שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות
25 באוגוסט 2018
כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק גישה לעיני עוף עובריות בסביבה חוץ גופית כדי לאפשר מחקר מעמיק של מסלולי התפתחות מורכבים בעובר. אצל התרנגולת העוברית, חקר העין הוא לרוב קשה, עקב התפתחות העפעפיים, תנועת העובר וצמיחת רקמות עובריות נוספות. לתרכובות כמו תרופות ומעכבים יכולות להיות גם השפעות קטלניות על העובר, מה שמקשה על השימוש בתרכובות אלה כדי לווסת מסלולי גנים.
ההתקדמות בתרבית רקמות במבחנה אפשרה למדענים לבודד את הרקמות הללו ולסלק רבים מהחסמים שהוזכרו לעיל. הפרוטוקול שלנו הוא יתרון בכך שהוא מאפשר לנו לחקור את העין בכללותה, כולל כל הרקמות שיש להן פוטנציאל לאינטראקציה במהלך ההתפתחות, כגון הרשתית העצבית והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית. התחל בחיטוי החומרים כדי להבטיח שכל התמיסות והציוד סטריליים לפני ההליך.
לשם כך, חיטוי שני ליטר מים מזוקקים וליטר אחד של מי מלח אפרוחים, יחד עם קופסת טישו, נייר סינון נקבובי למחצה, רשת תיל, מיכלי מים ופיפטות זכוכית חד פעמיות. עקרו היטב את מדפי החממה והדלת באמצעות אתנול 70%, ולאחר מכן מלאו את המיכלים במים מזוקקים וחיטוי, וחממו את החממה ל-37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את המדיום התזונתי, יחד עם צינור של האנטיביוטיקה פניצילין סטרפטומיצין באינקובטור.
הניחו מגבת נייר על פני סביבת העבודה ועיקרו עם אתנול 70%. עקר את כל המלקחיים והמספריים. כשראש העוף במי מלח אפרוחים חיטוי, חתכו את ראש הגוזל בקו האמצע, והשאירו מעט רקמה בטקט סביב כל עין.
הרקמה הנוספת תעזור לעין לשמור על מתח מסוים בתרבית, כמו גם תסייע בספיגת חומרים מזינים בכל העין ותמנע מהעין להחליק מנייר המסנן. רקמות אלו משמשות גם כציוני דרך בעת כיוון העין בניתוח מאוחר יותר. השאירו את הרקמה המנותחת במי מלח אפרוח בטמפרטורת החדר בזמן הכנת התרבית.
הכינו את מנת התרבות. מניחים שתי צלחות פטרי 35 מילימטר בתוך צלחת פטרי אחת של 100 מילימטר. מניחים רשת תיל אחת stage בכל צלחת קטנה.
הנח את חצי הראש עם העין על פיסת נייר פילטר, הטה מעט כדי להבטיח שהעין לא תחליק מהנייר. העבירו את נייר הטישו והסינון לצלחת הפטרי הקטנה על גבי רשת התיל stage. חזור על הפעולה עם חצי הראש השני של אותו עובר.
הוסף מדיום תרבית לכל אחת משתי צלחות הפטרי הקטנות. העלו את המדיום לגובה נייר הטישו. אין לטבול את הרקמה במדיום.
הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת מלאי האנטיביוטיקה פניצילין סטרפטומיצין למדיום התזונתי בכל מנה על מנת למנוע זיהום חיידקי. מניחים חתיכה מקופלת של רקמה דקה על הקצה הפנימי של צלחת הפטרי הגדולה יותר ומרטיבים אותה במים מזוקקים. דגרו את התרבות בחממה החשוכה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה ימים.
לאחר התרבות, הסר את הטישו מנייר הסינון וקבע ב-4% פרפורמלדהיד. העמודה הראשונה מציגה עין HH34, המייצגת את עין האפרוח העוברית בתחילת התרבות. העמודה השנייה מציגה עין אפרוח עוברית שגדלה במשך ארבעה ימים, החל מ-HH34.
העמודה השלישית מציגה עין HH38, המתאימה לארבעה ימים של התפתחות בתוך הביצית מעבר ל-HH34. לוחות A עד F אינם מוכתמים, בעוד שלוחות G עד I מוכתמים עבור האנזים פוספטאז אלקליין. השורה העליונה, לוחות A עד C, מראה שהעין ממשיכה להתפתח לאורך כל התרבות, עדות להופעת ניצני נוצות וצמיחת העפעפיים, המסומנים על ידי חיצים בכל לוח.
השורה האמצעית, לוחות D עד F, מראה כי פפילות הלחמית מתחילות להתנוון בתרבות. השורה התחתונה, לוחות G עד I, מראה כי הדפוס המרחבי-זמני של השראת עצמות סקלרליות נשמר בתרבית, ומשמשת דוגמה למסלול התפתחותי שניתן לחקור בשיטה זו. פרוטוקול זה מאפשר לרקמות לשמור על היבטים מרחביים וזמניים מרכזיים של ההתפתחות לאורך כל התרבית.
פרוטוקול זה מייצג התקדמות מרכזית בתרבות של איברי חישה שלמים, ומספק מתודולוגיה חלופית לחקר מסלולי ההתפתחות המורכבים המעורבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לתרבית אורגנוטיפית של איברי עוף עובריים, תוך התמקדות מיוחדת בעין. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד על התפתחותם של רקמות עובריות בסביבת in vitro מבוקרת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות גידול In Vitro
רקע
- חקר עיני עוברי תרנגולת הוא מאתגר בשל התפתחות העפעפיים ותנועת העובר.
- רקמות חוץ-עובריות מקששות את ניתוח התפתחות העין.
- שימוש בתרופות ובמעכבים עלול להיות קטלני עבור העובר, ובכך לעכב את המחקר.
- טכניקות של תרביות in vitro מסייעות בבידוד רקמות לצורך מחקר.
מטרת המחקר
- לאפשר גישה לעיניים של עוברים של תרנגולת לצורך מחקרי התפתחות.
- לאפשר בחינה של מסלולי התפתחות מורכבים.
- לחקור אינטראקציות בין רקמות עיניות שונות במהלך ההתפתחות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עיקור חומרים באמצעות אוטוקלאב.
- תרבית אורגנוטיפית של רקמות עובריות של עוף.
- בידוד העין והרקמות המקיפות אותה.
- ניתוח מעמיק של מסלולי התפתחות.
תוצאים עיקריים
- הפרוטוקול מאפשר את חקר העין כמערכת אחת שלמה.
- ניתן לצפות באינטראקציות בין הרשתינה העצבית לבין האפיתל הפיגמנטרי של הרשתינה.
- ניתן לערוך מחקר ללא ההשפעות הקטלניות של תרכובות על העובר.
- הבנה משופרת של תהליכי התפתחות העין.
מסקנות
- פרוטוקול הטיפוח האורגנוטיפי יעיל לחקר עיניים של עוברי תרנגולות.
- שיטה זו מתגברת על חסמים הקיימים במחקרים מסורתיים של עוברים.
- היא מספקת פלטפורמה למחקר עתידי בביולוגיה התפתחותית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חקר מסלולי התפתחות מורכבים in vivo מוגבל לעיתים קרובות עקב תמותה עוברית, נגישות רקמות ורעילות של תרכובות. גידול אורגנוטיפי של רקמות עובריות של עוף מאפשר בחינה מבודדת ומבוקרת של אינטראקציות ברמת האיבר, תוך שימור דינמיקה התפתחותית מרחבית-זמנית. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף מטרות ובחינת מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה והסגנלינג הבין-תאי במהלך ההתפתחות.
- ערך תפעולי: מפחית את ההסתמכות על מודלים של עוברים שלמים, ובכך ממזער שונות הנובעת מתנועת העובר ומחשיפה לתרכובות קטלניות.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מתן אפשרות לבדיקת תגובה למספר (dose-response) של מעכבים ותרופות בהקשר של רקמה חיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק פלטפורמה סטנדרטית לקריאות כמותיות של מורפולוגיית רקמה וביטוי של סמנים ביולוגיים לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מקל על שחזור הבדיקה באמצעות תנאי תרבית סטריליים ומוגדרים והכנת רקמה עקבית.
- ערך סקילביליות: מאפשר עיבוד מקבילי של מספר תרביות של חצאי ראש לצורך סריקה השוואתית של תרכובות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: שומר על לוחות זמנים התפתחותיים הרלוונטיים למחלה, מה שמאפשר קורלציה עם שלבים in-ovo כגון HH34 עד HH38.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: משמר דפוסים מרחביים-זמניים כגון השראה של גרמי הלובן (scleral ossicle), ובכך תומך בניתוח מסלולים התואם לסמנים ביולוגיים.
- ערך רציפות: מגשר בין תהליכי גילוי למסלולי עבודה פרה-קליניים על ידי אפשור תצפית אורך של דגנרציה והבשלת רקמות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת מערכת הניתנת לשחזור לצורך ניתוח של מסלולים התפתחותיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות של מסלולי גנים באמצעות יישום מקומי של תרכובות ללא רעילות מערכתית לעובר.
- סריקה: מאפשרת הערכה כמותית וסטנדרטית של תגובות רקמה למודולטורים פרמקולוגיים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים הכוללים שינויים במבנה הרקמה, דפוסי דגנרציה ופרופילים של ביטוי אנזימטי.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על התקדמות התפתחותית הדומה ללוחות זמנים של in-ovo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לחקר התפתחות איברי חישה במגוון פרויקטים ותחומים טיפוליים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי שימור אינטראקציות של רקמה טבעית וקינטיקה התפתחותית.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות טכניקה סטרילית, מצעים מוגדרים ודגירה מבוקרת.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי הפחתת תוצאות חיוביות שגויות הנובעות מקטלניות עוברית או ממנגנוני פיצוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם סיכון בהתבסס על מודולציה מאומתת של מסלולים התפתחותיים.
שיקולי יישום
- דורש טכניקה אספטית וגישה לאוטוקלאב, אינקובטור וכלי ניתוח סטריליים.
- תלוי בדירוג עקבי של שלבי העובר ובהכנת מצע תזונה.
- מחייב סטנדרטיזציה של אוריינטציית הרקמה ומיקום נייר הסינון לצורך הדמיה מהימנה.
- מוגבל למשך תרבית ex vivo של עד ארבעה ימים לפני התדרדרות משמעותית של הרקמה.
- דורש אופטימיזציה עבור מדדים ספציפיים כגון אימונופלואורסצנציה או צביעה אנזימטית.
