Name: Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: למד ייצור עכברים טרנסגניים באמצעות הזרקת וקטורים לנטיויריים לחלל הפריוויטליני של ביצים מופרות. שיטה זו מאפשרת שילוב יעיל של טרנסגנים ומספקת יותר מ-70% הצלחה בנולדים לבדיקת תפקוד גנים בגוף החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Magali דומונט, מלוני רולנדו על קריאה ביקורתית של כתב היד ואת iVector Phenoparc ICM ליבות לקבלת סיוע טכני בארצות וקטור lentiviral הייצור של בעלי חיים דיור בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי דה Translationnelles אינסטיטוט Hospitalo-Universitaire דה מדעי המח בפריז, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. יחסי ציבור קיבל מימון עבור פרנסז Langue de האגודה למזוג l'Etude du Diabète et des מחלות Métaboliques (ALFEDIAM), של האגודה לסוכרת נעורים משותפת / INSERM הענק.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

הזרקה perivitelline של וקטורים lentiviral ב oocytes מופרית המתוארים כאן הביא ייצור הטרנסגניים עוברי הניב יותר מ 70% של העוברים הטרנסגניים ביחס המספר הכולל של עוברי שנאספו. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים, מדגימה יחודיות של הליך2,7,10,11,12. כאשר משווים את כל הנתונים המוצגים בטבלה 1, יכול להיות מודגשים התכונות החשובות. קודם כל, מספר הב...

עבודתה החלוצית של גורדון. et al. 1980 הראה כי לאחר ההשתלה בעכברים pseudopregnant, דנ א פלסמיד הזרקה לתוך זכר pronuclei של oocytes מופרית ניתן תשואות ייצור הטרנסגניים חיות משולב פלסמיד DNA1. ההפגנה יונקים הטרנסגניים יכול להיווצר הייתה השפעה עצומה על מדעי החיים הכללית, פתיחת הדרך לשדות הרומן של המחקר הן עבור מדעי ביו translational מדעים בסיסיים. ארבע העשורים האחרונים, הפך ה-DNA microinjection אימון שגרתי. למרות מספר עצום של העכברים הטרנסגניים הופקו, השיטה הרגילה אינה שמישים לחלוטין עבור כל עכבר זנים ודורשת זמן רב בנשימה ובריכוז2,3. היישום שלה למינים אחרים נותר מאתגר4 , התשואה הכוללת של אינטגרציה transgene מוגבלת כמה אחוז בעלי חיים נולד ב5. בנוסף, היעילות של אינטגרציה transgene מייצג את הגורם המגביל המסביר את התשואה הכוללת המסכן של הזרקת הדנ א pronuclear. במובן זה, וקטורים ויראלי אינטגרטיבית הם הכלים היעילה ביותר כדי מטען לשלב את transgenes ואת ובכך יכול לספק אמצעי חדש להגביר משמעותית את התשואה אינטגרציה, המגבלה היחידה כל כך גודל transgene לא עולה על 10 kb6 .
מדומים מוקלד עם החלבון envelop וירוס Vesicular Stomatitis (VSV) lentiviral וקטורים הם כלי העברת הגנים pantropic ו אינטגרטיבית מאוד והוא יכול לשמש כדי מגלי מופרית oocytes7. Zona pellucida המקיפים את oocytes היא מכשול טבעי וירוס וצריך לעבור כדי לאפשר התמרה חושית עם הווקטורים lentiviral. חיות הטרנסגניים נוצרו על-ידי transducing oocytes מופרית לאחר קידוח מיקרו או הסרה של8, zona pellucida9. עם זאת, הזרקה מתחת zona pellucida בחלל perivitelline נראה כי השיטה הפשוטה ביותר כדי מגלי הביצים כפי שמתואר בתחילה על ידי לואיס ועמיתיו7.
הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral מאפשרת תפוקה גבוהה ייצור הטרנסגניים חיות מעל 70% של בעלי חיים נולד. תשואה כזו היא מעל 10-fold גבוה יותר מאשר התשואה הטובה ביותר זה יכולה להיות מושגת באמצעות תקן pronuclei DNA הזרקת7,10,11. בהקשר זה, מושב בודד של זריקות יפיק לפחות 50 הטרנסגניים המייסדים (F0). המספר הגדול של מייסדי הוא, לכן, תואם עם phenotyping של האפקט transgene מתבצע ישירות על עכברים F0 ללא צורך ליצור קווים העכבר מהונדס. יתרון זה מאפשר להקרנה מהירה של האפקט transgene, מותאם במיוחד לביצוע ויוו להפסד ורווח של מחקרים פונקציה בתוך שבועות. בנוסף, רכיבי ה-DNA תקינה יכולים גם להיות במהירות מוקרן למפות משפרי ומוטיבים DNA מחויב על ידי שעתוק גורמים11,12. עם זריקות pronuclear, transgenes בדרך כלל לשלב עותקים מרובים כמו ב לוקוס ייחודי. עם וקטורים lentiviral, אינטגרציה מתרחשת לוקוסים מרובים כעותק יחיד לכל לוקוס10,13. לכן, הריבוי של לוקוסים משולב הוא ככל הנראה קשור penetrance ביטוי גבוהה מאוד שנצפתה הטרנסגניים המייסדים, מה שהופך את המודל החדש שנוצר עמידים יותר.
חשוב, כאשר באמצעות הזרקת pronuclear של ה-DNA, ויזואליזציה של pronuclei במהלך ההליך הוא בהחלט נדרש. מגבלה טכנית זו מונעת את השימוש oocytes מופרית שמקורם במגוון גדול של זנים העכבר. לכן, הפקה של מודל הטרנסגניים מסוימים מסננים עבור אילו pronuclei הן בלתי נראות דורש את הייצור של בעלי חיים בגן זן מתירניות ואחריו בנשימה ובריכוז רצופים לפחות 10 כדי להעביר את transgene העכבר הרצוי זן. עם הזריקות וקטור lentiviral, שטח perivitelline גלוי תמיד ואת הזריקה אינה דורשת מיומנויות ספציפיות מאוד. לדוגמה, העכברים הטרנסגניים הנד/SCID אינן מתאימות pronuclei הזרקת הושגו עם זריקות וקטור ויראלי14.
. הנה, פרוטוקול מקיף מוצג כדי לאפשר ייצור פשוטה של העכברים הטרנסגניים באמצעות זריקות lentiviral וקטור במרחב perivitelline של העובר בשלב תא אחד. הביטוי Transgene נשלט עם כל אחד בכל מקום או תאים ספציפיים היזמים מתואר בפירוט.
PTrip ΔU3 עמוד השדרה lentiviral היה בשימוש במחקר זה15. וקטור זה מאפשר הפקת שכפול וקטורים lentiviral הפגום שבו הרצף U3 חלקית נמחק כדי להסיר U3 יזם פעילות ולהפיק וקטור (חטא) עצמית inactivating16. וקטור lentiviral מניות יוצרו על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK-293T עם p8.91 כימוס פלסמיד (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, קידוד ה גליקופרוטאין-G וירוס (VSV) vesicular stomatitis17, ו ΔU3 pTRIP את pHCMV-G וקטור recombinant. הנוהל מפורט ייצור מסופק שיטות משלימות.
הפקה של כייל נוגדנים גבוה וקטור lentiviral מניות מבוצעת בתנאים אבטחה ברמה II (BSL-2). זה נכון לגבי רוב transgenes חוץ oncogenes חייב להיות מיוצר BSL-3. לכן, ייצור בתנאים BSL-2 ברוב המקרים מספיקה. בנוסף, השימוש ואת הייצור מנותקים בדרך כלל עבור סוכנויות רגולציה הלאומית ביותר העוסקים אורגניזמים מהונדס גנטית (GMO). כמות מוגבלת של שכפול לא מוכשר חטא lentiviral וקטורים (מתחת µg 2 של חלבון p24 capsid) יכול לשמש בתנאים BSL-1 כפי שתואר על ידי הסוכנות הצרפתית GMO מסכים עם המלצות האיחוד האירופי.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 100 מ"מ</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 בארות צלחת Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>צלחת IVF</td></tr><tr><td>M2 בינונית</td><td>סיגמא</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 סיגמא בינונית</td><td></td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 ומיקרו; m מסנן מזרק</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase אנזים 30 מ"ג</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>עובר עכבר נבדק</td></tr><tr><td>אינסולין serynge</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>מספריים מעוקלים</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>מכלולי צינור שואב עבור פיפטות מיקרו-נימיות מכוילות</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>מכשיר הרווארד GC</td><td>100-10</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה אופקי</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>נדרשת</td></tr> <tr><td>תאורת ניגודיות אפנון הופמןמיקרומניפולטור</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram אוויר</td><td></td></tr><tr><td>Controler של החזקת צינור</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>עובר עכבר נבדק</td></tr><tr><td>מיקרו-מזרק</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>ניתן להשתמש בו להזרקת DNA או וקטורים ויראליים</td></tr><tr><td>Dumont # 5 מלקחיים</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas מיקרו מספריים</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250 מ"ל</td></tr><tr><td>אוקריגל</td><td>סנטרבט</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120 מ"ל</td></tr><tr><td>בופרנורפין</td><td>סנטרבט</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3 מ"ג/מ"ל 10 מ"ל</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Trizma hydrochloride</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>אבקת</td></tr><tr><td>פרוטאינאז K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רצועת 8 PCR צינור</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>96 באר תרמי cycler</td><td>יישומי ביוסיסטמס 4375786</td><td></td><td>Veriti</td></tr><tr><td>גנומי DNA מיני ערכת</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR מאסטר מיקס</td><td>רוש</td><td>4887352001</td><td>SYBR ירוק&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת מולטיוול 384</td><td>רוש</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר qPCR 384 באר</td><td>רוש</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

במשך כמעט 40 שנה, הזרקת הדנ א pronuclear מייצג את השיטה הרגילה כדי להפיק העכברים הטרנסגניים עם שילוב אקראי של transgenes. בדיקה שגרתית הוא מנוצל באופן נרחב ברחבי העולם ומתגורר הגבלה העיקריים שלה היעילות העניים של אינטגרציה transgene, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה של מייסד חיות. רק אחוזים בודדים של בעלי חיים שנולד אחרי ההשתלה של oocytes מופרית מוזרק שילבו את transgene. לעומת זאת, וקטורים lentiviral הם כלים רבי-עוצמה עבור העברה גנטית אינטגרטיבית, השימוש שלהם כדי מגלי oocytes מופרית מאפשר הפקה יעילה במיוחד של מייסד העכברים הטרנסגניים עם תשואה ממוצעת מעל 70%. יתר על כן, כל זן העכבר יכול לשמש כדי לייצר חיים מהונדס, והוא penetrance הביטוי transgene גבוהה מאוד, מעל 80% עם lentiviral transgenesis בתיווך בהשוואה ל- DNA microinjection. גודל המקטע דנ א זה יכול להיות מטען על ידי וקטור lentiviral מוגבל ל 10 kb ומייצג המגבלה העיקרית של שיטה זו. שימוש פשוטה וקלה לביצוע הליך הזרקת מתחת zona pellucida של oocytes מופרית, יותר מ 50 מייסד בעלי חיים יכול להיות מיוצר בחצר מושב בודד של microinjection. השיטה היא מאוד מותאם לביצוע, ישירות במייסד חיות, רווח מהיר, אובדן של תפקוד לימודי או לאזורים דנ א גנומי מסך, ביכולתם לשלוט ולווסת ג'ין ביטוי ויוו.

חיות הטרנסגניים נוצרו באמצעות פרוטוקול המוצג כאן. נציג תוצאות שניהם בכל מקום, ביטוי ספציפי transgene סוג התא מומחשים.
ביטוי המכונן של transgenes
היזמים בכל מקום הן כלי מחקר בסיסי כדי להביע את transgenes בצורה יעילה ומתמשכת. היזמים כאלה משמשים למגוון גדול מאוד של יישום במבחנה תא תרביות תאים כדי ויוו transgenesis בבעלי חיים קטנים וגדולי...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

שיטה זו מאפשרת סינון vivo מהיר בעכברים, של ההשפעה של טרנסג'ין, והוא מותאם במיוחד כדי לבצע רווח או אובדן של מחקרים פונקציואליים, כמו גם תשובה ומיפוי מניע DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהשימוש בחיזוי של בעלי חיים מהודרים הוא מעל 70% מהיילוד ו ניתן להחילו על כל זני העכבר כולל בעלי חיים מהו מהו מהודרים. לאחר המתת חום לעכברים, לאסוף את oviducts.כדי להתחיל את הניתוח, להשתמש במספריים כדי להפוך חתך אופקי גדול לתוך חלל הבטן. לאחר מכן, לאתר את oviduct בין הרחם לבין השחלה. לאחר מכן, השתמש במקלות מעוגלים כדי להסיר את mesometrium ואת הממברנה עם כלי הדם הבולטים.לאחר מכן, להפריד את oviduct מן השחלה לנתח את oviduct מן השחלה. לאחר מכן, משיכה על oviduct לחתוך מן הרחם. מעבירים את כל האוביקטים שנאספו למדיום M2 בטמפרטורת החדר.בעת טיפול oviducts, הקפד להימנע מנגיעה אמפולה נפוחה עמוסה ביצים מופרות. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של 100 מיקרוליטר של פתרון עבודה היאלונידס לצלחת 10 ס"מ. ואז להעביר את שני oviducts לתוכו, כדי להסיר את תאי קומולוס מן הביצים.תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמשו בזוג מזרקי אינסולין כדי לאבטח את האוביוידוקט תוך קריעת האמפולה ופיזור הביציות המופריות. לאחר מכן, השתמש פיפטה זכוכית מוכן עם צינורות שופר כדי לשאף את כל הביצים. באמצעות כלי זה, להעביר אותם בין שש טיפות של M2 בינוני לשטוף את התאים cumulus שמסביב.לאחר מכן, להעביר את הביצים שטף לתוך 10 מילימטר גם, בצלחת ארבע היטב, מלא מחומם מראש עם M16. לאחר מכן, מעבירים את המנה לחה 37 מעלות צלזיוס אינקובטור. כהכנה, צנטריפוגה ההשעיה וקטור lentiviral מוכן ב 160 גרם במשך שתי דקות, כדי גלולה את הפסולת לעתים קרובות נוכח במלאי lentiviral.בקבינט בטיחות מדרגה 2, העבר את העל-טבעיים לצינור חדש של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן, לטעון microliter אחד של על טבעי, לתוך פיפטה הזרקה. לאחר מכן, לצרף את פיפטה הזרקה מיקרומניפילייזר בצד ימין.ולצרף את פיפטה החזקה למיקרומניפולטור בצד שמאל. עכשיו, לוותר על שמונה microliters של מדיום M2 במרכז מגלשת הדיכאון. ומכסים בשמן פרדין קל כדי למנוע אידוי.לאחר מכן, מניחים 20 ביצים לתוך המיקומים הרדודים בירידה מבלי ליצור בועות. לאחר מכן, ודא כי קצה פיפטה ההזרקה פתוח. אם לא, הקש על פיפטה ההזרקה עם פיפטה מחזיקה כדי לפתוח אותו.לאחר מכן, להגדיר את microinjector עבור 20 זריקות השני. עכשיו, באמצעות פיפטה מחזיק ולחץ ידני שאפו ביצה מופרית המכילה שני pronuclei ושני גופים קוטביים. לאחר מכן, באמצעות פיפטה הזרקה להזריק את החלל perivitelline של הביצה.אל תיגע קרום הפלזמה. התאימו את הלחץ כך שמרחב פריוויטלין יתמלא בתפתרון. הלחץ לא יעלה על 600 פסקלים hecto.מיד לאחר הזרקת 20 ביצים, להעביר את האצווה לתוך אמבטיה של מדיום M16 שחומם מראש. ו דגירה אותם לפחות 30 דקות לפני השתלתם. 16 שעות לאחר הזדווגות נקבות נורמליות לזכרים עם vasectomies, לבדוק את תקעי הזדווגות.השתמש בנקבות האלה להשתלה. לאחר מכן, להפוך פיפטים השתלה עם קוטר פנימי של כ 150 מיקרון. ועם טיפים מלוטשים להבה כי הם כארבעה עד חמישה מילימטרים ארוכים.לטעון פיפטה עם עובר נבדק, שמן parafin קל רק מעל נקודת הכתף. לאחר מכן, שאף בועת אוויר קטנה וטען עוד יותר את הפיפטה עם מדיום M2. לאחר מכן, שאף בועת אוויר שנייה.עכשיו, לצייר את העוברים לתוך פיפטה אחד מאחורי השני, מזעור נפח המדיום בין העוברים. לסיים, על ידי שאספירה טיפה קטנה מאוד של שמן parafin רק עובר אחד רחב. הכנת פיפטה reimplantation הוא המפתח צריך הרבה תרגול.ביצים בפיפיט חייבות להיות מיושרות כמעט ללא מדיום ביניהן. לאחר מכן, לאחר הרדמה של העכבר ואשר את ההרדמה עם קמצוץ בוהן לגלח את שתיים, שתי רצועות סנטימטר של שיער לאורך חוט השדרה ברמה של הצלע האחרונה. עכשיו, מניחים את העכבר על משטח חימום על שדה סטרילי ולעטפת אותו, משאיר חלון לעור החשוף.לאחר מכן, לחטא את העור החשוף עם קרצוף לסירוגין של iodoprovidone ו 70 אחוז אתנול. עבור ההשתלה, תחילה לעשות חתך רוחבי סנטימטר אחד, ולאחר מכן להחליק את העור באופן רוחבי עד השחלה בצבע כתום גלוי דרך קיר הגוף. לאחר מכן, לעשות חתך חמישה מילימטר עם המספריים בסדר להרים את כרית השומן עם מלחצי בולדוג אטראומטי.לאחר כרית הוא תפס, לשלוף את השחלה, oviduct ואת החלק העליון של הרחם. לאחר מכן, לאתר את האמפולה ולעשות hemisection עם מספריים ואנה, על קטע oviduct המקשר את השחלה לאמפיולה. לאחר מכן, להציג את פיפטה עובר העברה ולפלט את הביצים.עוצרים בבועת האוויר הראשונה לאחר שהביצים שוחררו. יש את החומרים הדרושים מוכנים לחזור על ההליך על oviduct השני. וברגע שתסתיים, סגור את העור עם פצעים.מיד לאחר סגירת העור, להזריק משכך כאבים תוך-פרטיים ולהחדיר את החיה בתא ההתאוששות עם גוף חימום 39 מעלות צלזיוס. לפקח עד שהוא ער לחלוטין. בעלי חיים מהו מהודרים נוצרו בשיטה המוצגת.וקטורים טיטר lentiviral גבוהה יוצרו באמצעות משפר בסיס 2.3 קילו עבור Neurogenin-3 כדי לנהוג eGFP. או כפקד, שבר של כרומוזום שש לנהוג eGFP. ההשתלבות בעוברים הייתה מוצלחת למדי.מן העוברים, ניצן הלבלב היה חתך ו immunostained לחפש ביטוי מקומי של eGFP. מעל 90 אחוזים של הווקטורים, עם משפר Neurogenin-3, הביע eGFP ב Neurog3 הבעת תאים. עם זאת, אף אחד מווקטור הבקרה המשולב לא ביטא eGFP באיבו של הלבלב.אתרי אינטגרציה טרנסג'ין הוערכו על ידי PCR כמותי, באמצעות הגן CDX2 כפקד. המספר הממוצע של אתרי אינטגרציה היה כ -20 באמצעות מבנה Neurogenin-3, או 10 באמצעות מבנה הבקרה. באופן מוזר, טיטר התברות ויראלי המשמש עבור מבנה Neurogenin-3, היה בערך כפול של וקטור הבקרה.מציע קשר בין טיטר ההשתלבות לבין מספר האינטגרציות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך ליצור מספר גדול של עוברים מהודקים מייסד באמצעות הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral עם יעילות גבוהה. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה לייצר עד 50 בעלי חיים מייסד בתוך יום אחד של microinjection, אם זה מבוצע כראוי.בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו הזרקת DNA pronuclear טיטר יכול להתבצע, על מנת להקים קווי עכבר מהוססים. אל תשכח כי עבודה עם וקטורים lentiviral כפוף לאישור מוועדת GMO המקומית שלך. וקטורים אלה יכולים להיות מסוכנים ביותר ויש לנקוט אמצעי זהירות תמיד בעת ביצוע הליך זה.

lentiviral-mediated-production-transgenic-mice-simple-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

תאי גזע pluripotent מושרה קווים מניבים (iPSC) מייצרים שורות של פוטנציאל ההתפתחותי שונים גם כאשר הם עוברים בדיקות תקן לpluripotency. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצר עכברים נגזרים לחלוטין מiPSCs, המגדיר את קווי iPSC כבעל pluripotency...

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

סרטון זה מתאר הזרקה פרו-גרעינית של וקטורים לנטי-ויראליים לתוך החלל הפריביטלי של עובר עכבר מופרה. וירוס הלנטיוירוס מכיל את הטרנסגן, אשר משולב בגנום של העובר המופרי, ובסופו של דבר מוליד עכברים טרנסגניים.

הזרקת פריביטלין מבוססת וקטור לנטיויראלי: שיטה להמרת הגן המעניין לביציות עכבר חד-תאיות מופרות

סרטון זה מדגים את התיוג הנגיפי וההשתלה של תאי בולטות גנגליונית מדיאלית (MGE) למחקרי in vivo. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהתמרת תאי MGE עם מדווח ויראלי, השתלת תאים מתמרים אלה לקליפת המוח של גור עכבר, ומאפשר ביטוי מדווח בתת-סוגים ספציפיים של תאי עצב.

תיוג והשתלה בתיווך ויראלי של תאי בולטות גנגליונים מדיאליים למחקרי in vivo

יש מיקרו RNA תפקידים משמעותיים במבנה המוח ותפקודו. כאן אנו מתארים שיטה לאכיפת מירנה היפוקמפוס יתר ביטוי באמצעות הזרקת stereotactic של lentivirus מירנה מביע מהונדס. גישה זו יכולה לשמש כדרך מהירה יחסית על מנת להעריך...

Lentiviruses הזרקת Stereotactic של microRNA-לבטא באזור CA1 היפוקמפוס העכבר והערכה של תוצאות ההתנהגות

כאן אנו מתארים הליך המבוסס על שימוש בחלקיקים לנטי-ויראלים לשינוי גנטי ארוך טווח של תאי גזע עצביים ו/או תאי אפנדימליים סמוכים להם בנישה הנוירוגנית הגחנית-תת-חדרית הבוגרת המאפשרת ניתוח נפרד של השפעות אוטונומיות ולא אוטונומיות של תאים, תלויות נישה על תאי גזע עצביים.

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Microinjection של ביציות העכבר משמש בדרך כלל עבור transgenesis קלאסי ( כלומר, שילוב אקראי של transgenes) ו CRISPR בתיווך גישור המיקוד. פרוטוקול זה סוקר את ההתפתחויות האחרונות microinjection, עם דגש מיוחד על בקרת איכות אסטרטגיות genotyping.

הדור של עכברים השתנה גנטית דרך Microinjection של ביציות

עכבר הביצים, העוברים בשלב מוקדם מוגנים על-ידי zona pellucida, מטריצה גליקופרוטאין המהווה מחסום נגד המסירה הגן. מאמר זה מתאר עבור לנקב את zona עם לייזר כדי מגלי תאים עובריים עם וקטורים lentiviral וכדי ליצור העכברים הטרנסגניים פרוטוקול.

המסירה הגן Lentiviral לייזר בסיוע העכבר מופרית ביצים

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

מאמר זה שואפת לספק את המתודולוגיה עבור הטרנסגנזה לעדשה של עוברי החולדה באמצעות זריקות מרובות של השעיית וירוס לתוך החלל perivitelline הזיטה. חולדות נשים הזדווג עם זן גברי פורה עם צבע פרווה דומיננטי שונה משמש להפקת אמהות pseudopregnant אומנה.

הדור של חולדות הטרנסגניים באמצעות גישה וקטורית לנטינגיי

כאן מוצג פרוטוקול ייצור AAV מבוסס תאי HEK293 מתלה, וכתוצאה מכך זמן ועבודה מופחתים הדרושים לייצור וקטורי באמצעות רכיבים הזמינים למטרות מחקר מספקים מסחריים.

ייצור אצוות וקטוריות משויכות אדנו בעלות תפוקה גבוהה באמצעות תאי תרחיף HEK293

למד ייצור עכברים טרנסגניים באמצעות הזרקת וקטורים לנטיויריים לחלל הפריוויטליני של ביצים מופרות. שיטה זו מאפשרת שילוב יעיל של טרנסגנים ומספקת יותר מ-70% הצלחה בנולדים לבדיקת תפקוד גנים בגוף החי.

Lentiviral מתווכת הייצור של העכברים הטרנסגניים: שיטה פשוטה ויעילה מאוד עבור לימוד ישיר של המייסדים

גלה סרטונים נוספים