הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח
22 במאי 2018
פרוטוקול זה מתאר כיצד להכין oligomers Aβ פפטיד סינתטי במבחנה וכן להעריך כמויות יחסיות של אוליגומר Aβ על ידי נקודה סופג ניתוח.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-פרמקולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, אמינה וניתנת לשחזור ליצירת אוליגומר בטא-עמילואיד. אנו מראים שהדגמה של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד שלבים להכנת אוליגומר בטא
.ראשית, התאם את ריכוז תמיסת המונומר A-beta ל-0.25 מיליגרם למיליליטר על ידי הוספת 900 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים לשפופרת. לאחר מכן המשיכו לאדות את תמיסת המונומר בגז חנקן בטוהר גבוה עד שהנפח מגיע לכ-850 מיקרוליטר בריכוז של כ-0.29 מיליגרם למיליליטר. נוכחותו של HR5P משפיעה על היווצרות אוליגומר A-beta.
לכן, אידוי ככל האפשר הוא שלב קריטי בהליך זה. לאחר מכן, השתמשו במים מזוקקים כפולים כדי לדלל את תמיסת מלאי הכורכומין כדי להכין תמיסה עובדת של 0.2 ושתי מיקרומולר. שמרו על יחס של אחד לאחד וערבבו את תמיסת ה-A-בטא עם כורכומין כדי להשיג את הריכוז הסופי של כורכומין ב-0.1 ומיקרו-טוחנת אחת.
לאחר מכן, השאירו את התמיסה על מערבל מגנטי. חבר קופסת מחיצה מפלסטיק לתסיסה המגנטית. מקם שני מוטות ערבוב מגנטיים בשתי פינות הקופסה, ולאחר מכן הנח את הצינורות עם הדגימות במרכז הקופסה.
המשך לנער את הקופסה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות ב 60 סיבובים לדקה, ואז צנטריפוגה את הצינור ב 18, 000 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הצנטריפוגה, אספו את הסופרנטנט. לניתוח ספיגת נקודות, קח קרום ניטרוצלולוזה וחתוך אותו לרצועות ברוחב סנטימטר אחד, ואז הניח שני מיקרוליטר מהדגימה באופן שווה על הרצועות אחת ושתיים עם כל מרווח נקודה ב -0.5 סנטימטרים.
כאשר משפריצים את הדגימה על הממברנה, יש צורך להתפשט באופן שווה והטיפות השונות נשלטות כך שהדגימות השונות אינן מקושרות זו לזו. לאחר מכן, דגרו את הרצועות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות כדי שהטיפות יתייבשו. לאחר חמש דקות, דגרו את הרצועות עם אלבומין סרום בקר 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר סיום הדגירה, שטפו את הרצועות עם מאגר TBST למשך חמש דקות. שאפו את המאגר לאחר סיום הכביסה, ולאחר מכן דגרו על אחד עם נוגדן אנטי-אוליגומר A11 והפשיטו שניים עם תמיסת נוגדן אנטי-A-בטא 6E10 למשך שעה. לאחר שעה, שטפו את הרצועות עם TBST במשך חמש דקות כל אחת שלוש פעמים, ואז שאפו את המאגר ודגרו על הרצועות בתמיסת נוגדנים משנית למשך 40 דקות.
לאחר הדגירה המשנית של הנוגדנים, יש לשטוף שוב את הרצועות עם TBST למשך חמש דקות כל אחת שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף כ-300 מיקרוליטר של נוזל ECL מעורבב לפני השטח של הרצועות הלחות, ולאחר מכן חשוף את הרצועות במערכת הדמיה כימילומינסנציה אוטומטית. מחקרי TEM מראים היעדר אגרגטים גלויים בתמיסת מונומר A-beta המומס על ידי HFIP, אולם לאחר 48 שעות דגירה, אותו מונומר יוצר אוליגומרים, שהם בעיקר אגרגטים כדוריים בקוטר של 10 עד 80 ננומטר.
בהכפפת מונומר A-beta ודגימות עשירות באוליגומרים לניתוח כתמי נקודות, הוא מראה נוכחות של אוליגומרים A-beta חיוביים A11 בדגימות עשירות באוליגומרים A-beta. מעניין שפפטידים חיוביים של A-beta 6E10 קיימים הן במונומר A-beta והן בדגימות עשירות באוליגומר. לאחר מכן, נעשה גם ניתוח כמותי למחצה כדי לבטא את המונומר הספציפי A-beta חיובי לנוגדנים ודגימות עשירות באוליגומרים כאחוז בקרה.
פפטידים חיוביים A-beta A11 גבוהים משמעותית בדגימות עשירות באוליגומרים A-beta בהשוואה למונומרים. להיפך, פפטיד A-beta 6E10 חיובי A-beta קיים הן בדגימות המונומר והן בדגימות העשירות באוליגומר. למעשה, אוליגומרים A-beta מודגרים גם במשותף עם כורכומין ומעכב אוליגומר A-beta.
כורכומין מוביל להפחתה משמעותית בכמות היחסית של אוליגומר A-בטא חיובי ל-A11 עם ירידה בצביעת A11 בדגימות אוליגומר A-בטא שהודגרו במשותף. עם זאת, ריכוזים משתנים של כורכומין אינם משפיעים על מספר פפטידי A-beta בדגימות המונומר החיובי 6E10 והדגימות העשירות באוליגומרים בהשוואה לדגימות A11 חיוביות. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות אם היא פועלת כראוי.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור תרופות מועמדות להפרעות ניווניות כמו מחלת אלצהיימר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין אוליגומר A-beta ולהעריך את כמותו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הכנתו של אוליגומרים של Aβ מפפטיד סינתטי in vitro ואת הערכת הכמויות היחסיות שלהם באמצעות אנליזת dot blotting. שיטה זו היא פשוטה, מהימנה וניתנת לשחזור, מה שהופך אותה לחיונית למחקר נוירו-פארמקולוגי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- נוירופארמקולוגיה
- ביוכימיה
רקע
- אוליגומרים של Aβ מעורבים במחלות ניו روندגנרטיביות.
- הבנת תהליך היווצרותם חיונית לפיתוח טיפוליים.
- השיטות הנוכחיות להכנת אוליגומרים אלו עשויות להיות מורכבות.
- פרוטוקול זה נועד לפשט את התהליך עבור חוקרים.
מטרת המחקר
- מתן שיטה מהימנה להכנת אוליגומרים של Aβ.
- הקלה על הערכת ריכוזי האוליגומרים.
- שיפור השחזוריות בניסויי נוירו-פרמקולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התאמת ריכוז ה-A-beta monomer ל-0.25 mg/mL.
- אידוי התמיסה באמצעות גז חנקן בדרגת טוהר גבוהה.
- ניטור השפעות ה-HR5P על היווצרות אוליגומרים.
- שימוש בניתוח dot blotting לצורך הערכה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מייצרת בהצלחה אוליגומרים של Aβ.
- ניתוח Dot blotting מכמת ביעילות את כמויות האוליגומרים.
- נוכחות של HR5P משפיעה באופן משמעותי על היווצרות האוליגומרים.
- הפרוטוקול מפגין אמינות ושחזוריות גבוהות.
מסקנות
- פרוטוקול זה מפשט את הכנת האוליגומרים של Aβ.
- הוא מספק כלי בעל ערך למחקר נוירו-פארמקולוגי.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה אמינה זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה וכמתור מדויקת של אוליגומרים של $\beta$-amyloid חיוביים ל-A11 הן קריטיות לאישור מטרות בשלבים מוקדמים של ניוון עצבי ולסריקת מעכבים במחקר של מחלת האלצהיימר. פרוטוקול זה מאפשר ייצור הדיר והערכה חצי-כמותית של מינים אוליגומריים רעילים, ובכך תומך בביטחון חיזוי בבדיקת היפותזות טיפוליות. השיטה נותנת מענה ישיר לנקודת מפנה מרכזית לצמצום סיכונים מכניסטיים ותעדוף תיקי פיתוח במחקר ופיתוח נוירו-פארמקולוגי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היווצרות אוליגומרים של β-amyloid כמניע מכניסטי בפתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מינים נוירוטוקסיים באמצעות הספציפיות של הנוגדן A11.
- מסייע בהפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות המכוונות לעיכוב אוליגומרים.
- מספק תהליך עבודה הניתן לשחזור לצורך ניתוח השוואתי של מעכבים פוטנציאליים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכין דגימות מתוקתקות עשירות באוליגומרים עבור קמפיינים של סריקת מעכבים בשלבים הבאים.
- מספק תוצרי dot blot חצי-כמותיים עבור קריאות בדיקה סטנדרטיות.
- מאפשר זיהוי בר-שחזור של אוליגומרים חיוביים ל-A11 לצורך הערכת תרכובות.
- תומך ביכולת הרחבה (scalability) ובשימוש חוזר בפלטפורמה בצינורות סריקה של ניוורו-דגנרציה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את אפיון האוליגומרים במערכת in vitro עם מינים נוירוטוקסיים הרלוונטיים למחלה.
- מספק רציפות משלב התיקוף של שלב הגילוי ועד להערכת מעכבים פרה-קלינית.
- מאפשר קידום מותאם-סיכונים של מולקולות מועמדות בהסתמך על ראיות מכניסטיות.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים עבור התערבויות המכוונות לאוליגומרים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי המולקולות המובילות (lead identification), ובכך מאפשר בדיקה חסונה של היפותזות ופיתוח תבחיני בדיקה (assays) עבור פורטפוליו של מחלות ניוורו-דגנרטיביות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בתיקוף מכניסטי של רעילות אוליגומרים של β-amyloid והשפעות מעכבים.
- סריקה: מספקת תוצרי dot blot סטנדרטיים וחצי-כמותיים עבור תהליכי עבודה של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת כימות השוואתי של מינים חיוביים ל-A11 ו-6E10 לצורך קבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הערכת אוליגומרים in vitro למודלים של נוירוטוקסיות הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פרוטוקול הניתן לשחזור ולהרחבה עבור יוזמות מחקר מתמשכות בתחום הניו روندגנרציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה והפחתת סיכונים מכניסטיים עבור מחלת האלצהיימר.
- ערך תפעולי: מספק הכנה וכימות סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה של אוליגומרים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי מתן אפשרות לסריקת מעכבים חסונה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפול בניוון עצבי.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בפפטידים ובטכניקות של זיהוי אימונולוגי.
- נדרשת גישה לציוד ל-dot blotting ולמערכות דימוי כימילומניסצנציה.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת שחזור של הכנת הדגימות והניתוח.
- ניתן להתאמה למועמדים שונים של מעכבים ולמערכות פפטידים אוליגומריים.
- תלוי בספציפיות של הנוגדנים ובמגבלות של ניתוח חצי-כמותי.
