Name: שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: למד שיטת תרבית אורגנוטיפית לעיניים עובריות של תרנגולת לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת בידוד רקמות העין ומחקר מסלולים התפתחותיים מורכבים מבלי לפגוע בעובר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות גרגורי האלר (הר סנט וינסנט אוניברסיטת) עבור עבודתו ראשוני בפיתוח של הפרוטוקול. המחברים רוצה גם להודות ג'ונס ניקולס (אוניברסיטת סנט וינסנט הר) עבור שלו מומחיות טכנית ועזרה עם הצילומים וייצור של חלק אודיו-ויזואלית של כתב היד. דניאל אנדרוז נתמכה על ידי מימון MSVU ו מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) דרך פרס מחקר של סטודנטים לתואר ראשון. תמרה א פרנץ-Odendaal נתמך על ידי מענק גילוי NSERC.

הערה: עבור העובר בשלבים, לנצל את ההמבורגר והמילטון12 (HH) היערכות טבלה.
1. העובר דגירה
<ol><li>דגירה הביצים עוף מופרית חממה סטרילי, בטמפרטורה מבוקרת-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות.</li>
	<li>להפוך את הביצים 1 x ליום ולאפשר להם דגירה עד HH34 (8 ימים לאחר ההפריה).</li>
</ol>2. הכנה ועיקור של החומרים
<ol><li>עבור 12 עוברי, החיטוי 2 ל' מים מזוקקים, 1 ליטר של תמיסת מלח צ'יק 0.85%, פיפטות זכוכית 12, 1 קופסה של נייר טישו, 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועי נייר סינון נקבוביים למחצה ו- 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועים של תיל פלדה רשת עם קצוות מעוגלים כלפי מטה. כדי לעקר את החומרים, החיטוי אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. הערה: autoclaving של החומרים יכול להיעשות מראש.</li>
	<li>לעקר את החממה עם 70% אתנול שתמחקי את הצדדים, מדפים, הדלת. מניחים 2 מיכלי פלסטיק המכיל בלוק מזוקקים מים בתוך החממה כדי לשמור על לחות. Prewarm החממה תרבות כדי 37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות. להבטיח שהחממה חשוך לחלוטין; אם הדלת שקוף, מכסה אותו עם נייר כסף.</li>
	<li>Prewarm 100 מ של חומר מזין בינוני, 1 מ"ל של פניצילין על-ידי הצבתם בחממה תרבות.</li>
	<li>מכסה את סביבת העבודה עם מגבת נייר, לעקר את הספסל על ידי התזה עם 70% אתנול. לחטא 2 זוגות של מלקחיים, חיתוך מספריים, סכין גילוח, כפית פלסטיק עם 70% אתנול באופן דומה.</li>
	<li>צלחות פטרי סטריליות 100 מ מ מקום 12 ו- 24 צלחות פטרי סטריליות 35 מ מ על הספסל לשימוש. ודא שהמנות נשארים בשקית סטרילית עד השימוש.</li>
</ol>3. עובר הכנה
הערה:, מנקודה זו ואילך, תלבש מסיכת פנים מגן אבק כדי להימנע מזיהום התרבויות. זיהום חיידקי או פטרייתי יהרוס את התרבות, ויש סיכון של זה מתפשטת במהירות בכל התרבויות בחממה.
<ol><li>לפצח את הביצה ולהעביר את העובר צלחת פטרי 100 מ מ המכיל תמיסת מלח צ'יק 0.85%. בשלב העובר על פי התכונות אנטומי תיאר המבורגר, המילטון היערכות הנחיות12 , לאשר העובר הוא HH34.</li>
	<li>חתך את הצוואר, ואז קטיעות ראש העובר בקו האמצע באמצעות תער מעוקר. בעזרת מלקחיים סטרילי, מסירים את המוח. להשאיר את האף ללא פגע.</li>
</ol>4. תרבות ההתקנה
<ol><li>2. המקום של 35 מ מ פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ מ אחד.</li>
	<li>מניחים רשת תיל פלדה בתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, העברה 1 של ראשי זיבצנטן פיסת נייר סינון נקבוביים למחצה 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ עם העין פונה כלפי מעלה. ודא הרקמה מאובטחת לא להחליק על-ידי הטיית אותו מעט.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, בזהירות המקום רקמת העין, נייר הסינון על גבי רשת התיל פלדה 1 של 35 מ מ פטרי, יצירת במה מוגבהת עם רקמת העין על העליונה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3 ו- 4.4 עם חצי ראש אחרים.</li>
	<li>בזהירות בעזרת פיפטה של זכוכית סטריליים, להוסיף את מזין בינוני ישירות לתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ עד שהוא מגיע לרמת נייר הסינון. לא להטביע את הראש חצי במדיום התזונתי.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין המדיום מזין בכל צלחת פטרי.</li>
	<li>מקפלים פיסת נייר טישו לתוך כיכר קטנה ומניחים אותו בתוך 100 מ מ פטרי. להרטיב אותה במים מזוקקים בלוק.</li>
	<li>מקם את המנה תרבות לתוך החממה סטרילי, כהה-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות עד 4 ימים.</li>
	<li>חזור על שלבים 3 ו- 4 עבור כל העובר. הערה: מספר העוברים צריך יהיה תלוי בניסוי מסוים; כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עוברי 12.</li>
</ol>5. תרבות תחזוקה
<ol><li>פעם אחת ביום, למעלה למעלה את מיכלי פלסטיק בחממה עם מים מזוקקים טריים, בלוק.</li>
	<li>מדי יום בדוק בכל התרבויות עבור זיהומים חיידקים או פטריות. תרבויות זה יש התפוררה או שבהם המדיום השתנה צבע נגועים. למחוק את כל התרבויות שהודבקו.</li>
</ol>6. קיבוע
<ol><li>בעקבות culturing, הסר את כל המנות של החממה.</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים, להסיר בעדינות את העין נייר הסינון, מטפל לא לקרוע את הרקמה.</li>
	<li>לתקן את רקמת העין paraformaldehyde 4% 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח בן לילה ב 4 ° C או בפורמלין באגירה נייטרלי 10% למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אחסן את הרקמה ב 4 ° C 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח.</li>
</ol>

<ol><li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18855894">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li>
<li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos%3A+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+the+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li>
<li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li>
<li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943(2015).</li>
<li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498(2015).</li>
<li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora%3A+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation%3A+implications+for+periodic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li>
<li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li>
<li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+take+on+an+old+story%3A+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171(2015).</li>
<li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4380223/">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48 (0), 181-191 (2004).</li>
<li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones%3A+the+scleral+ossicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li>
<li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li>
<li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li>
<li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129(2015).</li>
<li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306(2007).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה עושה שימוש רקמת הוקמה culturing הטכניקות להשגת צמיחת יש עין עוף מיום עובריים 8 (HH34) במבחנה 4 ימים. שיטה זו רשת culturing תוארה במקור על ידי Trowell15. אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול מ של פינטו ואולם 1991 המחקר16 ניצול קרום נקבוביים למחצה עם רשת ללמוד אינדוקטיבית אותות בין רקמות מופרדים שכבות של העין עובריים עוף15. באמצעות שיטה זו, מקק תרבותי עוף 14 - בן יום עצם הירך6. שיטה זו גם הוכח כיעיל ב culturing העכבר ...

העוף עובריים (גאלוס גאלוס) הוא אורגניזם מודל מצוין נפוץ בתחום הביולוגיה. תקופת הדגירה שלו הוא בערך 21 ימים, ביצים רבות יכול להיות מודגרות בו זמנית, ביצוע ניסויים מהיר ויעיל. ואולי הכי חשוב, העובר בקלות גם מטופל, המאפשרים לימוד מקיף של תהליכים התפתחותיים המפתח, של גנים, חלבונים כי הכונן תהליכים אלה.
עין עוף עובריים היא איבר מורכב אשר מפתחת דרך האינטראקציה של מספר ברקמות שונות דומה מערכות גוף רבות אחרות. שיטה זו מאפשרת למידת ההתפתחות של רקמות אלה, במיוחד בשלבים מתקדמים של פיתוח. לדוגמה, ייתכן הרשתית רב שכבתית עניין מיוחד הלומדים הפיתוח של מערכת העצבים. שיטות אלטרנטיביות שמאפשרות המחקר של רקמות העין אחרות כגון הקרנית, הגוף vitreal, העדשה, את sclera העפעפיים הם להועיל לחוקרים. העין עובריים עוף מכיל גם סדרה של עצמות שטוחות, עצמות השמע scleral, אשר יכול לשמש כמודל לחקר של עצם intramembranous אינדוקציה, התקשות חולייתנים1.
כיום, ישנן מספר שיטות חקר התפתחות. Microinjections של נוגדנים מעכבות או אחרים מולקולות מעכבות2,3, שהושתל. גרגרי טבולים מעכב4, אלקטרופורציה5 הם כל השיטות יכול לשמש downregulate גנים או חלבונים עניין בהעובר. שיטות דומות משמשות upregulate חלבונים. שיטות אלה אינן ללא המגבלות שלהם. לדוגמה, בעת שימוש בכימיקלים כדי לשנות את ההתפתחות, הערכת ההשפעות קטלני על העובר, זה מגביל את השימוש השיטות דלעיל לאתרים לשפות אחרות של יישום במינונים נמוכים מספיק כדי להבטיח את השרידות של . אני אדם מסוכן
במבחנה culturing רקמות שימש במגוון רחב של אורגניזמים ללמוד פיתוח, יכול לשמש כדי לעקוף חלק מהמגבלות הנ. לדוגמה, femora6, נוצה ניצנים7,8ו הגפיים9 של העוף כל נחקרו באמצעות רקמות culturing שיטות, כמו שיש את האשכים של העכבר10 ושורשים והגבעולים של צמחים11. שיטות אלה מעניקים מדענים רמה גבוהה של שליטה על הפיתוח רקמות, כגון היכולת להשתנות הטמפרטורה ולשנות את זמינות חומרי הזנה. בידודו של הרקמה של העובר כל גם עושה את זה הרבה פחות רגישים להשפעות קטלני של כימיקלים, ובכך מאפשר מניפולציה מחקרים בקנה מידה עולמי בריכוזים גבוהים. יתרון בולט נוסף של במבחנה culturing הוא שימור הסביבה התאית של הרקמה; הסידור של רקמות נותר כמעט ללא שינוי, כך שניתן ללמוד את האינטראקציות בין סוגי רקמות שונות9. לפיכך, במבחנה culturing פותח דלתות נוספות ניסיוני גישות שאינן זמינות במודלים vivo או בכל ovo .
כיום, ללמוד על התפתחות העין עוף עובריים שימוש בכימיקלים הוא מאתגר במיוחד. מספר של ממברנות extraembryonic לכסות את העובר, ולכן קשה ליישם את גרגרי או כימיקלים; העובר הוא מאוד פעיל בתוך הביצה גם כאשר הוא מזדקן, שמסבך עוד יותר את שיטת כבר קשה. פרוטוקול זה מאפשר גישה נוחה לעין, הרקמות הסובבות שלו, ביטול מחסומים אלה, גם בעת מתן הזדמנויות חדשות לבחון תהליכים התפתחותיים בתוך העין. פרוטוקול זה הוקם כדי ללמוד את תנאי הגיוס של עצמות השמע scleral בתוך העין עובריים.

<table><tbody><tr><td>צלחות פטרי תרבית תאים 35 מ"מ</td> צלחת תרבית רקמות <td>קורנינג</td><td>353001</td><td>אחיזה קלה, פוליסטירן,</td></tr><tr><td>צלחות פטרי תרבית תאים 100 מ"מ</td> לא פירוגניות <td>צלחת תרבית רקמות קורנינג 353003, פוליסטירן, רקמת נייר לא פירוגנית</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>מגבי משימות מותג Kimtech Science, 280 לכל רשת</td></tr><tr><td>תיל</td> קרטון <td>n/a</td><td>n/a</td><td>רשת תיל נירוסטה (גודל רשת 0.7 מ"מ)</td></tr> <tr><td>פיפטות זכוכית חד פעמיות</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>זכוכית בורוסיליקט חד פעמית 5 3/4 אינץ'</td></tr> <tr><td>מזין בינוני</td><td>Gibco</td><td>12591-038</td><td>שינוי פיטון-ג'קסון, [+] L-גלוטמין עם פנול אדום (BGJB)</td></tr> <tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4458</td><td>10000 יחידות/מ"ל תמיסת סטרפטומיצין פניצילין מסנן מיוצב</td></tr><tr><td> נייר</td><td>Whatman</td><td>1454 090</td><td>נייר סינון חצי נקבובי 90 מ"מ</td></tr><tr><td>ביצי עוף מופרות</td><td>המכללה החקלאית של אוניברסיטת דלהאוזי</td><td>n/a</td><td>ניתן להשיג מחוות מקומיות</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>EMD</td><td>SX0420-3</td><td>גבישי נתרן כלורי, מגיב</td></tr><tr><td>כיתה 1 L בקבוק זכוכית</td><td>VWR</td><td>89000-240</td><td>1 ליטר פיירקס בקבוק זכוכית חיטוי</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP82011</td><td>70% מיכלי טאפרוור בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>שנרכשו בחנות ומעוקרים עם</td></tr><tr><td>סכיני גילוח חד פעמיים</td> של EtOH <td>VWR</td><td>55411-050</td><td>סכיני גילוח תעשייתיים בקצה יחיד (פלדת פחמן כירורגית)</td></tr> <tr><td>כפיות פלסטיק</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>נקנו בחנות ומעוקרים עם</td></tr><tr><td>מסכת אבק</td><td>EtOH 3M</td><td>n/a</td><td>3M 8500 מסכת נוחות</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td>פרפורמלדהיד, דרגת ריאגנט,</td></tr><tr><td>פורמלין ניטרלי גבישי חוצץ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>72210</td><td>10% ניטרלי חוצץ פורמלין</td></tr><tr><td>פוספט מלח (PBS)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>10X פוספט חוצץ תמיסת מלח pH 7.4 (137 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 4.3 מ"מ Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות בז</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td>צינורות צנטריפוגה מעוקרים</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>n/a</td><td>מלקחיים עדינים</td></tr><tr><td>אפרוחים מלח&nbsp;</td><td>n/a</td><td>n/a&nbsp;</td><td>0.85% NaCl</td></tr><tr><td>נייר כסף</td><td>N/A</td><td>N/A</td> מגבת נייר <td>שנרכשה בחנות</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>נקנה בחנות</td></tr></tbody></table>

שיטת organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

העוף עובריים הוא נפוץ כאורגניזם מודל אמין לפיתוח חוליות. הנגישות שלה, דגירה קצרה תקופה הופך אותו לאידיאלי עבור ניסויים. כיום, המחקר של המסלולים הללו התפתחותית של העובר עוף מבוצע על-ידי החלת מעכבי וסמים באתרים המותאמות לשפות אחרות, בריכוזים נמוכים, תוך שימוש במגוון שיטות. במבחנה culturing רקמות היא טכניקה המאפשרת המחקר של רקמות הופרדו האורגניזם המארח, בזמן בו זמנית תוך עקיפת רבים של המגבלות הפיזיות נוכח בעת עבודה עם כל העוברים, כגון הרגישות של העוברים על מינונים גבוהים של כימיקלים קטלני. כאן, אנו מציגים את organotypic culturing פרוטוקול culturing את העוף מתחלקים חצי ראש במבחנה, המציג הזדמנויות חדשות עבור בחינת תהליכים פיתוחיים מעבר השיטות כיום הוקמה.

באמצעות שיטה זו, עין עוף עובריים יכולים להיות מחונן יום 8 של התפתחותו (HH34) במבחנה 4 ימים ארבעה ימים של ovo פיתוח מקביל HH38.
שיטה זו culturing תומך בפיתוח של נוצה ניצנים סביב העין, על העפעפיים (איור 1B). אלה ניצנים נוצה אינם נוכחים ב ovo -HH34 לפני culturing (איור 1 א'), המציין כי פיתוח באד נוצה מאותחלת במהלך תקופת culturing, כפי שהוא ב ...

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק גישה לעיני עוף עובריות בסביבה חוץ גופית כדי לאפשר מחקר מעמיק של מסלולי התפתחות מורכבים בעובר. אצל התרנגולת העוברית, חקר העין הוא לרוב קשה, עקב התפתחות העפעפיים, תנועת העובר וצמיחת רקמות עובריות נוספות. לתרכובות כמו תרופות ומעכבים יכולות להיות גם השפעות קטלניות על העובר, מה שמקשה על השימוש בתרכובות אלה כדי לווסת מסלולי גנים.ההתקדמות בתרבית רקמות במבחנה אפשרה למדענים לבודד את הרקמות הללו ולסלק רבים מהחסמים שהוזכרו לעיל. הפרוטוקול שלנו הוא יתרון בכך שהוא מאפשר לנו לחקור את העין בכללותה, כולל כל הרקמות שיש להן פוטנציאל לאינטראקציה במהלך ההתפתחות, כגון הרשתית העצבית והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית. התחל בחיטוי החומרים כדי להבטיח שכל התמיסות והציוד סטריליים לפני ההליך.לשם כך, חיטוי שני ליטר מים מזוקקים וליטר אחד של מי מלח אפרוחים, יחד עם קופסת טישו, נייר סינון נקבובי למחצה, רשת תיל, מיכלי מים ופיפטות זכוכית חד פעמיות. עקרו היטב את מדפי החממה והדלת באמצעות אתנול 70%, ולאחר מכן מלאו את המיכלים במים מזוקקים וחיטוי, וחממו את החממה ל-37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את המדיום התזונתי, יחד עם צינור של האנטיביוטיקה פניצילין סטרפטומיצין באינקובטור.הניחו מגבת נייר על פני סביבת העבודה ועיקרו עם אתנול 70%. עקר את כל המלקחיים והמספריים. כשראש העוף במי מלח אפרוחים חיטוי, חתכו את ראש הגוזל בקו האמצע, והשאירו מעט רקמה בטקט סביב כל עין.הרקמה הנוספת תעזור לעין לשמור על מתח מסוים בתרבית, כמו גם תסייע בספיגת חומרים מזינים בכל העין ותמנע מהעין להחליק מנייר המסנן. רקמות אלו משמשות גם כציוני דרך בעת כיוון העין בניתוח מאוחר יותר. השאירו את הרקמה המנותחת במי מלח אפרוח בטמפרטורת החדר בזמן הכנת התרבית.הכינו את מנת התרבות. מניחים שתי צלחות פטרי 35 מילימטר בתוך צלחת פטרי אחת של 100 מילימטר. מניחים רשת תיל אחת stage בכל צלחת קטנה.הנח את חצי הראש עם העין על פיסת נייר פילטר, הטה מעט כדי להבטיח שהעין לא תחליק מהנייר. העבירו את נייר הטישו והסינון לצלחת הפטרי הקטנה על גבי רשת התיל stage. חזור על הפעולה עם חצי הראש השני של אותו עובר.הוסף מדיום תרבית לכל אחת משתי צלחות הפטרי הקטנות. העלו את המדיום לגובה נייר הטישו. אין לטבול את הרקמה במדיום.הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת מלאי האנטיביוטיקה פניצילין סטרפטומיצין למדיום התזונתי בכל מנה על מנת למנוע זיהום חיידקי. מניחים חתיכה מקופלת של רקמה דקה על הקצה הפנימי של צלחת הפטרי הגדולה יותר ומרטיבים אותה במים מזוקקים. דגרו את התרבות בחממה החשוכה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה ימים.לאחר התרבות, הסר את הטישו מנייר הסינון וקבע ב-4% פרפורמלדהיד. העמודה הראשונה מציגה עין HH34, המייצגת את עין האפרוח העוברית בתחילת התרבות. העמודה השנייה מציגה עין אפרוח עוברית שגדלה במשך ארבעה ימים, החל מ-HH34.העמודה השלישית מציגה עין HH38, המתאימה לארבעה ימים של התפתחות בתוך הביצית מעבר ל-HH34. לוחות A עד F אינם מוכתמים, בעוד שלוחות G עד I מוכתמים עבור האנזים פוספטאז אלקליין. השורה העליונה, לוחות A עד C, מראה שהעין ממשיכה להתפתח לאורך כל התרבות, עדות להופעת ניצני נוצות וצמיחת העפעפיים, המסומנים על ידי חיצים בכל לוח.השורה האמצעית, לוחות D עד F, מראה כי פפילות הלחמית מתחילות להתנוון בתרבות. השורה התחתונה, לוחות G עד I, מראה כי הדפוס המרחבי-זמני של השראת עצמות סקלרליות נשמר בתרבית, ומשמשת דוגמה למסלול התפתחותי שניתן לחקור בשיטה זו. פרוטוקול זה מאפשר לרקמות לשמור על היבטים מרחביים וזמניים מרכזיים של ההתפתחות לאורך כל התרבית.פרוטוקול זה מייצג התקדמות מרכזית בתרבות של איברי חישה שלמים, ומספק מתודולוגיה חלופית לחקר מסלולי ההתפתחות המורכבים המעורבים.

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח...

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

מאמר זה מתאר תיוג פני...

מעקב אחר דפורמציות המוךפו&quot;גנטי שהולך רקמות בעובר צ&#39;יק מוקדם

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

מודלים תרבית תאים מספקים שליטה מפורטת על תנאים סביבתיים ובכך מספקים פלטפורמה רבת עוצמה על מנת להבהיר היבטים רבים של ביולוגיה של תא עצבי. אנו מתארים שיטה מהירה, זולה, ואמינה לבודד, לנתק, ותרבות תאי עצב תחושתי מעובר חומוס. פרטים של הכנת המצע וimmunocytochemistry גם מסופקים.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

צפייה וגישה לעובר התרנגולת במהלך ההתפתחות יכולה להיות מאתגרת. פיתחנו שיטת ex ovo שהיא פשוטה, חסכונית וניתן להשתמש בה בקלות בכיתה או במסגרת מחקר. שיטה זו מספקת גישה לעובר בשלבים מאוחרים של התפתחות עוברית (HH 40).

מותאם באופן מיטבי Ex-אובו Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

מאמר זה מספק גישה מעודכן למערכת כמירה שליו-עוף קלאסית ללמוד היווצרות האיברים, על ידי שילוב של הרומן במבחנה , ב ovo בצרות.

גישה דו-שלבית לחקור ו מאוחר-בשלבים המוקדמים של היווצרות האיברים במודל העופות: בלוטת התימוס, בלוטות יותרת התריס Organogenesis הפרדיגמה

מאמר זה מספק שיטה לבודד טהור עובריים רקמות מעוברים שליו ועוף שניתן לשלבם לטופס ex-vivo האיברים chimeric.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

גפיים רקומביננטיות הן מודל ניסיוני רב עוצמה המאפשר לחקור את תהליך התמיינות התאים ויצירת דפוסים בהשפעת אותות עובריים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת גפיים רקומביננטיות עם תאי עוף גפיים-מזודרמליים, הניתנים להתאמה לסוגי תאים אחרים המתקבלים מאורגניזמים שונים.

גפיים רקומביננטיות של עוף בודקות כדי להבין את מורפוגנזה, דפוסים וצעדים מוקדמים בהתמיינות תאים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להשתלת אורגנואידים בכליות בחלל הצלומי של עוברי תרנגולות. שיטה זו גורמת לכלי דם ולהבשלה משופרת של האורגנואידים תוך 8 ימים וניתן להשתמש בה כדי ללמוד תהליכים אלה בצורה יעילה.

וסקולריזציה יעילה של אורגנואידים בכליות באמצעות השתלה אינטרסלומית בעוברי תרנגולות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לשלושה סוגים של תרביות צמחי עור עובריים של עופות שניתן להשתמש בהם כדי לבחון אינטראקציות בין רקמות, סרט צילום בהילוך מהיר של הדמיה 4D (3D plus time), הפרעה גלובלית או מקומית של תפקוד מולקולרי ואפיון ביולוגיה של מערכות.

שימוש בעציצים מעור העופות לחקר תבניות רקמות ואורגנוגנזה

למד שיטת תרבית אורגנוטיפית לעיניים עובריות של תרנגולת לחקר ביולוגיה התפתחותית. שיטה זו מאפשרת בידוד רקמות העין ומחקר מסלולים התפתחותיים מורכבים מבלי לפגוע בעובר.

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

גלה סרטונים נוספים