ג'ין המועמד בדיקות במחקרים קליניים עוקבה ועם Genotyping מרובבת ספקטרומטר מסה
21 ביוני 2018
זיהוי של וריאציות גנטיות לתרום מחלות אנושיות מורכבות מאפשר לנו לזהות מנגנונים חדשניים. . הנה, נדגים הגישה מולטיפלקס genotyping של המועמד גנים או מסלול מפענוח ממקסם את הכיסוי במחיר נמוך, הוא נוטה מחקרי עוקבה מבוסס.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האבחון הקליני והגנטיקה, כגון זיהוי סמנים גנטיים הקשורים לתוצאות מחלה, כולל נגיף הפפילומה האנושי. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שמדובר בשיטת אבחון חסכונית, ממוקדת וחסכונית בזמן. כדי להתחיל בהליך זה, הרכיבו מחדש כל פריימרים מסודרים עם מים בדרגה מולקולרית.
משוך את הפריימרים קדימה ואחורה עבור כל מבחן מרובה לתערובת פריימר מלאי, כך שהוא מכיל כל פריימר בריכוז של אפס נקודה חמש מילימולר. לאחר מכן, הכינו תערובת מאסטר ל-PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תערובת זו לכל באר של צלחת PCR של 384 בארות, יחד עם מיקרוליטר אחד של DNA גנומי בריכוז שבין חמישה ל-10 ננוגרם למיקרוליטר.
מכסים את הצלחת במכסה צלחת, וצנטריפוגה למשך 200 פעמים G למשך דקה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הפעל את ה-PCR כמתואר בפרוטוקול הטקסט. טען מיקרוליטר אחד של מוצר PCR עם שלושה מיקרוליטר של מאגר טעינה על ג'ל אגרוז 2%.
הפעל ב-100 וולט למשך 45 דקות כדי להבטיח שהגברת ה-DNA הצליחה. לאחר מכן, הכן תערובת מאסטר של SAP כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף שני מיקרוליטר מתערובת המאסטר הטרייה של SAP לכל באר של צלחת ה-PCR שהופעלה בעבר.
צנטריפוגה בקצרה ב -1, 000 פעמים G למשך דקה אחת. ואז החזר את הצלחת למחזור התרמי. הפעל את התרמוסייקלר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
ואז ב-85 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לנטרל את האנזים. לאחר חישוב גורם הדילול עבור כל פריימר, שלב את הנפחים שנקבעו של כל אחד מהם כדי ליצור מאגר פריימר. הוסף מים לפי הצורך כדי לדלל את הבריכה הזו.
הרכיבו את תערובת ההרחבה הראשית עבור בדיקת ה-plex הגבוהה או בדיקת ה-plex הנמוך, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף שני מיקרוליטר מתערובת מאסטר ההרחבה לכל באר של הצלחת, והביא את הנפח הכולל בכל באר לתשעה מיקרוליטר. צנטריפוגה בקצרה ב -1, 000 פעמים G למשך דקה אחת, ואז החזר את הצלחת למחזור התרמו.
לאחר מכן, הוסף 16 מיקרוליטר מים נטולי יונים לכל באר, מה שמביא את הנפח הכולל עד 25 מיקרוליטר לבאר. מרחו שישה מיליגרם שרף באופן שווה על פני צלחת שרף גומה שלמה. הניחו לשרף להתייבש במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, מרחו את השרף על לוחית התגובה. בעזרת מערבל מתלה, סובב את הצלחת במהירות איטית למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, צנטריפוגה את הצלחת ב-3, 200 פעמים G למשך חמש דקות כדי להימנע ממריחת השרף על שבב ספקטרום המסה.
העלה את פריסת הדגימה של הלוח לממשק התוכנה של המערכת. באמצעות מערכת חלוקה, החל את תערובת האנליטים הגנוטיפיים מהצלחת על שבב הגנוטיפ. טען את השבב למערכת MALDI-TOF כדי ליצור את ספקטרום המסה מתערובת האנליטים, ופרש אותו באמצעות ממשק התוכנה של הפלטפורמה.
במחקר זה, גנוטיפ מולטיפלקס מתבצע באמצעות ספקטרומטריית מסה. נתוני SNP מייצגים נוצרים ומנותחים עבור הגן המועמד IL13 בפנוטיפ קליני גילוי לאלרגיה למזון. גרסה אחת, rs1295686, קשורה לאלרגיה מוכחת למזון.
קשר זה מאושר בקבוצת שכפול באמצעות גישת הגנוטיפ המולטיפלקס המודגמת בפרוטוקול זה. מטא-אנליזה של התוצאות משתי הקבוצות מספקת ראיות חזקות לקשר בין IL13 ל-FA. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לא לזהם דגימות או ריאגנטים. חשוב גם להכין תערובת מאסטר נוספת של 10% עבור כל PCR על מנת לקחת בחשבון כל שגיאת פיפטינג.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR בזמן אמת על מנת לענות על שאלות נוספות כגון האם ביטוי גנים מתאם עם הסמנים הגנטיים הקשורים למחלה שזוהו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחומי האבחון הקליני והגנטיקה לחקור קשרי מחלות בקבוצות חולים. אל תשכח שכאשר עובדים עם ריאגנטים גנוטיפיים ומערכת MALDI-TOF עלולים להיות מסוכנים, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוק מעבדה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה של גנוטיפ מרובה (multiplex genotyping) לניתוח גנים מועמדים הקשורים למחלות אנוש מורכבות. השיטה היא חסכונית ומתאימה למחקרים מבוססי קוהורט, ובכך היא משפרת את הגילוי של סמנים גנטיים הקשורים לתוצאות המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- גנטיקה
- אבחון קליני
- זיהוי פתוגנים
רקע
- זיהוי וריאנטים גנטיים מסייע בהבנת מנגנוני מחלות.
- שיטות חסכוניות הן חיוניות למחקרים רחבי היקף.
- טיפוס גנטי רב-שלבי (Multiplex genotyping) יכול לשפר את היעילות האבחנתית.
- נגיף הפפילומה האנושי הוא דוגמה למטרה לזיהוי סמנים גנטיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטת גנוטייפינג רב-מערכתית (multiplex) לניתוח גנים מועמדים.
- מקסום הכיסוי תוך מזעור העלויות.
- הקלת מחקרים מבוססי קוהורט במדעי הגנטיקה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- המסה של פריימרים ליופיליזים במים בדרג מולקולרי.
- הכנת תמיסת אם של תערובת פריימרים בריכוז של 0.5 millimolar.
- הכנת Master mix עבור PCR לפי הפרוטוקול שפורט.
- שימוש בלוח PCR בעל 384 בארות לניתוח DNA גנומי.
תוצאות עיקריות
- השיטה הפגינה יעילות בזיהוי סממנים גנטיים.
- הכדאיות הכלכלית תוקפה באמצעות יישום מעשי.
- ניכרה יעילות בזמן בתהליך האבחון.
- יישום מוצלח לזיהוי נגיף הפפילומה האנושי.
מסקנות
- גישת הגנוטיפיקציה הרב-מבחנית (multiplex genotyping) היא כלי בעל ערך בגנטיקה.
- היא מספקת מסגרת למחקרי עתיד על מחלות מורכבות.
- מחקרים נוספים עשויים להרחיב את יישומיה באבחון קליני.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גנוטיפיקציה מרובת-מטרות (Multiplexed genotyping) באמצעות ספקטרומטריה של מסות מאפשרת ניתוח יעיל ובעל תפוקה גבוהה של וריאנטים גנטיים בקוהורטות קליניות, ובכך תומכת בתיקוף מטרות (target validation) במחקר של מחלות מורכבות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור לוקוסים מועמדים כגון IL13 לתוצאות פנוטיפיות כגון אלרגיה למזון, באמצעות מחקרי אסוציאציה בעלי ביסוס סטטיסטי חזק. היא ממצבת את הסריקה הגנטית ככלי גילוי בר-הרחבה להפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות בשלבי פיתוח מוקדמים (R&D pipelines).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן השערות טיפוליות על ידי בדיקת קשרים בין וריאנטים גנטיים לבין פנוטיפים של מחלות בקוהורטות רלוונטיות קלינית.
- ערך תפעולי: מאפשר בדיקה סימולטנית של עד 40 SNPs לכל בדיקה, ובכך מגביר את היעילות בתיקוף מטרות ברמת המסלול.
- ערך חיזוי: תומך בהורדת סיכונים של IL13 כמטרה טיפולית באמצעות שחזור ומטא-אנליזה של קשרי גנוטיפ-פנוטיפ.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: שימוש בשיווי משקל קישור (linkage disequilibrium) כדי למקסם את הכיסוי הגנומי עם בחירת SNP מינימלית, ובכך לשפר את יעילות תכנון הבדיקה.
- ערך תפעולי: קריאת MALDI-TOF מספקת נתוני גנוטיפינג כמותיים ובעלי רזולוציה גבוהה, המתאימים למסלולי ניתוח אוטומטיים.
- יכולת הרחבה: פורמט PCR של 384 בארות מאפשר תפוקת דגימות גבוהה עבור קמפיינים של סריקת קהלים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאים גנטיים בחברות בני אדם לנתיבי תיקוף תפקודיים, ובכך תומך בבחירת מטרות המותאמות לסמנים ביולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: שחזור במדגמים עצמאיים מחזק את הביטחון במעבר משלב הגילוי להשקעה פרה-קלינית.
- תובנה מכניסטית: מאפשר מחקרי מעקב (למשל, קורלציה של ביטוי גנים) להבהרת המנגנונים הביולוגיים העומדים מאחורי קשרים גנטיים.
שילוב זרימת עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מהסריקה הגנטית ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומספקת קבוצות מרובדות גנטית לצורך תיקוף מטרות וסריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת השערות גנטיות בקבוצות קליניות בעלות פנוטיפ כדי להבהיר מסלולים הקשורים למחלה ולתעדף מטרות.
- סריקה: מייצרת נתוני גנוטיפ סטנדרטיים וניתנים לשחזור, המאפשרים סטרטיפיקציה אמינה של דגימות לבדיקות פונקציונליות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות גנוטיפ ברמת ביטחון גבוהה עם ספי אותו איכות, התומכות בהשוואה סטטיסטית בין תנאים וקבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים גנטיים אנושיים לתיקוף פרה-קליני על ידי זיהוי וריאנטים עם קשר פנוטיפי חזק.
- שימוש חוזר ארגוני: תכנון בדיקות מולטיפלקס הוא adaptable בין גנים ומחלות שונות, ובכך תומך בהשקעה ברמת הפלטפורמה בתשתית הגנוטיפיקה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בתיקוף המטרה באמצעות קשרים גנטיים נתמכים סטטיסטית באוכלוסיות רלוונטיות מבחינה קלינית.
- ערך תפעולי: מפחית את העלות לדגימה באמצעות ריבוי (multiplexing) ומייעל את זרימת העבודה באמצעות PCR, הארכה וגילוי MALDI-TOF משולבים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת ראיות גנטיות אנושיות המפחיתות את הסיכון בבחירת המטרה בשלב מוקדם של התהליך.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף מותאם סיכון של מטרות בהתבסס על שחזור וגודל אפקט במחקרי קוהורט.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון בדיקות גנטיות, אופטימיזציה של PCR ופירוש נתונים של MALDI-TOF.
- תלוי בגישה למערכות ספקטרומטריית מסות בעלות יכולת multiplex ובתוכנה מאומתת לגנוטיפיקה.
- מחייב טיפול סטנדרטי בדגימות ופרוטוקולי QC כדי להבטיח הדירות בין אתרים או סדרות.
- התאמה למטרות חדשות מחייבת בחירת SNP מבוססת LD ובדיקת תאימות של הפריימרים ל-multiplex.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לאיכות ה-DNA של הדגימה והצורך בטיפול זהיר בריאגנטים כדי למנוע זיהום.
