הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

מטרת הפרוטוקול הזה היא לרצף את הגנום של אורגניזם מיקרוסקופי הנקרא טרדיגראדים. הקמנו שיטה לרצף את הגנום של טרדיגראד, Hypsibius dujardini, מדגימה בודדת עם עד 50 פיקוגרם של DNA גנומי עם יישום גנומי שלם. לאחר בידוד טרדיגראד בודד, אנו ממזערים זיהום חיידקי על ידי שימוש באנטיביוטיקה ובדיקה חזותית.

השתמשנו גם בשתי שיטות הומוגניזציה. הראשון והנפוץ ביותר ב- C.elegans באמצעות מחזורי הקפאה והפשרה, ושנית, ריסוק ידני של הטרדיגראד עם קצה פיפטה. לאחר מכן משתמשים ב-DNA לבניית ספריית ריצוף ולאחר מכן מרוצפים במכשיר MiSeq.

סיכום כולל של הפרוטוקול. לאחר בידוד של אדם בודד, הוא נתון לשלושה מחזורי הקפאה והפשרה לצורך הומוגניזציה. ה-DNA הגנומי מופק ומטוהר ומפוצל על ידי סוניקציה.

לאחר מכן נבנית ספריית רצף, ולאחר אימות התפלגות גודל הספרייה, היא מרוצפת עם מכשיר ריצוף. הכינו ג'ל אגרוז 2% באמצעות מים מזוקקים כממס בכלי תרבית פלסטיק של 90 מילימטר, ו-10 מילימטרים של סטרפטומיצין 1% פניצילין עם מים מזוקקים. ניתן לאחסן את הג'ל במשך שבועיים-שלושה באינקובטור המוגדר על 18 מעלות.

אוספים טרדיגראד בודד ומניחים על צלחת האגר המוכנה, ושוטפים במים מזוקקים פעמיים-שלוש כדי להסיר את החלקיקים הנותרים. הניחו את הטרדיגראד היחיד באנטיביוטיקה של סטרפטומיצין פניצילין למשך שעתיים עד שש שעות כדי להסיר זיהום חיידקי, והניחו את החיה המזוהמת על זכוכית נקייה באמצעות פיפטה P10. התבונן בטרדיגראד תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 500, וודא שלא נותרו חיידקים.

אסוף אדם באמצעות פיפטה P10 עם מקסימום חמישה מיקרוליטר נוזל, והניח בצינור PCR בעל קשירה נמוכה, והסר עודפי נוזלים ככל האפשר. הומוגניזציה ומיצוי DNA. הומוגניזציה של החיה כדי להשיג DNA גנומי באחת מהשיטות הבאות.

הומוגניזציה עם מחזורי הקפאה והפשרה. מיד לאחר שלב 2.5, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור ה-PCR המכיל את הטרדיגראד. הנח את צינור ה-PCR בחנקן נוזלי למשך 10 דקות, והעביר לגוש חום, חם ל-37 מעלות למשך 10 דקות.

חזור על שלב זה שלוש פעמים. ריסוק ידני. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מועכים את האדם עם קצה פיפטה P10 על ידי לחיצה על החיה על דופן צינור ה-PCR, ומוסיפים מיד 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי שתתרחש ליזה. העבירו את הנפח המלא של תערובת הליזיס למיקרו-צינור נקי של 1.5 מיליליטר בעל קשירה נמוכה. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור ה-PCR בעל הקישור הנמוך, המשמש להומוגניזציה וכעת ריק.

ואחרי הפיפטה, העבירו את התערובת ל-1.5 מיקרו-צינור בעל קשירה נמוכה. חזור על שלב זה פעמיים. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור PCR בעל קישור נמוך, ולאחר הפיפטינג, העבירו את התערובת למיקרו-צינור בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר.

הוסף את סך הכל של 600 תערובת ליזה של מיקרוליטר לעמודת הסיבוב המונחת בצינור האיסוף, וצנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך דקה אחת. החל מחדש את הזרימה דרך העמוד, וצנטריפוגה ב -10, 000 גרם למשך דקה אחת. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שרוב ה-DNA הגנומי קשור לעמודה.

הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד הסיבוב, וצנטריפוגה ב -10, 000 גרם למשך דקה אחת. העבירו את עמוד הסיבוב למיקרו-צינור נקי של 1.5 מיליליטר. מרחו 20 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי ACL ראשון על עמוד הסיבוב והמתינו חמש דקות בטמפרטורת החדר.

צנטריפוגה בחום של 10, 000 גרם למשך דקה. אסור שמאגר הדילול יכיל EDTA, מכיוון שהוא מפריע לאנזימי הכנה במעבדה. החל מחדש את הזרימה עד עמוד הספין, ולאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה למשך דקה אחת ב -10, 000 G. בניית ספריית רצף.

פיצול DNA. העבר 15 מיקרוליטר של DNA גנומי למיקרו-צינור של 15 מיקרוליטר לפיצול DNA, וצנטריפוגה למשך דקה אחת באמצעות צנטריפוגה שולחנית. לפצל את ה-DNA הגנומי ל-550 זוגות בסיסים.

לאחר פיפטינג, העבירו 10 מיקרוליטר של תערובת DNA מקוטעת לצינור PCR נקי בעל קשירה נמוכה. ניתן לעצור את הניסוי כאן. שמור על DNA בארבע או מינוס 20 מעלות.

בניית ספריית רצף. זה קריטי לחלוטין להשתמש בערכה שצוינה בהליכים הבאים, עקב DNA קלט נמוך. הכן את הריאגנטים הנדרשים, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ובנה את ספריית הריצוף ללא כל שינוי.

לאחר מריחת תערובת הגברת ספרייה על תערובת סינתזת ספרייה, בצע תגובת PCR במחזור תרמי. תגובת ה-PCR בוצעה כפי שמוצג. טיהור תגובת ה- PCR.

הוסף 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים ופיפטה 10 פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר עם מיקרו צנטריפוגה שולחנית. דוגרים שתי דקות בטמפרטורת החדר. דגרו על מעמד מגנטי למשך חמש דקות, או עד שהתמיסה מתבהרת לחלוטין, והסירו את הסופרנטנט.

עקוב אחר פרוטוקול היצרן. העבירו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה לתוך צינור PCR חדש בעל קשירה נמוכה. בדיקת איכות וכימות DNA, וריצוף.

אימות התפלגות גודל ספריית ה-DNA. הוסף שלושה מיקרוליטר של מים לדוגמה עם מיקרוליטר אחד של ספריית ריצוף, וערבב היטב במשך דקה אחת עם מערבולת, וצנטריפוגה קצרה עם צנטריפוגה על השולחן. בצע אלקטרופורזה ואמת את התפלגות גודל הספרייה באמצעות תוכנה קשורה.

שיא השבר העיקרי צריך להיות נע באופן כללי בין 300 ל-1,000 זוגות בסיסים. כימות DNA. הוסף 796 מיקרוליטר של מאגר התמיסה וארבעה מיקרוליטר של מגיב הקרינה וערבב היטב.

הוצא 190 מיקרוליטר מתמיסת העבודה לשני צינורות בדיקה, ו-197 מיקרוליטר לצינור בדיקה אחד. הוסף 10 מיקרוליטר של תקנים עם ריכוזים ידועים של DNA לכל שפופרת בדיקה המכילה 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, ושלושה מיקרוליטרים של הספרייה המוכנה לצינור בדיקה המכיל 197 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מערבולת בקצרה, וצנטריפוגה על הצנטריפוגה על השולחן.

כמת את ה-DNA באמצעות פלואורומטר עם שלוש הגדרות מיקרוליטר. ריצוף ספריית ה-DNA. הכן את ספריית הרצף בהתבסס על פרוטוקול היצרן.

הגדר את קלטת המגיב ותא הזרימה למכשיר הריצוף, והזן את מידע ריצת הרצף, בהתאם לפרוטוקול היצרן. הפעל רצף. ייצגו תוצאות.

חשיפת מזהמים במיצוי DNA באיכות גבוהה נותרה הנקודה הקריטית בפרוטוקול שלנו. כדי לבחון ויזואלית אם הם מזהמים, הדגרנו את הטרדיגראד באנטיביוטיקה, שהיא פניצילין וסטרפטומיצין, וגם בדקנו את האדם במיקרוסקופ פי 500. כפי שמוצג כאן, מיקרובים גלויים סביב הטרדיגראדים מוארים לחלוטין.

לאחר הומוגניזציה יעילה, מיצוי DNA, פיצול והכנת ספרייה. התפלגות הגודל של הספרייה מאומתת באמצעות אלקטרופורזה רגישה במיוחד לבקרת איכות. הקווים הסגולים והירוקים מציינים סמנים עליונים ותחתונים ב-1, 500 ו-25 זוגות בסיסים בהתאמה.

נתיב L הוא סמן סולם, נתיב S ו-N1 עד N4 הם חמישה שכפולים של אותו ניסוי, כולם מתחילים מדגימה אחת של טרדיגראד. כפי שניתן לראות מהאחיד הרחב וההתפלגות בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים, הפרוטוקול שלנו ניתן לשחזור ביותר, אפילו עם הקלט האולטרה-נמוך. הנה התוצאה של QC מהיר, עבור קריאות מסונכרנות המתקבלות מריצת רצף יחידה.

קריאות מתקבלות כקצוות רזרביים של 300 זוגות בסיסים, כאשר קריאות קדימה ואחורה מוצגות בחלק העליון והתחתון, בהתאמה. ההתפלגות המוצגת כאן אופיינית לקריאות קצה של 300 זוגות, עם קריאת בסיס באיכות גבוהה מאוד מעל Q30 עבור 200 זוגות הבסיסים הראשונים, ויורדת בהדרגה עד הסוף. אז שיטה זו משתמשת רק באדם אחד עבור דגימה אחת.

אין דרישות לכמויות עצומות של בעלי חיים, כמו אלה שנדרשו בפרויקטים קודמים של ריצוף גנום טרדיגרד. שיטות התרבות עבור רוב הטרדיגראדים עדיין לא נקבעו. לכן, לאפשר ריצוף גנומי מפרט בודד, כמו אלה ישירות מעבודת השדה, תהיה השפעה גדולה על הביולוגיה המולקולרית של טרדיגראד, ואולי גם על בעלי חיים קטנים אחרים.

שיטות ריצוף ה-DNA שלנו מאפשרות לנתח אורגניזמים מיקרוסקופיים רבים אחרים שעדיין לא רוצפו, כגון מיני חזיר נדירים, נמטודות, אשוחי מים ואפשרויות אחרות, על ידי חיבור החלק של האזורים ואזור ציבורי רחב יותר, מה שמקדם את הסביבה שבה מנגנונים ביולוגיים שונים עשויים להיות אפשריים.