דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלבלב על ידי שימוש בלבלב אלה כדי להבין כיצד תאים אנדוקריניים נוצרים בסביבה מורכבת מבחינה ארכיטקטונית ותאית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהלבלב מפתח תאים אנדוקריניים עקב הכללת המזנכימה שמסביב. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהלבלב קטן מאוד ב-e10.5.

והדיסקציה חיונית להיווצרות הלבלב כדי לקבל מספיק רקמה לא מזהמת. כדי להתכונן לדיסקציה, מלאו דלי קרח והניחו מיכל של מי מלח חוצצים פוספט בקרח. נקה שני מלקחיים עדינים ומספריים לדיסקציה עם 70% אתנול.

בסמוך לאזור הדיסקציה, הגדר מיכל עם לפחות שלושה צינורות נימי בורוסיליקט, מצית וקצות פיפט מסוננים של 1000 מיקרוליטר. לאחר מכן, פיפט לפחות מיליליטר אחד של 1.25 מיליגרם למיליליטר דיספאז קר מדולל במים מעוקרים בבאר השנייה של צלחת של 12 בארות על קרח. פיפט PBS בבאר הראשונה, השלישית והרביעית של צלחת 12 הבארות.

כמו כן, פיפט מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר המתת חסד של עכברים בהריון מתוזמן e10.5 בהתאם להנחיות IACUC, יש לרסס את הבטן באתנול 70% כדי לנקות את האזור. לאחר מכן, בצע חתך בצורת V באזור איברי המין של העכבר באמצעות מספריים ומלקחיים והמשך את החתך עד לסרעפת.

כרתו בזהירות את הרחם על ידי ביצוע חתך בחלקים הצדדיים העליונים של הרחם, משיכת האיבר כלפי מעלה הרחק מהעכבר ובעקבות חתך זה עד לאזור איברי המין לפני שתחזרו על הצד הנגדי. מניחים את הרחם הכרות בצלחת פטרי של 10 סנטימטר עם ה-PBS הקר. תחת מיקרוסקופ דיסקציה קלה, הניחו את צלחת הפטרי ופתחו בזהירות את רקמת הרחם על ידי הנחת שני מלקחיים בין כל עובר וקילוף רקמה הרחק משק החלמון.

העבירו את העוברים על ידי אחיזת שק החלמון בעדינות בעזרת מלקחיים והנחתם בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים עם PBS טרי וקר. מניחים את צלחת הפטרי על קרח. לאחר מכן, הניחו מספר טיפות PBS על מכסה צלחת הפטרי בגודל 10 סנטימטרים.

השתמש בטיפות אלה כדי להעביר את העובר במהלך הדיסקציה כאשר רקמות חוץ-עובריות מוסרות כדי להבטיח נראות. העבירו עובר לטיפת PBS והוציאו אותו בעדינות משק החלמון באמצעות מלקחיים בזמן שהעוברים הנותרים נשארים ב-PBS על קרח. הסר את הראש לפני העברת העובר לטיפת PBS חדשה באמצעות מלקחיים כדי לגרוף קלות את העובר מבלי לפגוע ברקמה.

בטיפת PBS חדשה, הסר את ארבעת ניצני הגפיים באמצעות מלקחיים. הנח את המלקחיים לתוך הפתח שבו היה ניצן הגפיים וקרע בעדינות רק את הרקמה החיצונית ביותר מלפנים. סובב את העובר וחזור על הפעולה בכיוון האחורי, ועצר בניצן הגפה האחורית.

בשלב זה, מערכת העיכול צריכה להיות גלויה. לאזור האחורי של מערכת העיכול יש כיפוף קל; הכנס מלקחיים מאחורי עיקול זה בפתח שבין מערכת העיכול לאזור עמוד השדרה בדופן הגוף. נתק את מערכת העיכול, עבד לאט כלפי מעלה עד שמגיעים לאזור הקדמי ביותר, שם אזור הלב מתחבר.

בשלבים הבאים, חשוב להימנע מהרקמה שמסביב בתרבית, כדי לא לזהם את הלבלב ברקמה שאינה לבלב. עם זאת, אם לא תתפוס את כל ניצן הלבלב, אז מספר וגודל הלבלב ייפגעו. העבירו את מערכת העיכול לטיפה הטרייה PBS.

המשך להסיר את הרקמה החיצונית המקיפה את מערכת העיכול. לאחר הסרת הרקמה החיצונית הזו, ניתן לדמיין את ניצן הלבלב אחורי לניצני הכבד, בין הקיבה למעי. לאחר מכן, קחו מלקחיים וצבטו בעדינות את הרקמה מתחת לניצן הבולט במעי והרימו מעט את ניצן הלבלב.

לאחר צביטה של האזור בו הניצן מתחבר למעי, הניצן מופרד. שטפו פעם אחת בבועת PBS חדשה לפני העברת הניצן לבאר הראשונה של צלחת 12 הבארות ו-PBS קר על קרח. חזור על הפעולה עד שכל הניצנים נאספים מהעוברים ומונחים בבאר הראשונה של צלחת 12 הבארות.

לאחר מכן, הניחו את צלחת 12 הבארות מתחת למיקרוסקופ דיסקציה קלה. ספרו את מספר ניצני הלבלב שנותחו בהצלחה כדי לחשב מאוחר יותר את יחס הפיצול. הנח קצה פיפט מסונן של 1000 מיקרוליטר לתוך הפיפט כשצינור הנימים מחובר.

להבה מעקרים את צינור הנימים ויוצרים עיקול בצינור לנוחות השימוש. השתמש בנימים כדי להעביר את הניצנים לבאר השנייה המכילה תמיסת דיספאז קרה למשך שתי דקות לפני העברתם לבאר השלישית המכילה PBS נקי. זרקו את הניצנים למעלה ולמטה והעבירו אותם לבאר הרביעית המכילה PBS נקי.

לבסוף, באמצעות המכשיר הנימים, העבירו את הניצנים לצינור של 1.5 מיליליטר עם 0.05% טריפסין. מניחים את הצינור בשייקר שחומם מראש 37 מעלות צלזיוס ומנערים בחום של 1,500 סל"ד למשך ארבע עד חמש דקות. לאחר מערבולת של כ-10 שניות, הכניסו מיד את הצינור לצנטריפוגה וסובבו במשך חמש דקות ב-200 גרם.

הסר בזהירות את כל התמיסה מלבד כ -50 מיקרוליטר כדי לא להפריע לתאים הצנטריפוגים. עבור כל ניצן שנאסף ב-400 מיקרוליטר של מדיה אורגנוגנזה לתאים הצנטריפוגים, מערבולת דופק שלוש פעמים וצלחת 100 מיקרוליטר לבאר של צלחת 96 בארות עם חיבור נמוך, תוך פיצול ניצנים ביחס של אחד לארבעה. בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לדמיין תאים מנותקים צפים בחופשיות.

לאחר מכן מניחים את צלחת התרבות בחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני על נדנדה במהירות בינונית. נתיחה זהירה של עוברי עכברים ב-e10.5 מקרן הרחם אמורה להניב עוברים לא פגומים ב-PBS להמשך דיסקציה. ניתן להסיר ביעילות את מערכת העיכול מהעובר, מה שמאפשר הבחנה בניצן הלבלב הגבי בצומת המעי והקיבה.

במדיה אורגנוגנזית, התאים נטולי הפיגומים הצפים בחופשיות מתאספים בעצמם ומתארגנים ללבלב תלת מימדי שגדל ונמשך לפחות 10 ימים בתרבית. היישום של מפעיל חלבון קינאז C בריכוזים גבוהים משנה את המורפולוגיה של התפתחות הלבלב, מה שמוביל לתאי אפיתל הקשורים באופן רופף והסתעפות מוגברת. בנוסף, השימוש בבעלי חיים טרנסגניים מאפשר הדמיה של תאים כשהם מתמיינים בזמן אמת.

כדי להעריך את הקשר של רקמת מזנכימה בלבלב עם תאי אפיתל בלבלב, ניתן לבצע צביעה חיסונית לסמנים של כל רקמה. צביעה חיסונית של סמן צינור עם סמן אנדוקריני וגרעינים חושפת היווצרות רב-שושלת בלבלב. סמן מזנכימה מוכתם בשילוב עם סמן אב לבלב מראה כי המזנכימה עוטפת את הלבלב.

התפתחות תאי בטא מתגלה על ידי צביעה לסמן האפיתל ולסמן תאי הבטא. באמצעות ניתוח PCR כמותי, ניתן להעריך תעתיקים של אבות ותאים מתמיינים כגון גנים אב וסמנים מובחנים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה, כולל זמן הכנה, אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את הדיסקציה כדי להשיג רקמת לבלב מ -10.5 עכברים ליצירת לבלב. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להסיר בזהירות את מערכת העיכול מהעוברים, אחרת יהיה קשה מאוד למצוא את ניצן הלבלב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו GSIS ו-ELISA על מנת לענות על שאלות נוספות, כמו כמה אינסולין או פפטיד C מיוצר לאחר גירוי גלוקוז.

לאחר פיתוחה, הטכניקה הזו סללה לנו את הדרך לחקור את ההשלכות המורפולוגיות של הפעלת PKC באמצעות מולקולות קטנות. דרך ליישום נוסף של מערכת זו כדי לחקור את השפעת גורם השעתוק של הביטוי ואפילו לבצע ניסויי אפיסטזיס חשובים.