Name: הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: למדו שיטה לריצוף גנום של טרדיגרדה (Hypsibius dujardini) מפרט בודד עם 50 פיקוגרם DNA בלבד. הפרוטוקול ממזער זיהום חיידקי באמצעות אנטיביוטיקה ובדיקה ויזואלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים Nozomi אייב, יוקי Takai ו- Nahoko אישיאי על שלהם תמיכה טכנית ב רצף גנטי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע עבור החברה יפן עבור עמית מחקר של קידום המדע (JSPS), מענק הסיוע KAKENHI למדענים צעירים (No.22681029), KAKENHI מענק הסיוע עבור מדעי למחקר (B), מספר 17 H 03620 JSPS, על ידי גרנט עבור פרויקטים מחקריים מדע בסיסי מן הקרן Sumitomo (No.140340), באופן חלקי על ידי קרנות מחקר ממשלת המחזו איוו ג'ימה, העיר Tsuruoka, יפן. כלורלה דלקתית נהגה לתת את tardigrades סופק באדיבות כלורלה תעשיית ושות' בע מ

1. הכנה
<ol><li>להכין 2% agarose ג'ל באמצעות מים מזוקקים (DW) כמו הממס מאכל תרבות הפלסטיק 90 מ מ, ו 10 מ ל 1% פניצילין/סטרפטומיצין קוקטייל עם DW. ניתן לאחסן את הג'ל במשך 2-3 שבועות באינקובטור להגדיר ב- 18 מעלות צלזיוס. הערה: להימנע מכל אחסון של הג'ל מתחת ל 10 ° C, כי הטמפרטורה הנמוכה יכווץ את הג'ל agarose, וכתוצאה מכך פער זעיר בין הג'ל לבין הקיר מאכל תרבות שבה יכול לבצע עליו את tardigrades.</li>
</ol>2. לטעום הכנה להדרה מזהם
<ol><li>אוספים של דובוני מים יחיד, להניחה על הצלחת אגר מוכן, לשטוף אותה 2 x - x 3 עם DW כדי להסיר את כל החלקיקים שנותרו.</li>
	<li>דגירה של דובוני מים ב 18-22 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה כדי להסיר את כל עודפי מזון מהמעיים.</li>
	<li>מקם את דובוני מים מורעבים האנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין עבור 2-6 h להסיר את כל חיידקי זיהום ומניחים את החיה decontaminated על כוס נקי שקופיות באמצעות פיפטה של P10.</li>
	<li>לצפות את דובוני מים תחת מיקרוסקופ בהגדלה X 500 ואשר שקיימים אין חיידקים שנותרו. הערה: ההגדלה גבוה עם stereomicroscope האופטימלית, אך במיקרוסקופ אופטי ניתן להשתמש לחלופין ללא החלת coverslip.</li>
	<li>לאסוף את הפרט באמצעות פיפטה P10 עם מספר מרבי של 5 µL של נוזל, למקם אותו לתוך צינור תגובת שרשרת (PCR) נמוך מחייב פולימראז והסר כמו נוזל עודף הרבה ככל האפשר. הערה: microtubes, המבחנות ועצות פיפטה צריכים להיות קשירה נמוכה כדי למזער האובדן של ה-DNA. הערה: התנהגות המגון בהקדם האפשרי, עבור לייבוש מהיר או למות בעל החיים באופן משמעותי עלול לגרום נזק הדנ א הגנומי.</li>
</ol>3. המגון והפקת דנ א
<ol><li>Homogenize החיה כדי להשיג את הדנ א הגנומי (gDNA) באחת מהשיטות הבאות. הערה: חיוני כדי להשתמש בערכה שצוין שמוצג בטבלה של חומרים בשלבים מיצוי DNA הבאים, קיטים אחרים (או עמודה, חרוז מבוסס) הם לא יעיל זה קלט נמוך ביותר. המאגר פירוק גנומית סופק עם 0.5% בטא-mercaptoethanol לפני השימוש.<ol>
<li>Homogenize החיה עם מחזורים ההקפאה-הפשרה18.<ol>
<li>מיד לאחר שלב 2.5, להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR המכיל את דובוני מים.</li>
			<li>הכנס את הצינור PCR חנקן נוזלי למשך 10 דקות, 10 דקות, להזיז את גוש חום התחמם עד 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלב זה, 2 x. הערה: שלב זה יכול לחזור כאשר המגון אינה מספיקה או יכול להתבצע לאחר ריסוק ידני.</li>
		</ol>
</li>
		<li>באופן ידני לרסק את החיה.<ol>
<li>מיד לאחר שלב 2.5, תחת stereomicroscope, לרסק את הפרט עם קצה P10 פיפטה על ידי לחיצה על החיה הקיר צינור PCR, מיד להוסיף 100 µL פירוק המאגר. הערה: חיוני לקיים הליך זה תחת stereomicroscope, כי דובוני מים יכול בקלות לחמוק, ריסוק לא יעיל יביא כשל כדי לחלץ gDNA. ודא כי הקוטיקולה tardigrade הוא שבור, כך המאגר פירוק יכול לחדור את האורגניזם.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במשך פירוק להתרחש. הערה: נדרש מינימום של 30 דקות פירוק יעיל, אך הדגירה יכולות להיות ארוכות יותר.</li>
	<li>העבר את העוצמה המלאה (100 µL) של תערובת פירוק microtube נמוך מחייב נקי 1.5-mL.</li>
	<li>להוסיף 100 µL מאגר פירוק הצינור PCR נמוך מחייב כי שימשו את המגון עכשיו ריקה, לאחר pipetting את התערובת, להעביר אותו microtube 1.5-mL נמוך מחייב שימוש בשלב 3.3. חזור על שלב זה, 2 x.</li>
	<li>כמו צעד 3.4, להוסיף 300 µL מאגר פירוק הצינור PCR מחייב נמוך, לאחר pipetting, להעביר את הבלילה לתבנית microtube נמוך מחייב 1.5-mL. Microtube נמוך מחייב 1.5-mL צריך להכיל 600 µL של התערובת לאחר שלב זה. הערה: השלבים הבאים הם כדי למזער האובדן של gDNA כבול לקיר צינור PCR, נטילת הדגימה מספר פעמים.</li>
	<li>הוסף את סך של 600 µL של פירוק תערובת לעמודה ספין הניח צינור אוסף ' centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות.</li>
	<li>החל מחדש את הזרימה אל העמודה, centrifuge זה ב 10,000 x g עבור 1 דקות. הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח כי רוב gDNA מאוגדת לעמודה.</li>
	<li>להוסיף 500 µL מאגר שטיפת העמודה ספין, centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 הגבלת העברת העמודה ספין כדי microtube נקי 1.5-mL.</li>
	<li>החל µL 20 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5, העמודה ספין, להמתין 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר centrifuge זה ב 10,000 g x עבור 1 דקות. הערה: המאגר • תנאי אינו יכול להכיל EDTA, כי זה מפריע האנזימים הכנה הספרייה.</li>
	<li>החל מחדש את הזרימה דרך העמודה ספין, ואחרי 5 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, centrifuge זה עבור 1 דקות ב- 10,000 x g. הערה: שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח את • תנאי מקסימלי של gDNA מאוגד לעמודה.</li>
</ol>4. ספריית בניית רצף
<ol><li>
פיצול דנ א
	<ol>
<li>להעביר 15 µL של eluant gDNA microtube 15-µL עבור ה-DNA פיצול, centrifuge את צינור 1 דקות באמצעות microcentrifuge על השולחן. הערה: microtube שצוין שמוצג בטבלה של חומרים הוא אופטימלי עבור קלט נמוכה. הפיצול עם sonication בנפח נמוך הוא קריטי, זה לא ניתן להחליף עם פיצול אנזימטי בשל הריכוז הנמוך ביותר של ה-DNA.</li>
		<li>קטע של gDNA ל 550 bp. הערה: ההגדרות bp 550 השתמשנו הן כדלקמן: שיא האירוע כוח = 30 W, פקטור חובה = 20%, מחזורים לכל פרץ = 50, זמן טיפול = 23 s.</li>
		<li>לאחר pipetting יסודי, להעביר µL 10 של תערובת DNA מפוצלים צינור נקי נמוך-איגוד ה-PCR. הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA 4 ° C או-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
רצף בניית הספרייה הערה: זה הוא קריטי כדי להשתמש בערכה שצוינו בטבלה של חומרים בהליכים הבאים, בגלל הכמות הנמוכה של DNA קלט.<ol>
<li>להוסיף 2 µL של המאגר הכנת תבנית ו µL 1 של האנזים הכנת תבנית ומערבבים אותם ביסודיות עם פיפטה.</li>
		<li>לבצע את התגובה הכנת תבנית הצנטרפוגה תרמי עם התנאים הבאים: 22 מעלות במשך 25 דקות, 55 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות, החזק 4 ° C, מכסה מחוממת ב 101-105 ° C. עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.</li>
		<li>להוסיף 1 µL של המאגר סינתזה ספריית µL 1 של האנזים סינתזה ספריית המוצר התגובה הכנת תבנית, דגירה התערובת ב 22 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות (עם אחיזה 4 ° C). עם סיום התגובה, המשך לשלב הבא.</li>
		<li>להוסיף 30 µL של ספריית הגברה מאסטר המיקס (25 µL של המאגר הגברה ספריית µL 1 של האנזים הגברה ספריה, 4 µL של מים נטולי נוקלאז) ו µL 5 מהתרכובת יצירת אינדקס.</li>
		<li>לערבב הכל היטב עם פיפטה, centrifuge את התערובת בקצרה עם צנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>ביצוע של PCR עם התנאים המוצגים בטבלה 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>טמפרטורה</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>85 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>2 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>2 דקות</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>98 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>20 שניות</td>
			<td rowspan="3">4 מחזורים</td>
		</tr>
<tr>
<td>67 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>20 שניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>40 שניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>98 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>20 שניות</td>
			<td rowspan="2">מחזורים 16</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>50 שניות</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 הלעפה תרוטרפמט</td>
			<td>. תחזיק</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: תנאי ה-PCR.
<ol start="3"><li>
טיהור של מוצרי ה-PCR הערה: שלב זה ניתן יהיה להחליף עם שיטות טיהור אחרות. אם שיטה חלופית, הקפד לבדוק טוהר DNA שנוצר באמצעות ספקטרופוטומטרים. ספיגת יחס של 260/280, 260/230 שנינו חייבים להיות מעל 1.8.<ol>
<li>להוסיף 50 µL של beads מגנטי, pipette הפתרון 10 x, ו- centrifuge זה בקצרה עם microcentrifuge השולחן.</li>
		<li>דגירה הפתרון למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>דגירה אותו על דוכן מגנטי במשך 5 דקות או עד הפתרון הופך לגמרי ברור, ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
		<li>להוסיף 200 µL הטרי 80% אתנול הצינור PCR נמוך מחייב על דוכן מגנט, לחכות 30 s, ולהסיר תגובת שיקוע. חזור על שלב זה, 2 x. נא לא להפריע את החרוזים.</li>
		<li>בקצרה centrifuge הצינור PCR נמוך מחייב עם צנטריפוגה שולחן ולהסיר כל אתנול עודף על הדוכן מגנטי. מילה נהדרת החרוזים אבל להימנע overdrying.</li>
		<li>Resuspend את החרוזים עם 15 µL 10 מ מ טריס-HCl, pH 8.5 ביסודיות pipette את הפתרון כך החרוזים מגנטי homogeneously מופצים, דגירה הצינור למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, ואחרי צנטריפוגה קצרה, דגירה אותו על דוכן מגנטי עבור 2 דקות עד הפתרון ברור. הערה: המאגר • תנאי צריך מכילה EDTA, כי זה מפריע הכימיה רצף.</li>
		<li>להעביר את תגובת שיקוע, מבלי להפריע בגדר, אל צינור נמוך-איגוד ה-PCR. הערה: הניסוי ניתן לעצור כאן. לשמר את ה-DNA ב 4 º C או ב-20 ° C עבור אחסון ותיק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. איכות הסימון כמת, רצף ה-DNA
הערה: בדיקת איכות לא מתבצע לפני שלב זה בגלל הכמות הנמוכה של ה-DNA.
<ol><li>
אימות של התפלגות גודל של ספריית דנ א הערה: מערכות אלקטרופורזה רגיש גבוהה עם דיווח דיגיטלי של התפלגות גודל ניתן להשתמש.<ol>
<li>להחזיר הכימית מאגר אלקטרופורזה, ג'ל מחסנית (25-1, 000 לחץ הדם בטווח) לטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להוסיף 3 µL של ריאגנט מאגר אלקטרופורזה עם µL 1 של הספרייה רצף, ומערבבים היטב במשך 1 דקה עם מערבולת, בקצרה centrifuge אותם עם צנטריפוגה שולחן.</li>
		<li>התנהלות אלקטרופורזה ולאמת את התפלגות גודל הספרייה עם התוכנה המשויכים. הפסגה פרגמנט העיקרי צריך להיות באופן כללי ועד כ-300 1,000 bp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כימות דנ א הערה: שיטות מבוססות קרינה פלואורסצנטית או ה-PCR כמותי אחרים ניתן להשתמש גם, אבל ספקטרופוטומטר להימנע, כי זה לא מספיק מדויקת לכימות תנועת רצף ספריות.<ol>
<li>הוסף µL 796 פתרון מאגר µL 4 של ריאגנט פלורסנט ומערבבים אותם ביסודיות. לוותר על 190 µL של הפתרון עובד שני צינורות assay, µL 197 ל שפופרת assay אחת.</li>
		<li>הוסף 10 µL של סטנדרטים עם ריכוזים ידועים של ה-DNA כדי כל שפופרת assay המכיל µL 190 של הפתרון עובד µL 3 של הספריה מוכן כך הצינור assay המכיל µL 197 של הפתרון עובד.</li>
		<li>מערבולת הצינורות בקצרה, centrifuge אותם על צנטריפוגה שולחן. לכמת את הדנ א באמצעות fluorometer עם הגדרות 3-µL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
רצף ספריית ה-DNA הערה: פלטפורמת רצף חייב להיות תואם עם ערכת בנייה הספריה שצוינה.<ol>
<li>הכינו את הספריה רצף בהתבסס על הפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>להגדיר את התא קלטות וזרימה של ריאגנט לתוך הכלי רצף והזן את הרצף לנהל מידע ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
		<li>הפעל את הרצף. הערה: ביצענו שתי ריצות רצף: דוגמה אחת/הפעלה, כמו גם הארבעה מרובב בהפעלה אחת.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ניתוח חישובית
<ol><li>בסיס-שיחה, אם נדרש, demultiplex את הקריאות.</li>
	<li>לאמת את איכות הנתונים רצף עם FastQC19. הערה: עבור אימות מעמיקה יותר של נתונים המתקבלים, ראה דו ח הקודם שלנו16.</li>
</ol>

<ol><li>Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.ph.54.030192.003051">Anhydrobiosis.</a> Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).</li>
<li>Mobjerg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+extreme+environments+-+on+the+current+knowledge+of+adaptations+in+tardigrades%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Survival in extreme environments - on the current knowledge of adaptations in tardigrades.</a> Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).</li>
<li>Becquerel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+suspension+de+la+vieau+dessous+de+1%2F20+K+absolu+par+demagnetization+adiabatique+de+L%27alun+de+fer+dans+le+vide+les+plus+el%C3%A9ve%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Acad%C3%A9mie+des+Sciences%22%5BJournal%5D)">La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L'alun de fer dans le vide les plus eléve.</a> Comptes Rendus de l'Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).</li>
<li>Ono, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/23311940.2016.1167575">Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia.</a> Cogent Physics. 3 (1), 1167575(2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+anhydrobiotic+eggs+of+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+to+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments.</a> Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+repair+and+protection+in+the+Tardigrade+Ramazzottius+varieornatus+and+Hypsibius+dujardini+after+exposure+to+UVC+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation.</a> PLoS One. 8 (6), e64793(2013).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+tardigrade+Milnesium+tardigradum%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).</li>
<li>May, R. M., Maria, M., Gumard, J. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10021039778/">Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L'état actif et desséché.</a> Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).</li>
<li>Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+tolerance+in+the+eutardigrade+Richtersius+coronifer%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer.</a> International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).</li>
<li>Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+of+a+tardigrade%3A+Horizontal+gene+transfer+or+bacterial+contamination%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).</li>
<li>Delmont, T. O., Eren, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+contamination+with+advanced+visualization+and+analysis+practices%3A+metagenomic+approaches+for+eukaryotic+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies.</a> PeerJ. 4, e1839(2016).</li>
<li>Koutsovoulos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+in+the+genome+of+the+tardigrade+Hypsibius+dujardini%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reply+to+Bemm+et+al.+and+Arakawa%3A+Identifying+foreign+genes+in+independent+Hypsibius+dujardini+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).</li>
<li>Boothby, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).</li>
<li>Arakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+evidence+for+extensive+horizontal+gene+transfer+from+the+draft+genome+of+a+tardigrade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057(2016).</li>
<li>Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequencing+of+a+single+tardigrade+Hypsibius+dujardini+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual.</a> Scientific Data. 3, 160063(2016).</li>
<li>Yoshida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+tardigrades+Hypsibius+dujardini+and+Ramazzottius+varieornatus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus.</a> PLoS Biology. 15 (7), e2002266(2017).</li>
<li>He, F. <a target="_blank" href="https://bio-protocol.org/bio101/e47">Total RNA Extraction from C. elegans.</a> Bio-protocol. Bio101, e47(2011).</li>
<li>Andrews, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndrews%2C+S+%22FastQC+a+quality-control+tool+for+high-throughput+sequence+data%22">FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Hashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremotolerant+tardigrade+genome+and+improved+radiotolerance+of+human+cultured+cells+by+tardigrade-unique+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein.</a> Nature Communications. 7, 12808(2016).</li>
<li>Zimin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaSuRCA+genome+assembler%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The MaSuRCA genome assembler.</a> Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualimap+2%3A+advanced+multi-sample+quality+control+for+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data.</a> Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).</li>
<li>Horikawa, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+rearing+system+of+the+extremotolerant+tardigrade+Ramazzottius+varieornatus%3A+a+new+model+animal+for+astrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Astrobiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology.</a> Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

זיהום חיידקי מהווה איום על רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים. בעוד מחקרים קודמים על רצף הגנום tardigrade סינון החוצה זיהום תוך שימוש נרחב אינפורמטיקה שיטות12,20, ריצפנו את הגנום של אדם יחיד כדי למזער את הסיכון של מציג. כיוון דובוני מים בודדים מכיל כ- 50-200 pg דנ א גנומי16 זה עטוף בשכבה עבה של שלד כיטין, הכללת מזהמים והפקת DNA באיכות גבוהה הן נקודות קריטיות של פרוטוקול זה. תרבויות tardigrades הקיימים אינם aseptic, ולא אלה נאספו מ להוצי...

Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים יכולים להזין את מצב ametabolic הנקרא anhydrobiosis מול לייבוש. הם לשחזר על-ידי ספיגת מים1,2. במצב ametabolic, tardigrades מסוגלים לנקוט בסביבות קיצוניות שונות, הכוללות טמפרטורות קיצוניות3 ו לחצים4,5, מינון גבוה של אור אולטרה סגול6, צילומי רנטגן, קרני גמא 7 , 8, חלל היקום9. נתונים גנומית היא יסוד חיוני לצורך המחקר של המנגנונים המולקולריים של anhydrobiosis.
נסיונות קודמים רצף הגנום של tardigrades הראו סימנים של זיהום בקטריאלי10,11,12,13,14. רצף גנטי של אורגניזמים קטנים כזה דורש מספר רב של בעלי חיים, והוא נוטה זיהום בקטריאלי; לכן, קודם לכן הקמנו פרוטוקול רצף באמצעות שיטת קלט ultralow החל להצטננות דובוני מים, כדי למזער את הסיכון מציג15. באמצעות נתונים אלו, יש נוספת ערכנו למיין שוב באיכות גבוהה ועל ההרכבה מחדש של הגנום של16, dujardini ה17. כאן נתאר בפירוט שיטה זו עבור רצף גנטי של אדם יחיד tardigrade (איור 1). האימות של שיטה זו הוא מעבר המוקד של המאמר, כבר המורכב בהרחבה בדוח הקודם שלנו16.
שיטה זו מורכבת משני חלקים: בידודו של דובוני מים יחיד עם הכי נמוך שאפשר זיהום, החילוץ באיכות גבוהה של pictogram רמות ה-DNA. דובוני מים מורעבים, לשטוף ביסודיות עם מים, כמו גם אנטיביוטיקה, שנצפו תחת מיקרוסקופ עם 500 X הגדלה כדי להבטיח סילוק כל זיהום חיידקי. הערכות קודמות ומדידות מראים כי אדם יחיד של דובוני מים מכיל כ- 50-200 pg גנומית דנ א16, אשר מופק על ידי פיצוח שלד חיצוני כיטין מחזורים ההקפאה-הפשרה או על ידי המגון ידנית. את הדנ א הגנומי נאספו ספריית לבנייה, וסודרו על מכשיר רצף ה-DNA. ניתוח נוסף אינפורמטיקה מציג רצף באיכות גבוהה, כמו גם רמות נמוכות של זיהום לעומת פרוייקטים רצף tardigrade קודמים.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ SZ61</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין (10,000 U/mL)</td> <td>Gibco על ידי טכנולוגיות חיים</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>VHX-5000 מערכת</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 מ"ל צינור ציפוי סיליקון</td><td>ביו מדע רפואי</td><td>BC-bmb20200</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA ערכת מיקרו-פרפ</td><td>ZYMO Research</td><td>D3021</td><td>השימוש בערכה זו הוא קריטי לחלוטין; ראה שלב 3.1</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינורית</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>616-201</td><td>ראה 4.1.1</td></tr><tr><td>מיקרו צנטריפוגה מקוררת במהירות גבוהה</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Covaris M220</td><td>Covaris Inc.</td><td></td><td></td>4482277</tr><tr><td>ערכת ThruPLEX DNA-Seq</td><td>Rubicon Genomics</td><td>CAT. מס' R400406</td><td>השימוש בערכה זו הוא קריטי לחלוטין; ראה שלב 4.2</td></tr><tr><td>Thermal</td><td>Cycler Bioer Technology</td><td>TC-96GHbC</td><td></td></tr><tr><td>AMPure מגיב XP</td><td>BECKMAN COULTER Life Science</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako</td><td>054-027335</td><td></td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2965AA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ריאגנטים</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Cubee מיני צנטריפוגה</td><td>RecenttecGenereach</td><td>R5-AQBD01aqbd</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 600 cycle v3</td><td>Illumina Inc.</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Sequencer</td><td>Illumina Inc.</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות tardigrade

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades הם בעלי חיים מיקרוסקופיים להיכנס למצב של ametabolic נקרא anhydrobiosis מול לייבוש והוא יכול להחזיר למצב המקורי שלהם כשהם מסופקים המים. רצף גנומית של בעלי חיים מיקרוסקופיים כמו tardigrades סיכוני זיהום חיידקי שמוביל לפעמים פירושים מוטעים, לדוגמה, בנוגע להיקף של העברה גנטית אופקית בבעלי חיים אלה. כאן, אנו מספקים שיטת קלט ultralow את רצף הגנום של דובוני מים, Hypsibius dujardini, מן להצטננות. על ידי שימוש קפדני הדרה כביסה ולא מזהם יחד עם ניסיון חילוץ יעיל שנות ה-50 ~ 200 pg DNA גנומי של אדם יחיד, ואנחנו נבנה ספריה רציף עם כלי עריכה ברצף ה-DNA. ספריות אלה היו מוטים הדירים מאוד, ניתוח אינפורמטיקה הקריאות ברצף עם הגנום dujardini ה אחרים הראו כמות מזערית של זיהום. בשיטה זו ניתן ליישם tardigrades unculturable זה יכול לא להיות רציף בשיטות קודמות.

הדרה מזהם:
פרוטוקול זה כרוך שטיפה של דובוני מים ועיקור בטיפול אנטיביוטיקה כדי למזער את הזיהום. זה כרוך גם תהליך בדיקה חזותית כדי להבטיח את שלמות התרגום של תהליכים אלה. תמונת מיקרוסקופ במהלך האימות (שלב 2.4 לפרוטוקול) מוצג באיור2. בעת שנצפה בהגדלה גדולה-X 500, ניתן לראות תאים חיידקיים חלקיקים קטנים מסביב את דובוני מים בודדים.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

זיהום במהלך רצף גנומית של אורגניזמים מיקרוסקופיים עדיין בעיה גדולה. כאן, אנו מראים שיטה רצף הגנום של דובוני מים מן להצטננות עם עמוד 50 קטנה כמו של ה-DNA גנומי ללא הגברה הגנום כולו כדי למזער את הסיכון של זיהום.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

מטרת הפרוטוקול הזה היא לרצף את הגנום של אורגניזם מיקרוסקופי הנקרא טרדיגראדים. הקמנו שיטה לרצף את הגנום של טרדיגראד, Hypsibius dujardini, מדגימה בודדת עם עד 50 פיקוגרם של DNA גנומי עם יישום גנומי שלם. לאחר בידוד טרדיגראד בודד, אנו ממזערים זיהום חיידקי על ידי שימוש באנטיביוטיקה ובדיקה חזותית.השתמשנו גם בשתי שיטות הומוגניזציה. הראשון והנפוץ ביותר ב- C.elegans באמצעות מחזורי הקפאה והפשרה, ושנית, ריסוק ידני של הטרדיגראד עם קצה פיפטה. לאחר מכן משתמשים ב-DNA לבניית ספריית ריצוף ולאחר מכן מרוצפים במכשיר MiSeq.סיכום כולל של הפרוטוקול. לאחר בידוד של אדם בודד, הוא נתון לשלושה מחזורי הקפאה והפשרה לצורך הומוגניזציה. ה-DNA הגנומי מופק ומטוהר ומפוצל על ידי סוניקציה.לאחר מכן נבנית ספריית רצף, ולאחר אימות התפלגות גודל הספרייה, היא מרוצפת עם מכשיר ריצוף. הכינו ג'ל אגרוז 2% באמצעות מים מזוקקים כממס בכלי תרבית פלסטיק של 90 מילימטר, ו-10 מילימטרים של סטרפטומיצין 1% פניצילין עם מים מזוקקים. ניתן לאחסן את הג'ל במשך שבועיים-שלושה באינקובטור המוגדר על 18 מעלות.אוספים טרדיגראד בודד ומניחים על צלחת האגר המוכנה, ושוטפים במים מזוקקים פעמיים-שלוש כדי להסיר את החלקיקים הנותרים. הניחו את הטרדיגראד היחיד באנטיביוטיקה של סטרפטומיצין פניצילין למשך שעתיים עד שש שעות כדי להסיר זיהום חיידקי, והניחו את החיה המזוהמת על זכוכית נקייה באמצעות פיפטה P10. התבונן בטרדיגראד תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 500, וודא שלא נותרו חיידקים.אסוף אדם באמצעות פיפטה P10 עם מקסימום חמישה מיקרוליטר נוזל, והניח בצינור PCR בעל קשירה נמוכה, והסר עודפי נוזלים ככל האפשר. הומוגניזציה ומיצוי DNA. הומוגניזציה של החיה כדי להשיג DNA גנומי באחת מהשיטות הבאות.הומוגניזציה עם מחזורי הקפאה והפשרה. מיד לאחר שלב 2.5, הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור ה-PCR המכיל את הטרדיגראד. הנח את צינור ה-PCR בחנקן נוזלי למשך 10 דקות, והעביר לגוש חום, חם ל-37 מעלות למשך 10 דקות.חזור על שלב זה שלוש פעמים. ריסוק ידני. תחת מיקרוסקופ סטריאו, מועכים את האדם עם קצה פיפטה P10 על ידי לחיצה על החיה על דופן צינור ה-PCR, ומוסיפים מיד 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה.דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי שתתרחש ליזה. העבירו את הנפח המלא של תערובת הליזיס למיקרו-צינור נקי של 1.5 מיליליטר בעל קשירה נמוכה. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור ה-PCR בעל הקישור הנמוך, המשמש להומוגניזציה וכעת ריק.ואחרי הפיפטה, העבירו את התערובת ל-1.5 מיקרו-צינור בעל קשירה נמוכה. חזור על שלב זה פעמיים. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור PCR בעל קישור נמוך, ולאחר הפיפטינג, העבירו את התערובת למיקרו-צינור בעל קשירה נמוכה של 1.5 מיליליטר.הוסף את סך הכל של 600 תערובת ליזה של מיקרוליטר לעמודת הסיבוב המונחת בצינור האיסוף, וצנטריפוגה ב-10,000 גרם למשך דקה אחת. החל מחדש את הזרימה דרך העמוד, וצנטריפוגה ב -10, 000 גרם למשך דקה אחת. שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שרוב ה-DNA הגנומי קשור לעמודה.הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד הסיבוב, וצנטריפוגה ב -10, 000 גרם למשך דקה אחת. העבירו את עמוד הסיבוב למיקרו-צינור נקי של 1.5 מיליליטר. מרחו 20 מיקרוליטר של 10 מילי-מולרי ACL ראשון על עמוד הסיבוב והמתינו חמש דקות בטמפרטורת החדר.צנטריפוגה בחום של 10, 000 גרם למשך דקה. אסור שמאגר הדילול יכיל EDTA, מכיוון שהוא מפריע לאנזימי הכנה במעבדה. החל מחדש את הזרימה עד עמוד הספין, ולאחר חמש דקות דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה למשך דקה אחת ב -10, 000 G. בניית ספריית רצף.פיצול DNA. העבר 15 מיקרוליטר של DNA גנומי למיקרו-צינור של 15 מיקרוליטר לפיצול DNA, וצנטריפוגה למשך דקה אחת באמצעות צנטריפוגה שולחנית. לפצל את ה-DNA הגנומי ל-550 זוגות בסיסים.לאחר פיפטינג, העבירו 10 מיקרוליטר של תערובת DNA מקוטעת לצינור PCR נקי בעל קשירה נמוכה. ניתן לעצור את הניסוי כאן. שמור על DNA בארבע או מינוס 20 מעלות.בניית ספריית רצף. זה קריטי לחלוטין להשתמש בערכה שצוינה בהליכים הבאים, עקב DNA קלט נמוך. הכן את הריאגנטים הנדרשים, בהתאם לפרוטוקול היצרן, ובנה את ספריית הריצוף ללא כל שינוי.לאחר מריחת תערובת הגברת ספרייה על תערובת סינתזת ספרייה, בצע תגובת PCR במחזור תרמי. תגובת ה-PCR בוצעה כפי שמוצג. טיהור תגובת ה- PCR.הוסף 50 מיקרוליטר חרוזים מגנטיים ופיפטה 10 פעמים, וצנטריפוגה לזמן קצר עם מיקרו צנטריפוגה שולחנית. דוגרים שתי דקות בטמפרטורת החדר. דגרו על מעמד מגנטי למשך חמש דקות, או עד שהתמיסה מתבהרת לחלוטין, והסירו את הסופרנטנט.עקוב אחר פרוטוקול היצרן. העבירו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה לתוך צינור PCR חדש בעל קשירה נמוכה. בדיקת איכות וכימות DNA, וריצוף.אימות התפלגות גודל ספריית ה-DNA. הוסף שלושה מיקרוליטר של מים לדוגמה עם מיקרוליטר אחד של ספריית ריצוף, וערבב היטב במשך דקה אחת עם מערבולת, וצנטריפוגה קצרה עם צנטריפוגה על השולחן. בצע אלקטרופורזה ואמת את התפלגות גודל הספרייה באמצעות תוכנה קשורה.שיא השבר העיקרי צריך להיות נע באופן כללי בין 300 ל-1,000 זוגות בסיסים. כימות DNA. הוסף 796 מיקרוליטר של מאגר התמיסה וארבעה מיקרוליטר של מגיב הקרינה וערבב היטב.הוצא 190 מיקרוליטר מתמיסת העבודה לשני צינורות בדיקה, ו-197 מיקרוליטר לצינור בדיקה אחד. הוסף 10 מיקרוליטר של תקנים עם ריכוזים ידועים של DNA לכל שפופרת בדיקה המכילה 190 מיקרוליטר של תמיסת עבודה, ושלושה מיקרוליטרים של הספרייה המוכנה לצינור בדיקה המכיל 197 מיקרוליטר של תמיסת עבודה. מערבולת בקצרה, וצנטריפוגה על הצנטריפוגה על השולחן.כמת את ה-DNA באמצעות פלואורומטר עם שלוש הגדרות מיקרוליטר. ריצוף ספריית ה-DNA. הכן את ספריית הרצף בהתבסס על פרוטוקול היצרן.הגדר את קלטת המגיב ותא הזרימה למכשיר הריצוף, והזן את מידע ריצת הרצף, בהתאם לפרוטוקול היצרן. הפעל רצף. ייצגו תוצאות.חשיפת מזהמים במיצוי DNA באיכות גבוהה נותרה הנקודה הקריטית בפרוטוקול שלנו. כדי לבחון ויזואלית אם הם מזהמים, הדגרנו את הטרדיגראד באנטיביוטיקה, שהיא פניצילין וסטרפטומיצין, וגם בדקנו את האדם במיקרוסקופ פי 500. כפי שמוצג כאן, מיקרובים גלויים סביב הטרדיגראדים מוארים לחלוטין.לאחר הומוגניזציה יעילה, מיצוי DNA, פיצול והכנת ספרייה. התפלגות הגודל של הספרייה מאומתת באמצעות אלקטרופורזה רגישה במיוחד לבקרת איכות. הקווים הסגולים והירוקים מציינים סמנים עליונים ותחתונים ב-1, 500 ו-25 זוגות בסיסים בהתאמה.נתיב L הוא סמן סולם, נתיב S ו-N1 עד N4 הם חמישה שכפולים של אותו ניסוי, כולם מתחילים מדגימה אחת של טרדיגראד. כפי שניתן לראות מהאחיד הרחב וההתפלגות בין 200 ל-1,000 זוגות בסיסים, הפרוטוקול שלנו ניתן לשחזור ביותר, אפילו עם הקלט האולטרה-נמוך. הנה התוצאה של QC מהיר, עבור קריאות מסונכרנות המתקבלות מריצת רצף יחידה.קריאות מתקבלות כקצוות רזרביים של 300 זוגות בסיסים, כאשר קריאות קדימה ואחורה מוצגות בחלק העליון והתחתון, בהתאמה. ההתפלגות המוצגת כאן אופיינית לקריאות קצה של 300 זוגות, עם קריאת בסיס באיכות גבוהה מאוד מעל Q30 עבור 200 זוגות הבסיסים הראשונים, ויורדת בהדרגה עד הסוף. אז שיטה זו משתמשת רק באדם אחד עבור דגימה אחת.אין דרישות לכמויות עצומות של בעלי חיים, כמו אלה שנדרשו בפרויקטים קודמים של ריצוף גנום טרדיגרד. שיטות התרבות עבור רוב הטרדיגראדים עדיין לא נקבעו. לכן, לאפשר ריצוף גנומי מפרט בודד, כמו אלה ישירות מעבודת השדה, תהיה השפעה גדולה על הביולוגיה המולקולרית של טרדיגראד, ואולי גם על בעלי חיים קטנים אחרים.שיטות ריצוף ה-DNA שלנו מאפשרות לנתח אורגניזמים מיקרוסקופיים רבים אחרים שעדיין לא רוצפו, כגון מיני חזיר נדירים, נמטודות, אשוחי מים ואפשרויות אחרות, על ידי חיבור החלק של האזורים ואזור ציבורי רחב יותר, מה שמקדם את הסביבה שבה מנגנונים ביולוגיים שונים עשויים להיות אפשריים.

ultralow-input-genome-sequencing-library-preparation-from-single

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

וזמינותו של כרומטין נגיש Transposase בשילוב עם תפוקה גבוהה רצף (האטא ק-seq) היא שיטה הגנום כולו לחשוף כרומטין נגיש. זהו פרוטוקול האטא ק-seq צעד אחר צעד, ממולקולרית לניתוח הסופי חישובית, אופטימיזציה עבור האדם לימפוציטים (Th1/Th2). פרוטוקול זה יכול להיות מאומץ על ידי חוקרים ללא ניסיון קודם בשיטות הדור הבא רצפי.

מיפוי הגנום כולו נגיש כרומטין של לימפוציטים מסוג T אנושי ראשוני על ידי האטא ק-Seq

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

מאמר זה מדגים פרוטוקול מפורט DNA בידוד ובניה ספריית תפוקה גבוהה רצף מחומר עשבייה כולל חילוץ של ה-DNA בצורה יוצאת דופן באיכות ירודה.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

עבודה זו מתאר פרוטוקול עבור הדור של רזולוציה גבוהה בחיי עיר ויטמינצ'יק ספריות מ מבוים בחוזקה gastrulation קדם דרוזופילה melanogaster עוברי.

הדור של הגנום כולו כרומטין קונפורמציה לכידת ספריות מעוברים דרוזופילה בחוזקה בשלבים המוקדמים

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

אנו מתארים שיטה ליצירת ספריות מוטציה טרנספוסון רוויבחיידקים גראם שלילי והכנה לאחר מכן של ספריות amplicon DNA להמשך תפוקה גבוהה. כדוגמה, אנו מתמקדים בפתוגן ESKAPE, Acinetobacter baumannii, אבל פרוטוקול זה הוא נוח למגוון רחב של אורגניזמים גראם שלילי.

יצירת ספריות הכנסה Transposon בחיידקים גראם שלילי עבור רצף בתפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.

אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

עבודה זו מציגה מיצוי RNA מהיר ושיטת השוואת רמת תעתיק לניתוח ביטוי גנים ב- Hypsibius exemplaris. באמצעות ליזה פיזית, שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה דורשת טרדיגרד יחיד כחומר המוצא ומביאה לייצור חזק של cDNA לתגובת שרשרת פולימראז שעתוק הפוך כמותי (qRT-PCR).

מיצוי RNA חד-חיה יחיד להשוואה של רמות תעתיק יחסיות באמצעות qRT-PCR בטרדיגראד Hypsibius exemplaris

למדו שיטה לריצוף גנום של טרדיגרדה (Hypsibius dujardini) מפרט בודד עם 50 פיקוגרם DNA בלבד. הפרוטוקול ממזער זיהום חיידקי באמצעות אנטיביוטיקה ובדיקה ויזואלית.

הגנום קלט ultralow רצף ספריית הכנה מ להצטננות Tardigrade

גלה סרטונים נוספים