בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההשפעות של איסכמיה במעי על תאי גזע אפיתל במעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון כיצד תאי גזע מתנגדים לפציעה ותורמים לתיקון לאחר פגיעה איסכמית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל בעלי חיים גדול שניתן להשתמש בו לחקר מחלות מעיים קליניות ותיקון.

ידגימו את ההליך איימי סטיילר סטיוארט, סטודנטית לתואר שני, וג'ון פרוינד, מומחה מחקר מהמעבדה שלי. התחל בשימוש בלהב אזמל כדי לבצע חתך בקו האמצע הגחוני של שמונה עד 10 סנטימטרים על הבטן שבמרכזו הטבור של חזיר יורקשייר בן שמונה עד 10 שבועות. אתר את הג'ג'ונום, כ -40 סנטימטרים אוראליים לצומת האילאוצקלי.

קשרו את המעי פעמיים כדי לתחום לולאות ג'ג'ונום באורך 10 סנטימטר עם סנטימטר אחד בין כל קשירה. צור שתי לולאות לכל נקודת זמן של איסכמיה הסמוכות זו לזו, אחת לאיסכמיה ואחת לאיסכמיה עם שעה נוספת של רפרפוזיה. כדי לגרום לאיסכמיה מלאה הפיכה, השתמש במלחציים וסקולריים של בולדוג או בהמוסטטים כדי לחסום כשלושה כלי דם מזנטרי לכל מהדק לפרק הזמן הניסיוני המתאים.

שמור על הבטן מכוסה לאורך כל התקופה האיסכמית. בסוף הניסוי, השתמש במספריים של מצנבאום כדי לאסוף תחילה פיסת ביקורת של ג'ג'ונום רגיל לפחות חמישה עד 10 סנטימטרים קרוב ללולאה האיסכמית האחרונה, ולאחר מכן לאסוף את שאר הלולאות. אחסן את הלולאות מכל נקודת זמן של פציעה במיכלים קטנים של PBS קר כקרח עד לבידוד הקריפטה.

כדי לבודד את תאי הגזע של הקריפטה, השתמש בחוט בגודל 20 ומלקחיים של רקמות כדי להפוך כל לולאה של המעי הדק כך שמשטח הרירית ייחשף. תפרו את החלק העליון והתחתון של כל לולאה היטב לחוט, ושטפו כל לולאה הפוכה ב-PBS קר כקרח. לאחר הסרת כל הפסולת הלומינלית, הנח מיד את הדגימות בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה מספר אחת על קרח למשך 30 דקות עם ניעור והיפוך כל חמש דקות.

בתום תקופת הדגירה, העבירו את הדגימות לצינורות תואמים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה מספר שתיים וגלולה את דגימות הלולאה האיסכמית של שעתיים עד ארבע שעות על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים בחמישה מיליליטר PBS והשתמשו בכמות של 50 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לבדוק את מידת האסוציאציה של הקריפטה וכמות הפסולת במיקרוסקופ אור. לאחר מכן, הניחו את הדגימות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם ניעור או היפוך כל חמש דקות.

לאחר מכן העבירו את הדגימות ישירות ל-25 מיליליטר של PBS קר כקרח על קרח בשייקר מסלולי המוגדר ל-60 סל"ד למשך שתיים עד חמש דקות של ניעור עם ניעור ידני נוסף או היפוך כל 30 שניות. בתום הדגירה המטלטלת, בדוק את מידת הקשר של הקריפטה וכמות הפסולת והעביר את הדגימות לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר המכילים 25 מיליליטר PBS קר לטלטול עד לבידוד קריפטות שלמות עם מינימום פסולת ווילי. לאחר שהלולאות התנתקו לחלוטין, הסר את הרקמה שנותרה, הטיל את הדגימות על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את כדורי הקריפטה הנותרים בחמישה מיליליטר של PBS טרי.

לאחר מכן מביאים 150 קריפטות לכל שפופרת לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדים ומגלגלים את הקריפטות על ידי מיקרו-צנטריפוגה. בעזרת פיפטה מקוררת מראש, השעו בעדינות את הכדורים עם 50 מיקרוליטר תערובת מאסטר לבאר ואחריה פיפטינג מהיר 15 פעמים לערבוב. לאחר מכן, הוציאו טיפת קריפטה של 50 מיקרוליטר למרכז כל באר של צלחת 24 בארות מתולעת ומרושתת מראש והניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר 30 דקות, כסו כל קציצת מטריצה ב-500 מיקרוליטר לבאר של מדיום תאי גזע אפיתל במעי והוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל בארות שאינן בשימוש כדי לשמור על לחות ולספור את מספר הקריפטות המצופות, יום אפס. הוסף גורמי גדילה לכל באר כל 48 שעות, והחלף את הסופרנטנט כל 96 שעות ב-500 מיקרוליטר של מדיום טרי בתוספת גורם גדילה. איסכמיה מלאה של המעי נוצרת בלולאות המעי הדק על ידי שימוש בחסימת כלי דם עם תפרים או מהדקים, כפי שמוצג.

אם מבוצעת כהלכה, הפגיעה האיסכמית תתחיל בקצה וילי המעי ותנדוד מטה בתוך הקריפטה ככל שמשך האיסכמיה גדל. טעות נפוצה אחת בטכניקה הכירורגית יכולה להתרחש כאשר כלי הדם אינם קשורים או מהודקים באופן שווה, וכתוצאה מכך איסכמיה דימומית שבה הווריד בעל הדופן הדקה קורס לפני העורק, ומאפשר לדם נוסף לחדור לרקמות. לאחר הסרת לולאות המעי האיסכמיות, ניתן לבודד בהצלחה את קריפטות המעי בעקבות פרוטוקול הדיסוציאציה כפי שהודגם זה עתה.

קריפטות מנקודות זמן שנפגעו בצורה חמורה יותר נשברות לעתים קרובות ומכילות יותר פסולת סלולרית ברקע בהשוואה לאלה שלא עוברות נזק או נזק קל. כאשר קריפטות מעיים רגילות ופגועות קלות מצופות בתרבית, אנטרוספירות נוצרות תוך 24 עד 48 שעות. עם נזק איסכמי חמור, קריפטות המעי שורדות אך נפגעות וכתוצאה מכך נוצרות כדורים קטנים בהרבה בתחילה.

ב-72 עד 120 שעות, אנטרואידים מכל הקריפטות הופכים מורכבים יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצנים, ועם ירידה כללית ביעילות צמיחת הקריפטה, כמו גם ירידה בגודל האנטרואידים שמקורם ברקמת המעי שנפגעה קשות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את הליכי בידוד הקריפטה תוך כשעתיים-שלוש אם הם מבוצעים כראוי. עדיף שהקריפטות שנאספו לציפוי נגזרות מכביסות ולא משברי ניתוק בשל הסבירות המוגברת לזיהום תרבית בשבר הניתוק.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם לבדיקת יעילותן של תרופות לטיפול בפגיעות אפיתל הנובעות מאיסכמיה פלוס או מינוס רפרפוזיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של מערכת העיכול לחקור את השפעת האיסכמיה על האפיתל במיוחד על תאי גזע במעי במודל של בעלי חיים גדולים תרגומי ורלוונטי מבחינה קלינית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור איסכמיה במעי עם או בלי רפרפוזיה וכן לבודד קריפטות מעיים לתרבית תלת מימדית בעקבות פגיעה in vivo.