ידי הוספת 1 מ"ל של רצף-20 100 מ של TBS מניות פתרון ו- 900 מל מזוקק פעמיים מים.</li>
	<li>להכין פתרון נוגדנים משניים על-ידי הוספת 10 µL של חזרת peroxidase (HRP) העז נגד הארנב IgG (H + L) עד 10 מ"ל של פתרון TBST. לערבב אותם לחלוטין על-ידי vortexing אותם. אחסן את הפתרון ב 4 ° C עד כחודש.</li>
	<li>להמיס 3.68 g של כורכומין ב 1 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי ליצור פתרון מניות כורכומין 10 מ מ.</li>
	<li>להמיס 5 מ"ג של Aβ סינתטי1-42 ב- 2 מ של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-פרופנול (HFIP) כדי ליצור פתרון מונומר Aβ 2.5-מ"ג/מ"ל. מקום זה בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 20 דקות להפוך 100 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים. הערה: הליך זה אמורה לפעול מהר ככל האפשר. אמור לנתק את הטיפים פיפטה כדי להבטיח pipetting מדויק.</li>
	<li>להכנת נוזל electrochemiluminescence (ECL) על ידי ערבוב ECL נוזל A ו- B עם יחס נפח של 1:1. הפתרון צריך להיות מוכן רק לפני השימוש.</li>
</ol>2. הכנת הדוגמא
הערה: בצע את הכנת הדוגמא 2 ימים לפני הנקודה סופג ניתוח.
<ol><li>להוסיף µL 900 של מים מזוקק פעמיים שפופרת של Aβ1-42 מונומר פתרון; הריכוז של Aβ1-42 תהיה 0.25 מ"ג/מ"ל. מניחים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.</li>
	<li>להתנדף הפתרון עם גז חנקן טוהר גבוהה עד הנפח שלה µL עם-850. הריכוז של הפתרון1-42 Aβ יהיה על 0.29 מ"ג/מ"ל. הערה: הפתרון צריך מנערים מפעם לפעם כדי להבטיח ש-HFIP הוא התאדה במלואו. בדרך כלל, לאחר 30 דקות של אידוי, אמצעי האחסון של הפתרון שיורית נמצא µL עם-850.</li>
	<li>את הפתרון מניות כורכומין הפתרון עובד כורכומין (0.2 ו- 2 מיקרומטר) מדולל עם מים מזוקק פעמיים. מערבבים את פתרון1-42Aβ וכורכומין עובד פתרון עם יחס נפח של 1:1. הריכוזים הסופי של כורכומין יהיה 0.1 1 מיקרומטר. הערה: מעכבי אוליגומר פוטנציאלי יכול להיות מעורב עם הפתרון1-42 Aβ כל יחס במידת הצורך.</li>
	<li>לנער את הפתרון באופן רציף ב מסית מגנטי (ראה טבלה של חומרים).<ol>
<li>לתקן תיבה מפריד פלסטיק התועמלן מגנטי. מניחים 2 מגנטי מערבבים ברים ב 2 פינות של תיבת ולמקם הצינורות מדגם במרכז תיבת.</li>
		<li>לנער את תיבת בטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 48 שעות. הערה: המהירות של התועמלן מגנטי הוא בסביבות 60 סל ד.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifuge הצינורות במשך 15 דקות ב 4 ° C ו- g x 18,000 לאסוף תגובת שיקוע.</li>
</ol>3. נקודה סופג ניתוח
הערה: כל incubations המבוצעות מטרף אופקי.
<ol><li>חתוך ניטרוצלולוזה ממברנה לרצועות רחב 1 ס"מ. הערה: הרוחב של קרום ניטרוצלולוזה ניתן להתאים בהתאם לצרכים ניסיוני.</li>
	<li>במקום 2-µL דגימות באופן שווה על 2 רצועות (רצועת 1 ו- 2) עם כל מרווח נקודת-0.5 ס מ.</li>
	<li>מניחים את הרצועות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עד ה-droplet על הלהקה יבש.</li>
	<li>דגירה את הרצועות עם פתרון BSA 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>האחות הפתרון TBST. עבור h 1 בטמפרטורת החדר, דגירה רצועת 1 עם נוגדן אנטי אוליגומר A11 פתרון ולהפשיט 2 עם פתרון 6E10 של נוגדן anti-Aβ.</li>
	<li>לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>האחות הפתרון TBST. דגירה את הרצועות עם פתרון נוגדנים משניים עבור 40 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את הרצועות עם פתרון TBST שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>באופן שווה להחיל את הנוזלים ECL מעורב השטח של הרצועות. לחשוף את הרצועות ב chemiluminescence אוטומטית מערכת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). הערה: בדרך כלל, µL 300 של נוזל ECL מספיקה ממברנה אחת. הקרום חייב להישמר לח במהלך החשיפה. זמן החשיפה מחושבת באופן אוטומטי על ידי מערכת הדמיה.</li>
	<li>לעשות ניתוח גווני אפור באמצעות ImageJ (המכון הלאומי לבריאות) או תוכנות עיבוד תמונה אחרת כדי להשיג תוצאות כמותיות למחצה.</li>
</ol>

<ol><li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li>
<li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/biophysj/comments/S0006-3495(16)33411-7">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444(2017).</li>
<li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Alzheimer%27s+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol%3A+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li>
<li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis%28heptyl%29-cognitin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256(2015).</li>
<li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li>
<li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer%27s+A+beta-%281-42%29+peptide+in+aqueous+media+is+reversible%3A+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li>
<li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1%2C1%2C1%2C3%2C3%2C3-hexafluoro-2-propanol%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li>
<li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li>
<li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxycyclopenicillone%2C+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260(2017).</li>
<li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Food+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה, אנחנו דיווחו שיטה להכין דגימות המכיל Aβ1-42 אוליגומר, וכדי לנתח כמויות A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר ידי נקודה סופג ניתוח. למרות השיטות שלנו עבור הכנת Aβ1-42 אוליגומר עשיר דגימות די פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור, ישנם עדיין כמה נקודות כדי שישימו לב אלינו. ראשית, HFIP משמש כדי להמיס את פפטיד1-42 Aβ סינתטי. פפטיד1-42 Aβ צבור יכול לפרק לתוך מונומר בפתרון HFIP. עם זאת, HFIP קל התנדפות, צמיגות של HFIP הוא נמוך מאוד. לכן, צריך להיות מומס פפטיד1-42 Aβ לתו...

מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת ממחלות ניווניות החשוב ביותר המשפיעים על קשישים ברחבי העולם1. מקובל כי הצבירה חריגה של β-עמילואיד (Aβ) עשוי להיות הגורם המוביל פתולוגי של AD. Aβ אגרגטים הם המרכיבים העיקריים של הפלאק סנילי, אחד סמנים ביולוגיים במוחם של חולי אלצהיימר. יתר על כן, אגרגטים Aβ, כולל oligomers בפרט, לייצר neurotoxicity חזק, אשר עשוי להיות הגורם למוות עצביים התקדמות לספירה. לכן, עיכוב של היווצרות אוליגומר Aβ עשוי למנוע הקשורים ניוון מוחיים, Aβ אוליגומר מעכבי יכול להתפתח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. מחקרים רבים השתמשו פפטיד Aβ סינתטי כדי ליצור oligomers חוץ גופית בתוך, מורפולוגיות ו מבנים של oligomers Aβ מלאכותיים, ולחקור את מעכבי של Aβ אוליגומר באמצעות במבחנה מודלים2,3 , 4. עם זאת, שונה במבחנה היווצרות הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל אוליגומר עם מאפיינים מורפולוגיים שונים, אשר עלול לגרום התוצאות למחפשי בקרב קבוצות מחקר שונות. לכן, עבור Aβ אוליגומר פרוטוקול סטנדרטי היווצרות דרוש בדחיפות.
עד עכשיו, שיטות רבות לא דווחו ישירות לאתר Aβ oligomers. שידור מיקרוסקופיה אלקטרונית (TEM) שאינם denaturing בג'ל, מקושרים-אנזים immunosorbent assay (אליסה), נקודה סופג ניתוח יכול לשמש כדי לבחון את כמות ו/או המורפולוגיה של Aβ אוליגומר במבחנה5, 6. לדוגמה, המורפולוגיה ואת המבנה של Aβ אוליגומר יכול להיות שנצפו ב- TEM. כמויות יחסיות והגודל המולקולרי של הסיכומים Aβ יכול להימדד על-ידי-denaturing בג'ל. אליסה יכול לשמש כדי לקבוע Aβ אוליגומר סרום, פלזמה, תמציות של רקמת המוח. לבסוף, נקודה סופג ניתוח, טכניקה המשמשת לזיהוי, ניתוח וזיהוי של חלבונים, ניתן להשתמש כדי להעריך את הריכוז היחסי של Aβ אוליגומר בדגימות שונות בעזרת נוגדנים אוליגומר וספציפיות Aβ. יתר על כן, נקודה סופג assay מציעה חיסכון משמעותי בזמן, בג'ל וההליכים blotting ג'לים אינם נדרשים. לכן, assay זה משמש בדרך כלל כדי מסך פוטנציאלי Aβ אוליגומר מעכבי. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה יחסית פשוטה, אמינים ובעלי לשחזור להכין דוגמה אוליגומר עשיר1-42 . Aβ, כדי לנתח את הכמויות של Aβ1-42 אוליגומר על ידי dot סופג ניתוח, וכדי מסך Aβ אוליגומר מעכבי באמצעות תוצאות ניסויי למחצה כמותית.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb לאוליגומרים עמילואידים)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (בטא-עמילואיד ארנב Ab)</td><td>תא&nbsp; טכנולוגיית איתות</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (נוגדן אנטי-עמילואיד סיבים OC)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>חזרת פרוקסידאז (HRP) סמן עז נגד ארנב IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&beta; 1-42</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; דימתיל סולפוקסיד</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5 פעמים; ג'ל ללא דנטורציה PAGE סמן חלבון</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>ניטרוצלולוז טהור ממברנה</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>טווח נמוך במיוחד&nbsp; סמן חלבון</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות העברה</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue פתרון צביעה מהיר</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>הכל - מערכת הדמיה כימילומינסנציה אוטומטית</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National מכוני בריאות</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד תמונה</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>מערבל מגנטי</td><td>שנחאי Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה a11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Β-עמילואיד (Aβ) הוא פפטיד הידרופוביות עם נטייה מהותי בעצמם לתוך אגרגטים. בין אגרגטים שונים, Aβ אוליגומר מקובל כמו עצבי מוביל בההתקדמות של מחלת אלצהיימר (AD), נחשבת לאירוע מכריע בפתוגנזה של המודעה. לכן, Aβ אוליגומר מעכבי יכול למנוע הקשורים ניוון מוחיים ו יש את הפוטנציאל להיות מפותח כמו מחלות שינוי טיפולי של AD. עם זאת, צורה שונה הפרוטוקולים של Aβ אוליגומר עלול להוביל oligomers עם מאפיינים שונים. יתר על כן, אין שיטות רבות מעכבי אוליגומר מסך ביעילות1-42 Aβ. נוגדן A11 יכולה להגיב עם ערכת משנה של רעילים אוליגומר1-42 Aβ במבנים β-גיליון אנטי-מקביל. ב פרוטוקול זה, אנו מסבירים כיצד להכין דוגמה אוליגומר עשיר A11-חיוביות Aβ1-42 סינתטי Aβ1-42 פפטיד במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר בדגימות מאת סופג נקודה ניתוח באמצעות A11 ו Aβ1-42-נוגדנים ספציפיים 6E10. באמצעות פרוטוקול זה, מעכבי של A11-חיוביות Aβ1-42 אוליגומר יכולים גם להיות מוקרן מתוצאות הניסוי הכמותיים למחצה.

כדי לבדוק אם מונומר1-42 Aβ יכול ליצור אוליגומר1-42 של Aβ לאחר הכנה, שימש ניתוח TEM. אין אגרגטים גלוי נצפו במדגם מומס HFIP Aβ1-42 מונומר (איור 1א'). יתר על כן, אגרגטים בעיקר הכדוריים בקוטר של סביב 10-80 ננומטר נצפו במדגם1-42 Aβ לאחר 48 שעות של טלטולים, רומז כי Aβ1-42 טפסים oligomers לאחר הכנה (איור 1B).
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-פרמקולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור ליצירת אוליגומר בטא-עמילואיד. אנו מראים שהדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבים להכנת אוליגומר בטא.ראשית, התאם את ריכוז תמיסת המונומר A-beta ל-0.25 מיליגרם למיליליטר על ידי הוספת 900 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים לשפופרת. לאחר מכן המשיכו לאדות את תמיסת המונומר בגז חנקן בטוהר גבוה עד שהנפח מגיע לכ-850 מיקרוליטר בריכוז של כ-0.29 מיליגרם למיליליטר. נוכחותו של HR5P משפיעה על היווצרות אוליגומר A-beta.לכן, אידוי ככל האפשר הוא שלב קריטי בהליך זה. לאחר מכן, השתמשו במים מזוקקים כפולים כדי לדלל את תמיסת מלאי הכורכומין כדי להכין תמיסה עובדת של 0.2 ושתי מיקרומולר. שמרו על יחס של אחד לאחד וערבבו את תמיסת ה-A-בטא עם כורכומין כדי להשיג את הריכוז הסופי של כורכומין ב-0.1 ומיקרו-טוחנת אחת.לאחר מכן, השאירו את התמיסה על מערבל מגנטי. חבר קופסת מחיצה מפלסטיק לתסיסה המגנטית. מקם שני מוטות ערבוב מגנטיים בשתי פינות הקופסה, ולאחר מכן הנח את הצינורות עם הדגימות במרכז הקופסה.המשך לנער את הקופסה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות ב 60 סיבובים לדקה, ואז צנטריפוגה את הצינור ב 18, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט. לניתוח ספיגת נקודות, קח קרום ניטרוצלולוזה וחתוך אותו לרצועות ברוחב סנטימטר אחד, ואז הניח שני מיקרוליטר מהדגימה באופן שווה על הרצועות אחת ושתיים עם כל מרווח נקודה ב -0.5 סנטימטרים.כאשר משפריצים את הדגימה על הממברנה, יש צורך להתפשט באופן שווה והטיפות השונות נשלטות כך שהדגימות השונות אינן מקושרות זו לזו. לאחר מכן, דגרו את הרצועות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי שהטיפות יתייבשו. לאחר חמש דקות, דגרו את הרצועות עם אלבומין סרום בקר 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סיום הדגירה, שטפו את הרצועות עם מאגר TBST למשך חמש דקות. שאפו את המאגר לאחר סיום הכביסה, ולאחר מכן דגרו על אחד עם נוגדן אנטי-אוליגומר A11 והפשיטו שניים עם תמיסת נוגדן אנטי-A-בטא 6E10 למשך שעה. לאחר שעה, שטפו את הרצועות עם TBST במשך חמש דקות כל אחת שלוש פעמים, ואז שאפו את המאגר ודגרו על הרצועות בתמיסת נוגדנים משנית למשך 40 דקות.לאחר הדגירה המשנית של הנוגדנים, יש לשטוף שוב את הרצועות עם TBST למשך חמש דקות כל אחת שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף כ-300 מיקרוליטר של נוזל ECL מעורבב לפני השטח של הרצועות הלחות, ולאחר מכן חשוף את הרצועות במערכת הדמיה כימילומינסנציה אוטומטית. מחקרי TEM מראים היעדר אגרגטים גלויים בתמיסת מונומר A-beta המומס על ידי HFIP, אולם לאחר 48 שעות דגירה, אותו מונומר יוצר אוליגומרים, שהם בעיקר אגרגטים כדוריים בקוטר של 10 עד 80 ננומטר.בהכפפת מונומר A-beta ודגימות עשירות באוליגומרים לניתוח כתמי נקודות, הוא מראה נוכחות של אוליגומרים A-beta חיוביים A11 בדגימות עשירות באוליגומרים A-beta. מעניין שפפטידים חיוביים של A-beta 6E10 קיימים הן במונומר A-beta והן בדגימות עשירות באוליגומר. לאחר מכן, נעשה גם ניתוח כמותי למחצה כדי לבטא את המונומר הספציפי A-beta חיובי לנוגדנים ודגימות עשירות באוליגומרים כאחוז בקרה.פפטידים חיוביים A-beta A11 גבוהים משמעותית בדגימות עשירות באוליגומרים A-beta בהשוואה למונומרים. להיפך, פפטיד A-beta 6E10 חיובי A-beta קיים הן בדגימות המונומר והן בדגימות העשירות באוליגומר. למעשה, אוליגומרים A-beta מודגרים גם במשותף עם כורכומין ומעכב אוליגומר A-beta.כורכומין מוביל להפחתה משמעותית בכמות היחסית של אוליגומר A-בטא חיובי ל-A11 עם ירידה בצביעת A11 בדגימות אוליגומר A-בטא שהודגרו במשותף. עם זאת, ריכוזים משתנים של כורכומין אינם משפיעים על מספר פפטידי A-beta בדגימות המונומר החיובי 6E10 והדגימות העשירות באוליגומרים בהשוואה לדגימות A11 חיוביות. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא פועלת כראוי.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור תרופות מועמדות להפרעות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין אוליגומר A-beta ולהעריך את כמותו.

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

אנו מתארים טכניקה להכנת הבהיר homogenates קליפת המוח האנושי, הפרדת חלבונים על ידי SDS-PAGE, אחזור אנטיגן ו immunoblotting עם נוגדן ל הפפטיד Aβ. שימוש בפרוטוקול זה, אנו באופן עקבי לזהות Aβ monomeric ו multimeric ברקמת קליפת המוח של בני אדם עם פתולוגיה אלצהיימר.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

Aptamers הם ribo-/deoxyribo-oligonucleotides קצר נבחר על...

מבחר Aptamers עבור חלבון β עמילואיד, הסוכן סיבתי של מחלת אלצהיימר

סרטון זה מדגים את ההפרדה הדו-ממדית המבוססת על אלקטרופורזה של סיבי עמילואיד, ג'ל אגרוז. הטכניקה מפרידה את צברי העמילואיד הפולימורפיים בהתבסס על גודלם ההטרוגני.

אלקטרופורזה דו-ממדית למחצה של ג'ל אגרוז: טכניקה להפרדת סיבי עמילואידים פולימורפיים בהתבסס על הטרוגניות הגודל

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם<em&gt; במבחנה</em

באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי בשילוב עם טכנולוגיית ביו-פאנינג יצרנו מערכת ביו-פאנינג שלילית וחיובית לרכישת נוגדנים כנגד וריאנטים חלבונים ספציפיים למחלה הנמצאים בכל חומר ביולוגי, אפילו בריכוזים נמוכים.  הצלחנו להשיג נוגדנים לגרסאות חלבון TDP-43 המעורבות בטרשת אמיוטרופית צידית.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

שיטות פשוטות מתוארים על הפגנת הייצור של amyloids ציטוטוקסיות בעקבות זיהום של אנדותל ריאתי על ידי Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

פרוטוקול מפורט לטיהור וניתוח מאוחר יותר של נוגדן חד שבטיים מתוך נוזל שנקטפו לתרבות התא (HCF) של microbioreactors חקנים אוטומטיים תוארה. השימוש בניתוח כדי לקבוע תכונות איכות קריטיות (CQAs) ולמקסם את נפח מדגם מוגבל כדי לחלץ מידע חיוני מוצג גם.

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

כאן אנו מציגים פרוטוקול להערכת רמות m⁶A גלובליות באופן חצי-כמותי באמצעות נקודת כתם נקודות. ה-RNA הכולל מופק, מנותק, מנוקד על ממברנת ניילון, נבדק בנוגדן אנטי-m⁶A, ומוצג באמצעות כימילומינסנציה. עוצמת האות, שנמדדה על ידי ניתוח גווני אפור של ImageJ, משקפת שפע מתילציה יחסי, ומספקת זרימת עבודה ניתנת לשחזור למחקר.

בדיקת נקודת כתם לזיהוי רמות שינוי RNA גלובליות של N 6-מתילאדנוזין

למד הכנת אוליגומרים של β-עמילואיד A11-חיוביים וניתוח כמותם בנקודה סופג. שיטה זו פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור למחקר נוירופרמקולוגי.

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

גלה סרטונים נוספים