תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר במדעי המוח, כגון אפיון אוכלוסיית נוירולוגית או זיהוי מקורות ומטרות של מערכות שידור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לקבוע את פרופיל הביטוי של קבוצת גנים שנבחרה מראש מתא בודד במהירות ובקלות. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי עכבר המגוון האקראי.

ניתן ליישם אותו גם על סוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים ובמודלים רבים של בעלי חיים. הדגמה זו של שיטה זו היא קריטית מכיוון שצעדי העצירה והשאיפה יכולים להיות קשים ללמידה מכיוון שהנתונים זקוקים לכמות של ציטופלזמה כדי לנתח. לפני החיתוך, הכינו ערכת חיתוך המכילה מספריים כירורגיים, מספריים קשתית עדינה, שתי מרית, מלקחיים, דיסק פילטר נייר ודבק ציאנואקרילט.

לאחר מכן יש להרוות את תמיסת החיתוך הקר בקרבוגין ולקרר את תא החיתוך בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הקרקפת של החיה ופתח את הגולגולת. חלצו את המוח בזהירות והניחו אותו בכוס קטנה מלאה בתמיסת חיתוך קר קרבוגן.

לאחר מכן, הסר את תא החיתוך מ -20 מעלות צלזיוס שלילי והסר את הלחות בעזרת מגבת נייר. נתח בזהירות את המוח כדי לבודד את אזור העניין. הדביקו אותו לתא החיתוך והוסיפו את תמיסת החיתוך הקרה כקרח.

בעזרת ויברטון חותכים פרוסות בעובי 300 מיקרומטר. מעבירים את הפרוסות לתא מנוחה מלא בתמיסת חיתוך מחומצנת בטמפרטורת החדר ומאפשרים להן להתאושש לפחות 30 דקות. עבור RT-PCR של תא בודד ואפיון התא הממוקד, הגבל את הקלטת התא כולו ללא יותר מ-20 דקות על מנת לשמר את ה-mRNAse.

בסיום ההקלטה הכינו צינור PCR של 500 מיקרוליטר מלא בשני מיקרוליטר של תערובת 5xRT ו-0.5 מיקרוליטר של 20xDTT. סובב אותו ואחסן אותו על קרח. לאחר מכן קצרו את הציטופלזמה של התא על ידי הפעלת לחץ שלילי עדין.

נטר ושלוט בתכולת התא מלהיכנס לפיפטה תוך שמירה על אטימה הדוקה והימנע מאיסוף הגרעין אם נלקחים בחשבון גנים מסוימים. במקרה של גן, חיוני להימנע מאיסוף הגרעין ולכלול קבוצה של פריימרים שמטרתם להגביר את ה-gDNA כדי להכין זיהום כללי. אם הגרעין מתקרב לקצה הפיפטה, שחררו את הלחץ השלילי והרחיקו את הפיפטה.

ודא שהאטם ההדוק נשמר והפעל מחדש את איסוף הציטופלזמה במיקום הפיפטה החדש. לאחר מכן, משוך את הפיפטה בעדינות כדי ליצור טלאי חיצוני החוצה כדי להגביל את הזיהום על ידי הפסולת החוץ-תאית ולהעדיף את סגירת קרום התא לניתוח היסטו-כימי לאחר מכן. זכור כי nubs, מיקרו-מניפולטורים, מקלדת מחשב או עכבר מחשב, הם מקורות טעונים בפרוטונים לזיהום rnase.

אם נגעו בהם במהלך ההקלטה, החלף את הכפפות. לאחר מכן, חבר את הפיפטה לאקסלר, והוציא את תכולתה לתוך צינור ה-PCR על ידי הפעלת לחץ חיובי. שברו את קצה הפיפטה לתוך צינור ה-PCR כדי לסייע באיסוף תכולתו.

לאחר מכן, צנטריפוגה קצרה הצינור מוסיף 0.5 מיקרוליטר של מעכב RNAse ו-0.5 מיקרוליטר RTAse. מערבבים בעדינות, שוב צנטריפוגה, ודוגרים למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, סובב את השפופרת ואחסן אותה בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד מספר חודשים.

עד לניתוח PCR וביצוע שלב ההגברה הראשון. כדי לאמת PCR, לערבב ולדלל זוג פריימר, הוסף מיקרוטולר אחד עם הפיפטה המוקדשת ל-RTPCR של תא יחיד. הגדר את המחזור התרמו למשך שלוש דקות על 95 מעלות צלזיוס, הפעל 40 מחזורים ואחריהם שלב התארכות אחרון ב-72 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

כדי למזער את היווצרותם של דימרים פריימר, בצע התחלה חמה על ידי הנחת צינורות ה-PCR במחזור התרמו שחומם מראש ב-95 מעלות צלזיוס. לאחר 30 שניות, הוציאו במהירות 20 מיקרוליטר מתערובת הפריימר על גבי השמן. לאחר אימות זוג הפריימר, בדוק אותו עם פרוטוקול המולטיפלקס.

מערבבים ומדללים את הפריימר החיצוני יחד במיקרו טוחנת אחת. אחסן את תערובת הפריימר המולטיפלקס בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס עד מספר שבועות. לאחר מכן, הכינו תערובת מוקדמת והניחו אותה על קרח.

העיף את צינור ה-PCR וסובב אותו והוסף שתי טיפות שמן מינרלי. לאחר שלוש דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, הפעל 20 מחזורי PCR. בצע התחלה חמה כמתואר עם 20 מיקרוליטר של תערובת פריימר מולטיפלקס.

לאחר מכן, הכינו מספר צינורות PCR זהים למספר הגנים המנותחים. הכינו תערובת מוקדמת באמצעות מיקרוליטר אחד של מוצר ה-PCR הראשון לכל גן כתבנית. התאם את כל הנפחים בהתאם למספר הגנים לניתוח ושקול להשתמש ב-10% מהנפח הנוסף כדי לפצות על שגיאות פיפטינג.

יש לנער בעדינות, לסובב את השפופרת ולשלוח 80 מיקרוליטר של תערובת מוקדמת לכל שפופרת PCR. הוסיפו שתי טיפות שמן מינרלי לכל שפופרת מבלי לגעת בדופן או במכסה של הצינורות. הפעל 35 מחזורי PCR ולאחר מכן בצע התחלה חמה על ידי הוצאת 20 מיקרוליטר של תערובת פריימר פנימית.

נתח את פרויקטי ה-PCR השניים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל ארגוז. נוירון פירמידלי משכבה חמש זוהה ויזואלית על ידי הסומה הגדולה שלו ודנדריט אפיקלי בולט. הקלטת תאי משיכה חשפה תכונות אלקטרו-פיזיולוגיות אופייניות של נוירונים מזנקים רגילים בשכבה חמש עם התנגדות קלט נמוכה, פוטנציאל פעולה ארוך טווח והסתגלות בולטת לתדר ספייק.

הניתוח המולקולרי של נוירון זה חשף את הביטוי של vGluT1, ואישר את הפנוטיפ הגלוטמטרגי שלו. נוירון זה ביטא גם סומטוסטטין ו-ATP1-alpha-1 ושלוש יחידות משנה של ATPAs נתרן-אשלגן. תיוג ביוציטין של הנוירונים המוקלטים, אישר מורפולוגיה פירמידלית.

כצפוי מהנוירונים הגלוטמטרגיים, הניתוח המולקולרי של 26 תאי פירמידה בשכבה חמש, חשף את הביטוי של vGluT1 אך אף אחד משני ה-GAD. ברגע שניתן לבצע טכניקה תוך יומיים, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר מאוד כדי להימנע מזיהומים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחקור את הביטוי של 10 גנים בו זמנית מתאים בודדים המאופיינים בגושי טלאים על פי פרוסות מוח, לאחר קצירת ציטופלזמה, שעתוק הפוך ו-PCR בהתחלה חמה. אל תשכח שעבודה עם אתידיום ברומיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות וחלוקי מעבדה בעת ביצוע הליך זה.