פרידה של Aldehydes, קטונים תגובתי תערובות באמצעות פרוטוקול החילוץ ביסולפאט
2 באפריל 2018
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להסיר aldehydes, קטונים תגובתי תערובות לפי פרוטוקול מיצוי נוזל-נוזל ישירות עם ביסולפיט רווי ב הממס miscible. פרוטוקול משולב זה הוא מהיר ולא נתיישב לביצוע. יכול להיות מחדש על ידי basification של השכבה המימית בודדו את אלדהיד או קטון.
המטרה הכוללת של הליך זה, היא להסיר אלדהידים וקטונים תגובתיים מתערובות על ידי מיצוי נוזלי-נוזלי ישירות עם נתרן ביסולפיט רווי בממס הניתן לערבוב. שיטה זו יכולה לסייע בטיהור תערובות, למרכיביהן האישיים. באופן ספציפי, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפריד בין תרכובות המכילות קבוצות פונקציונליות של אלדהיד או קטון, מתרכובות אחרות.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה מאוד לביצוע ונותנת שיעורי הפרדה והתאוששות גבוהים מאוד. לאחר ניסיונות לא מוצלחים להסיר שאריות מגיב אלדהיד מתוצר התגובה באמצעות כרומטוגרפיה של עמודות, הגבנו באופן ספציפי את הזיהום בביסולפיט ליצירת תוספת טעונה, הניתנת להסרה על ידי מיצוי נוזל-נוזלי. ידגימו את ההליך מריה בוצ'ר ומקס פוריגיי, שהם תלמידי מחקר לתואר ראשון במעבדה שלי.
ההפרדה של אלדהידים ארומטיים מתערובת מודגמת כאן, להפרדת בנזיל בוטיראט מתערובת אחת לאחת עם אניסאלדהיד. לאורך הליך זה נתרן ביסולפיט יכול לייצר גז דו תחמוצת הגופרית, ולכן פרוטוקול זה צריך להתבצע עם אוורור מתאים, כמו במכסה אדים. כדי להתחיל, ממיסים 175 מיקרוליטר אניסלדהיד ו -250 מיקרוליטר בנזיל בוטיראט בחמישה מיליליטר מתנול.
העבירו את התמיסה למשפך הפרדה, הוסיפו מיליליטר אחד של נתרן ביסולפיט מימי רווי ונערו במרץ במשך כ-30 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר מים נטולי יונים ו -25 מיליליטר של הקסנים אתיל אצטט 10% ונערו במרץ. הפרד את השכבות.
יבש את השכבה האורגנית עם מגנזיום גופרתי נטול מים. מסננים את התמיסה להסרת מגנזיום גופרתי. לאחר מכן, רכזו את התמיסה בוואקום באמצעות מאייד סיבובי.
ההפרדה של אלדהידים אליפטיים וקטונים מתערובת מודגמת כאן באמצעות הפרדת בנזיל בוטיראט מתערובת אחת לאחת עם בנזיל אצטון. ממיסים 213 מיקרוליטר בנזיל אצטון ו -250 מיקרוליטר בנזיל בוטיראט ו -10 מיליליטר דימתילפורממיד. לאחר העברת התמיסה למשפך הפרדה, הוסף 25 מיליליטר נתרן ביסולפיט מימי רווי, נער את התמיסה במרץ למשך כ -30 שניות.
לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר מים נטולי יונים ו -25 מיליליטר של הקסנים אתיל אצטט 10% ונערו במרץ. אם השכבה הדו-מימית נראית מעוננת, הוסיפו עוד מים ונערו שוב את משפך ההפרדה. אם אתה עדיין רואה מוצק לאחר ההפרדה, סנן את כל החומר דרך Celite כדי להסיר את המוצק לפני שתמשיך לשלב הבא.
לאחר מכן, הפרד את השכבות. מחזירים את השכבה המימית למשפך ההפרדה, מוסיפים עוד 25 מיליליטר של 10% הקסנים אתיל אצטט ומנערים במרץ. מסננים את השכבה המימית ומשאירים את השכבה האורגנית במשפך ההפרדה.
לאחר מכן, הוסף את השכבה האורגנית הקודמת בחזרה למשפך ההפרדה. שטפו את השכבות האורגניות המשולבות שלוש פעמים במים נטולי יונים. יבש את השכבה האורגנית עם מגנזיום גופרתי נטול מים.
לאחר סינון התמיסה להסרת תרכיז מגנזיום גופרתי בוואקום באמצעות מאייד סיבובי. ההפרדה של אלדהידים מתערובת המכילה אלקין מודגמת כאן באמצעות הפרדת בנזיל בוטיראט מתערובת אחד לאחד עם ציטרונלל ממיסים 255 מיקרוליטר ציטרונלל ו -250 מיקרוליטר בנזיל בוטיראט בעשרה מיליליטר דימתילפורממיד ומעבירים את התמיסה למשפך הפרדה. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר של נתרן ביסולפיט מימי רווי ונערו במרץ במשך כ-30 שניות.
מוסיפים 25 מיליליטר מים נטולי יונים ו -25 מיליליטר הקסנים ומנערים במרץ. יבש את השכבה האורגנית עם מגנזיום גופרתי נטול מים. סנן את התמיסה כדי להסיר מגנזיום גופרתי לפני ריכוז בוואקום באמצעות מאייד סיבובי.
הבידוד מחדש של אלדהידים מתערובת מודגם כאן באמצעות הפרדת פיפרוניל מתערובת אחד לאחד עם בנזיל בוטיראט. ממיסים 217 מיליגרם פיפרוניל ו -250 מיקרוליטר בנזיל בוטיראט בחמישה מיליליטר מתנול ומעבירים את התמיסה למשפך הפרדה. הוסיפו מיליליטר אחד של נתרן ביסולפיט מימי רווי ונערו במרץ במשך כ-30 שניות.
לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר מים נטולי יונים ו -25 מיליליטר של 10% הקסנים אתיל אצטט. לאחר הטלטול הפרד במרץ את השכבות. החזר את השכבה המימית בחזרה למשפך ההפרדה.
שטפו את השכבה המימית פעם אחת עם 25 מיליליטר של 10% אתיל אצטט הקסנים כדי להסיר את הכמות הקטנה שנותרה של בנזיל בוטיראט. לאחר מכן, הוסיפו 25 מיליליטר של אתיל אצטט ואחריו 50% נתרן הידרוקסיד עד שרצועת pH מציינת שה-pH הוא 12. לאחר מכן, נער את התמיסה במרץ.
התפתחות הגז נצפתה במהלך שלב זה ועלולה לגרום להצטברות לחץ. הקפד לאוורר כראוי את משפך ההפרדה. פיפרוניל, האלדהיד לדוגמה שלנו, אינו רגיש לבסיס, אך אלדהידים עם אלפא-מימן הניתנים לאנוליזציה עשויים להיות לא יציבים לנתרן הידרוקסיד.
החלפת נתרן פוספט טריבסיסי רווי בנתרן הידרוקסיד עשויה להפחית תגובות לוואי לא רצויות הנגרמות על ידי בסיס חזק. לאחר הפרדת השכבות מחזירים את השכבה המימית למשפך ההפרדה. מוסיפים 25 מיליליטר אתיל אצטט ומנערים במרץ.
לאחר הפרדת השכבות שלבו את השכבה האורגנית עם השכבה האורגנית מהשלב הקודם לפני הייבוש. מסננים ומרכזים את התמיסה כמו קודם. ניתן לשפוט את הצלחתו של פרוטוקול זה על ידי תמ"ג פרוטונים.
אם הפרוטוקול לא יצליח, האלדהיד או הקטון יישארו בתערובת וניתן לזהות אותם על ידי האותות האופייניים לו בספקטרום ה-NMR. לאלדהידים יש אותות אופייניים בין 9 ל-10 PPM, כך שנוכחות של שיא באזור זה מעידה על הפרדה כושלת. להפרדה מוצלחת לא יהיה שיא באזור זה והיא תכיל רק את הפסגות הקשורות למרכיב שאינו אלדהיד של התערובת המקורית.
בעת שימוש בתערובת המכילה אלקין נצפות לפעמים תגובות לוואי עם האלקין. ניתן לזהות אותם על ידי הופעת פסגות שאינן קשורות לאף אחד מהרכיבים המקוריים. ניתן להקל על בעיה זו על ידי שימוש בהקסנים, ממס בעל מסיסות נמוכה של גופרית דו חמצנית, האחראי לתגובות הלוואי הלא רצויות.
הפרדה מוצלחת לא תכיל שיאים בתמ"ג שאינם משויכים לרכיבים המקוריים. בעת בידוד מחדש של האלדהיד ניתן לזהות כמות קטנה של הרכיב השני על ידי תמ"ג פרוטון. ניתן להסיר רכיב זה כמעט לחלוטין על ידי ביצוע שטיפה אופציונלית של השכבה המימית לפני היפוך תגובת הביסולפיט.
לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 15 דקות אם היא מבוצעת כראוי. פרוטוקול זה יעיל עבור אלדהידים ארומטיים ואליפטיים כולל אלדהידים ניאופנטיל מעוכבים סטרית. ניתן להסיר קטונים מתיל ומחזוריים בעוד שקטונים מעוכבים או מצומדים יותר מבחינה סטרילית אינם מגיבים.
כמעט כל הקבוצות הפונקציונליות נסבלות בפרוטוקול כולל קבוצות פונקציונליות אלקטרופיליות כגון אפוקסידים או בנזיל כלורידים. יוצא דופן אחד הוא אמינים אליפטיים, שעוברים תגובת בסיס חומצית עם ביסולפיט ולכן מיוננים חלקית במהלך הפרוטוקול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להסרה של אלדהידים וקטונים ריאקטיביים מתערובות באמצעות שיטת מיצוי נוזל-נוזל עם נתרן ביסולפיט רווי בממס מסיס. הטכניקה מהירה, קלה לביצוע, ומאפשרת בידוד מחדש של האלדהיד או הקטון על ידי בסוף (basification) של השכבה המימית.
מרכיבים מרכזיים של המחקר
תחום מדעי
- כימיה
- שיטות אנליטיות
- סינתזה אורגנית
רקע
- אלדהידים וקטונים הם קבוצות פונקציונליות נפוצות בתרכובות אורגניות.
- שיטות מסורתיות כגון כרומטוגרפיה בעמודה עשויות להיות לא יעילות להסרתם.
- מיצוי נוזל-נוזל מציע חלופה יעילה יותר.
- סודיום ביסולפיט מגיב עם אלדהידים וקטונים ליצירת אדוקטים טעונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה פשוטה ויעילה לטיהור תערובות המכילות אלדהידים וקטונים.
- הדגמת היתרונות של שימוש בנתרן ביסולפיט בהפקה נוזל-נוזל.
- אספקת פרוטוקול שניתן לשחזר בקלות במסגרות מחקר.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת נתרבן סולפיט (sodium bisulfite) רוויה.
- ערבוב התמיסה עם התערובת האורגנית המכילה אלדהידים או קטונים.
- ביצוע מיצוי נוזל-נוזל להפרדת הרכיבים.
- בסיס של השכבה המימית כדי לבודד מחדש את תרכובות המטרה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מפרידה בהצלחה אלדהידים וקטונים מתרכובים אחרים.
- הושגו שיעורי התאוששות גבוהים במאמץ מינימלי.
- הפרוטוקול הודגם על ידי סטודנטים למחקר בתואר ראשון.
- התוצאות מצביעות על הפוטנציאל של השיטה ליישומים רחבים יותר בכימיה אורגנית.
מסקנות
- שיטת מיצוי נוזל-נוזל עם נתרבית ביסולפיט יעילה לניקוי תערובות אורגניות.
- פרוטוקול זה מהווה כלי בעל ערך עבור חוקרים המתמודדים עם זיהום של אלדהידים וקטונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון את יישומה בתרחישים שונים של סינתזה אורגנית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות, זיהומים של אלדהידים וקטונים עלולים לפגוע בתוצאות הבדיקות ולהוביל לקשרים שגויים בין מבנה לפעילות. פרוטוקול סמי extracción של ביסולפיט זה מאפשר טהרה מהירה של קרבונילים ריאקטיביים מתערובות מורכבות, ובכך משפר את איכות התרכובות עבור סריקות המשך. על ידי אספקת שיעור התאוששות גבוה ויכולת בידוד מחדש, הוא תומך בתהליכי אישור פגיעות (hit confirmation) ואופטימיזציה של מובילים (lead optimization) אמינים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מסיר מפריעי אלדהיד/קטון שעלולים אחרת להשפיע על מטרות ביולוגיות או לגרום לארטיפקטים בבדיקה.
- ערך תפעולי: משתמש במיצוי פשוט של נוזל-נוזל עם סודיום ביסולפיט רווי, ובכך נמנעים משלבים כרומטוגרפיים ממושכים.
- ערך ניבוי: מאפשר יצירת ספריות תרכובות נקיות יותר, מה שמעלה את רמת הביטחון בנתוני מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר פראקציות אורגניות מופקות המתאימות לבדיקות ביוכימיות או מבוססות תאים ללא רעש הנובע מקבוצות קרבוניל.
- ערך תפעולי: תואם לממסים הניתנים לערבוב כגון methanol או dimethylformamide, ומשתלב בתהליכי עבודה קיימים לניהול תרכובות.
- יכולת הרחבה: השלמת הפרוטוקול בתוך ~15 דקות תומכת בצרכי טיהור בעלי תפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על בידוד מחדש של אלדהידים/קטונים באמצעות בסיפיקציה, מה שמאפשר שחזור של מטבוליטים פעילים או גששים למחקרי מנגנון.
- ערך תפעולי: סובלני לקבוצות פונקציונליות מגוונות (למשל, אפוקסידים, בנזיל כלורידים), ובכך מרחיב את הישימות עבור תווארי ביניים סינתטיים.
- הפחתת סיכונים: מפחית תוצאות חיוביות שגויות בבדיקות פנוטיפיות על ידי סילוק של זיהומי קרבוניל רגיבים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מניקוי ה-hit ועד לזיקוק ה-lead, כאשר שלמות התרכובת משפיעה ישירות על מהימנות הנתונים.
- ביולוגיה של הגילוי: מבטיח תרכובים נקיים מאלדהידים/קטונים לצורך תיקוף מדויק של המטרה ובחינת מסלולים ביולוגיים.
- סריקה: מספקת תמציות סטנדרטיות וניתנות לשחזור עם התאוששות כמותית באמצעות אימות ב-NMR או LC-MS.
- אנליטיקה: הצלחה מאושרת על ידי היעדר שיאי אלדהיד (9–10 ppm) ב-proton NMR, מה שמאפשר קבלת החלטות אובייקטיביות של go/no-go.
- מחקר תרגומי: תומך בהתאוששות של גששים המכילים אלדהיד למחקרים של מעורבות מטרה (target engagement) או דימות לאחר בסיפיקציה.
- שימוש חוזר בארגון: דורש רק זכוכית מעבדה וריאגנטים סטנדרטיים, מה שהופך זאת ליכולת ניידת ובעלת עלות נמוכה עבור צוותי כימיה רפואית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את ביטחון התחזית על ידי הסרת עמימות מכניסטית מקבוצות קרבוניל ריאקטיביות.
- ערך תפעולי: שיעורי הפרדה והשבה גבוהים עם שימוש מינימלי בממסים ובציוד.
- ערך אסטרטגי: מפחית בדיקות שנכשלו ובדיקות חוזרות, ובכך משפר את יעילות ההון בתהליך ייצור מובילים (lead generation).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון של תרכובות "נקיות" עבור פיתוח פרה-קליני.
שיקולי יישום
- נדרשת הכשרה בסיסית בכימיה אורגנית לטיפול בטוח ב-sodium bisulfite וביצוע פעולות עם משפך הפרדה.
- נדרשת גישה למכונה (fume hood) עקב פליטה פוטנציאלית של sulfur dioxide במהלך תגובות עם bisulfite.
- מומלץ להשתמש בכלים אנליטיים סטנדרטיים (NMR, LC-MS) כדי לאמת את הצלחת ההפרדה ואת טוהר החומר שבודד מחדש.
- התאמה בין מערכות ממסים (למשל, methanol עבור ארומטים, DMF עבור אליפטים) בהתאם למסיסות התסבס (substrate).
- אמינים אליפטיים עשויים להיות מיוננים חלקית ויש להביאם בחשבון כאשר הם נוכחים בתערובות.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Standard Protocol for the Separation of Aromatic Aldehydes from a Mixture
2:16
Separation of Aliphatic Aldehydes and Ketones from a Mixture
4:00
Separation of Aldehydes from a Mixture Containing an Alkene
5:00
Re-isolation of Aldehydes from a Mixture
7:01
Results: Representative 1H NMR Indicates Success of Separation
8:21
Conclusion
