Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לחקור מעורבות של mRNA אינדיבידואליים עם פוליזומים במהלך התרגום. פרופיל פוליזומים הוא טכנולוגיה רבת עוצמה לחקר מעורבות mRNA עם ריבוזומים ופוליזומים. הטכניקה חשובה למחקרים על ויסות סינתזת חלבונים, הפעלת תרגום ודיכוי.

כאן הצוות שלנו מציג את הטכניקות לפיצול פוליזומלי, וניתוח שברים בדוגמה של שלושה אורגניזמים. טפיל לישמניה, תאים אנושיים מתורבתים ורקמת חיה. גישה זו מורכבת מארבעה שלבים עיקריים, הכנת ליזאט, הכנת שיפוע סוכרוז ואולטרה-צנטריפוגה, פיצול פוליזום ואיסוף דגימות.

ניתוח השברים. תאים ממקורות שונים נאספים, נשטפים ועוברים ליזה במאגר ליזה על ידי מעבר דרך מחט או הומוגנייזר Dounce. צנטריפוגה משמשת להסרת פסולת תאים המבהירה את הליזאט.

שיפוע סוכרוז רציף נוצר על ידי ערבוב של תמיסות סוכרוז של 10% ו-50% ביצרנית שיפוע. ליזאט נטען בחלק העליון של השיפוע. אולטרה-צנטריפוגה מפרידה בין mrNA הקשור למספר שונה של ריבוזומים.

אשר מנוטר על ידי גלאי UV במהלך הפיצול, ויוצר ספקטרום סופג מובהק. הכנת ליזאט. ישנם כמה הבדלים בהכנת הליזאט בהתאם למקור.

לאחר הכנת הליזאט, ההליכים זהים ללא קשר למקור הדגימה. לישמניה מייג'ור הכנת ליזאט ציטופלזמי. מקם תאים עיקריים של לישמניה, ב-30 מיליליטר של מדיום בצפיפות של 100,000 תאים למיליליטר.

שלב זה מתבצע בארון בטיחות ביולוגית. מניחים את הבקבוק עם תרבית לישמניה, באינקובטור ומגדלים תאים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס, עד לשלב הלוגריתמי. בדרך כלל לוקח בערך יומיים לגדול.

תאים עיקריים של לישמניה, נראים בקלות תחת המיקרוסקופ. הוסף ציקלוהקסימיד לתרבית הלישמניה הגדלה לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לעצור ריבוזומים ב-mRNA מתורגמים. החזירו את התאים לאינקובטור למשך עשר דקות בחום של 27 מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת הטיפול בציקלוהקסימיד העבירו תאים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר וסובבו אותו 1,800 גרם למשך 8 דקות. השליכו סופרנטנט. שטפו תאים עם 30 מיליליטר pbs וצנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של pbs. קח כמות תאים וערבב אותה עם תמיסת הפורמלדהיד. לאחר מכן ספור תאים לפי המוציטומטר.

העבירו את מספר התאים הרצוי לצינור מיקרופוגה. סובב את התאים בחום של 1, 800 גרם למשך 8 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז השליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מאגר ליזה המכיל מעכבי פרוטאז ו-RNAsin. העבירו את התאים דרך מחט בגודל 23 שלוש פעמים. לאחר שעבר דרך המחט, הליזט הופך לשקוף.

צנטריפוגה ב 11, 200 גרם למשך עשר דקות בארבע מעלות צלזיוס להבהרת ליזאט. העבירו את הליזאט המובהר לצינור מיקרופוגה טרי ושמרו אותו על קרח עד לאולטרה-צנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. הכנת ליזאט ציטופלזמית מתאים אנושיים מתורבתים.

לגדל תאי HeLa בצלחת גדולה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2. להוסיף ציקלוהקסימיד לתאי HeLa שגדלו לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר כדי לעצור את הריבוזומים ב-mRNA מתורגם. דגרו על תאים במשך עשר דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.

שאפו בינוני ושטפו את הצלחת על קרח פעמיים עם pbs קרים. הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצלחת וגרד את התאים. העבירו את התאים הליזים לצינור המיקרופוגה.

העבירו את התאים דרך מחט בגודל 23 שלוש פעמים. סובב ב -11, 200 גרם למשך שמונה דקות כדי להבהיר ליזאט. לאחר הצנטריפוגה הזיזו את הצינורות על קרח, והעבירו את הסופרנטנט לצינור החדש.

קח אליקוט, דלל אותו ומדוד את הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות טיפת ננו. אם יש מספר דגימות, התאם את הליזטים לאותה צפיפות אופטית ושמור את הדגימות על הקרח עד לאולטרה-צנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. הכנת ליזאט ציטופלזמי מאשך עכבר.

נתח את אשך העכבר. בצע חתך קטן בטוניקה אלבוגניה ואסוף את צינורות הזרע של האשך והעביר אותם בצינור החרוטי המכיל חמישה מיליליטר pbs. מערבבים את הרקמה במרץ.

והניחו לרקמה להתיישב על קרח למשך חמש דקות. הסר את המאגר ושטוף אותו עם pbs פעמיים נוספות. העבירו את צינורות הזרע בצינור של שני מיליליטר וסובבו אותם ב-500 גרם למשך דקה אחת.

הסר את ה-supernatant. הוסף מאגר ליזה של 500 מיקרוליטר לצינורות והשתמש בפיפט כדי לשבש את הרקמה. העבירו את המתלה להומוגניזטור בנפח קטן.

לשבש את הרקמה בשבע עד שמונה משיכות של עלי הזכוכית. העבירו את הליזאט לצינור מיקרו צנטריפוגה. צנטריפוגה של הדגימה ב-12,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך שמונה דקות כדי לנקות את הליזאט.

העבירו את הסופרנטנט לתוך שפופרת חדשה, ושמרו אותו על קרח. לאחר מכן, המשך בהכנת שיפוע סוכרוז. הכנת שיפוע סוכרוז.

הנח צינור אולטרה-צנטריפוגה לתוך המיקרובלוק וצייר את הקו לאורך המפלס העליון של הבלוק. לאחר מכן העבירו את הצינור למתלה יציב. קח מזרק של עשרה מיליליטר, כשמכשיר השכבות מחובר ומלא את המזרק בתמיסת סוכרוז של 10%.

שחרר אותו בעדינות בתחתית צינור האולטרה-צנטריפוגה עד שתמיסת הסוכרוז מגיעה לסימן. מלאו מזרק נוסף בתמיסת סוכרוז של 50% והכניסו בזהירות את מכשיר השכבות שלו דרך שכבת הסוכרוז של 10% לתחתית הצינור. משחררים בעדינות את תמיסת הסוכרוז, החל מלמטה עד שהיא מגיעה לסימן על הצינור.

לאחר מכן אטום את הצינור עם המכסה המצורף. להכנת שיפוע סוכרוז, הפעל את מכשיר יצרן השיפוע. לאחר מכן יישר את הצלחת באמצעות הלחצנים למעלה או למטה ולחץ על סיום.

לאחר פילוס הצלחת לחץ על גראד. עבור לרשימת תפריט השיפוע ובחר את הרוטור SW41. לאחר מכן בחר את שיפוע הסוכרוז הרצוי.

השתמש בעיתונות. הנח את מחזיק צינור בסיס המגנט על יצרן השיפוע. לאחר מכן העבירו את הצינור למחזיק.

ניתן להכין עד שישה שיפועים בו זמנית. לחץ על הפעלה. יצרן השיפוע מסובב את הצינורות במהירות ובזוויות התוכנית, ויוצר שיפוע ליניארי.

ייקח רק כמה דקות להכין את השיפוע. בסיום התהליך, הניחו את הצינור במתלה. הסר את הנפח, השווה לנפח הדגימה מהחלק העליון של צינורות האולטרה-צנטריפוגה עם שיפועי סוכרוז.

טען בזהירות 500 מיקרוליטר מהליזאט מעל. הניחו את הצינורות בדלי הרוטור ואזנו אותם. צנטריפוגה בחום של 260, 000 גרם למשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.

פיצול פוליזום ואיסוף דגימות. לאחר אולטרה-צנטריפוגה, הניחו את הצינורות בדלי הרוטור על קרח. הפעל את אספן השברים ואת המפרק.

לחץ על סריקה בתפריט הפיצול. הכניסו מתלה עם צינורות איסוף לקולט שברים. מלאו מאגר שטיפה, בצד המפריד במים נטולי יונים.

לחץ על מקש השטיפה למשך עשר שניות כדי לשטוף את המשאבה. חבר מתאם שטיפה עם המזרק המלא במים לבוכנה לצורך הכיול. פתח את תוכנת הפיצול במחשב.

לחץ על כיול. השתמש בהגדרת ברירת המחדל ולחץ על Ok.Be מוכן להזרקת מים מהמזרק. לחץ על אישור כדי לבצע כיול.

התחל מיד להזריק מים במשך חמש השניות הבאות. יופיע הסימן אפס כיול הושלם. הסר מתאם שטיפה עם המזרק והצמד קצה לבוכנה של המפרק.

פתח את שסתום האוויר מפליז ולחץ על מקש האוויר למשך עשר שניות כדי לייבש צינורות אוויר ותא זרימה. סגור את שסתום האוויר. קח את צינור השיפוע מדלי הרוטור והנח אותו במתלה.

החל את מכסה מחזיק הצינור על החלק העליון של הצינור, והעבר בזהירות את הצינור לתוך מחזיק הצינור ונעל אותו. הנח את המחזיק מתחת לבוכנה. לעתים קרובות, ניתן לראות רצועות פוליזומליות בעין.

הצג את ההגדרות הרצויות עבור מספרי שברים ונפח. תן שם לקובץ ולחץ על אישור ולאחר מכן עבור לכפתור הגרף. בחלון הבא לחץ על התחל סריקה.

ההגדרות יופיעו ולחץ על אישור.הקולט יעבור מהמרזב לשבר הראשון, והבוכנה תעבור לתוך הצינור. כאשר הבוכנה תגיע לראש השיפוע היא תאט למהירות שבחרת, וייאספו שברים. בדרך כלל, אנו אוספים 24 שברים ב-500 מיקרוליטר כל אחד.

בסיום, הבוכנה תצא מצינור השיפוע. פתח את שסתום האוויר מפליז. לחץ על מקש האוויר בפיצול כדי לאחזר את השבר האחרון.

בסוף הריצה תראה את פרופיל הספיגה של השיפוע. ניתוח השברים. ניתן להשתמש בשברים המתקבלים לניתוח RNA וחלבון.

ניתן לנתח RNA על ידי אלקטרופורזה ואחריה Northern Blot או להשתמש בו לייצור cDNA, ואחריו תגובת RT-qPCR לניתוח הקשר של mRNA בודדים עם פוליזומים. ניתן להשתמש בריצוף הדור הבא כדי לנתח את מצב התרגום של mRNA בסולם טרנסקריפטום. לניתוח חלבונים של שברים פוליזומליים, חלבונים משקעים בחומצה טריקלוריצידית כדי לרכז אותם.

לאחר מכן מנתחים חלבונים על ידי Western Blotting, או על ידי Mass Spec ברמת הפרוטאום. תוצאות. כאן אנו מציגים את התוצאות של פיצול פוליזומים וניתוח על דוגמאות של שלושה אורגניזמים. לישמניה, תאים אנושיים מתורבתים ורקמת עכבר.

פיצול פוליזום שימש לחקר הקשר של שרף וטובולין mRNA עם ריבוזומים במהלך תרגום ולישמניה מג'ור. לגרף הספיגה של הפיצול יש צורה מובהקת עם פסגות אופייניות ליחידות משנה של ריבוזומים 40S ו-60S, מונוזומים 80S ופוליזומים. ציטוטים של השברים אוחדו לשלוש קבוצות.

פרה-פוליזומים, פוליזומים קלים ופוליזומים כבדים. הרמות היחסיות של ה-mRNA נחקרו על ידי PCR כמותי בזמן אמת. הנתונים מצביעים על כך שה-mRNA של טובולין מתורגם באופן פעיל.

מכיוון שהוא היה קשור בעיקר לפוליזומים כבדים וקלים. בעוד שהתרגום של שרף mRNA פחות פעיל. הוא נמצא בעיקר בקשר עם פרה-פוליזומים ופוליזומים קלים.

לפיכך, ניסוי זה מדגים בבירור את יכולתה של הטכניקה לחקור מעורבות mRNA בודדת בתרגום. איור זה מציג גרף ספיגה טיפוסי של פיצול הפוליזום של תאי HeLa. החלבונים רוכזו על ידי משקעים עם 10% חומצה טריכלורואצטית.

החלבון הריבוזומלי הקטן RPS6, והחלבון הריבוזומלי הגדול RPL11 זוהו על ידי Western Blot. תפוצתם הייתה בקורלציה טובה עם הפסגות הברורות, על ספקטרום הספיגה. באיור זה אנו מציגים דוגמה לזיהוי RNA ריבוזומלי על ידי אלקטרופורזה בפוליזומים מקוטעים היוצרים את אשך העכבר. מסקנות.

פרופיל פוליזומלי הוא טכניקה רב-תכליתית, שניתן להשתמש בה כדי לנתח מצב תרגום של mRNAs בודדים, לבחון חלבונים הקשורים לריבוזום ולחקור ויסות תרגומי באורגניזמים מודל שונים בתנאים שונים.