Name: בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: למדו לבודד תאי גזע מעיים מחזירי יורקשייר לאחר איסכמיה סגמנטלית. הפרוטוקול מדגים בידוד קריפטים, תרבות תלת-ממדית והיווצרות אנטרוספירות לחקר תיקון אפיתל לאחר פגיעה איסכמית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, מח' כספים הפצתו למדעי קלינית

עבור ניסויים אלו, מחקרים שנעשו בבעלי חיים כל אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של צפון קרוליינה סטייט.
1. הכנה תרבות
הערה: כל ריאגנטים מפורטים בטבלה של חומרים. גורם גידול ספציפי ריכוזים מפורטים בטבלה 1.
<ol><li>להכין פתרון חומצה (EDTA) ethylenediaminetetraacetic 0.5 M במים מזוקקים יונים (ddH2O). לערבב במידה מספקת, להתאים את רמת ה-pH ל 7.4 שימוש בפתרונות NaOH ו/או HCl. הערה: להמציא פתרון מניות EDTA טריים לפני ניסוי.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה מגיב #1 (ד ר #1) כדלקמן ומניחים על הקרח: לשלב פוספט buffered תמיסת מלח ללא Ca2 + ו- Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, מ' 1 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 מיקרומטר Y27632 פתרון 1 X אנטיביוטיקה-Antimycotic (אנטי-נגד) המכיל פניצילין, סטרפטומיצין ו- b שהוא גוסס הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין דיסוציאציה ריאגנט #2 (ד ר #2) כדלקמן, מניחים באמבט מים 37 ° C: לשלב PBS ללא Ca2 + ו- Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 מיקרומטר Y27632 ו- 1 אנטי-נגד X. הערה: להוסיף Y27632 מייד לפני אוסף רקמה.</li>
	<li>להכין מדיה תא גזע אפיתל המעי (IESC) כדלקמן: מיקס 25 מ ל מתקדמים DMEM/F12 בינוני עם תוספת X N2 1, 1 X B-27 תוספת, 10 מ מ HEPES, 2 מ מ Glutamax ו- 1 אנטי-נגד X. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.</li>
	<li>להכין תערובת בסיס של פקטורי גדילה מופחתת קרום המרתף מטריקס (matrix) גורמי גדילה משלימה כדלקמן: הפשרת המטריקס על קרח. בשפופרת microcentrifuge, להוסיף 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי בשכל אנושי, 500 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושי R-Spondin 1, 50 ng/mL רקומביננטי האנושי גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), 100 ננוגרם למ"ל רקומביננטי האנושית Wnt3a, 10 מ מ Nicotinamide, גסטרין 10 ננומטר, 500 ננומטר A-83-01, 10 מיקרומטר Y-27632 , 10 מ מ SB202190, 500 nM LY2157299 ו 2.5 מיקרומטר גליקוגן סינתאז קינאז 3 מעכב (GSK3i, CHIR99021). כאשר מופשר המטריקס הוא, להשלים עם המיקס פקטורי גדילה (ביצוע מיקס מאסטר) ולאחסן על קרח. הערה: הקפד להימנע מהחדרה בועות אוויר כמו פעולה זו תיצור החפץ בתוך פטי מטריקס במהלך ציפוי.</li>
	<li>לחמם תבשיל תרביות רקמה 24-ובכן בחממה 37 ° C לפני הפעלת נוהלי בידוד תא.</li>
</ol>2. ניתוח מודל של איסכמיה ואוסף רקמות
<ol><li>השתמש שמונה יורקשייר בן שבוע 10 crossbred חזירים של מין או (מומלץ). הסר כל הזנה 16-18 שעות לפני הניתוח. אפשר חזירים גישה למים בכל עת.</li>
	<li>לתזמן את החזירים להגיע לפחות 48 שעות לפני הניסויים כדי לאפשר להתאקלמות סביבתיים. הערה: טכנאי וטרינרי ו/או מעבדה מיומן בפיקוח וטרינר מורשה לספק טיפול בבעלי חיים שגרתי וסיוע עם הרדמה הליכי.</li>
	<li>Premedicate החזיר עם חריגות השירותים הווטרינריים (1.5 mg/kg intramuscularly (IM)), קטמין (11-20 מ"ג/ק"ג (IM))15. ברגע התוצאות התקבלו להנשים את orotracheally חזיר.</li>
	<li>לשמור על חזירים בהרדמה כללית עם איזופלוריין (2-5%) מתאדה 100% O2 עד הזמן של המתת חסד.</li>
	<li>המקום של קטטר (IV) תוך ורידי (הווריד האוזן מומלץ) ולפקח על החלפת נוזל כגון פלאפונים lactated פתרון בשיעור אחזקה של 15 מ"ל/ק"ג/שעה.</li>
	<li>ביצוע הרדמה ניטור כולל אוקסימטר, אלקטרוקרדיוגרם מדידות לחץ דם עקיף15. לפקח על קצב נשימה והמאמץ של החזיר. ותאוורר באופן ידני או מכנית לפי הצורך, אם הקצה גאות CO2 עולה מעל 55-60 מ מ כספית. הערה: ההרדמה המתאימה אושר על ידי ניטור מתמיד של מגמות של קצב הלב (טווח 80-130 פעימות לדקה), לחץ דם לא פולשנית (ממוצע לחץ הדם בעורק 75-100 מ מ כספית), ואת קצב נשימה (10-25 נשימות לדקה)16ובדיקת תקופתי להיעדרות של הלסת וגוון אנאלי. עומק ההרדמה יכולה להישפט גם על ידי הרפיית שרירים ורמת fasciculation שרירים בעקבות גירוי כירורגי. רפלקסים עינית בדרך כלל אין ערך16. ניתן לספק שיכוך כאבים לפי המדיניות IACUC מוסדות. במקרה זה, אופיואידים, כגון הבופרנורפין, יכול להינתן במהלך הניתוח.</li>
	<li>במקום החזיר על כרית החימום, לרסן ב recumbency הגבי עבור הליך כירורגי.</li>
	<li>לגלח את הבטן הגחון ולהכין שימוש בניתוחים כירורגיים (chlorhexidine פתרון), איזופרופיל אלכוהול.</li>
	<li>לעשות חתך קו האמצע הגחון 8-10-ס מ באמצעות להב סכין מרוכז בכל הטבור כדי לגשת בבטן.</li>
	<li>לזהות את המעי הדק (מעי צם) כ-40 ס מ אורלי כדי שתוריד. ניסחו לולאות זמן 10 ס מ של מעי צם מאת circumferentially נבדק פעמיים את המעי הגס, 1 ס מ בין כל קשירה, לפני יצירת עוקבות לולאות 10 ס"מ ממוקם אורלית (איור 1).</li>
	<li>צור שתי לולאות לכל נקודת זמן איסכמיה סמוכים זה לזה, אחד עבור איסכמיה ואחד עבור איסכמיה h 1 נוספים של פגיעה reperfusion במידת הצורך. כדי ליצור שלם איסכמיה (אין זרימה של עורקים או ורידים), מלחציים או מאתרים ומפסיקים את להערכת מצע המעי העליון באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג, טוב נגד יתושים מהברים מעוקל או משי נספגים 2-0 עבור 1, 2, 3 ו- 4 שעות ולאחר מכן להסיר את אבזמי h 1 של פגיעה reperfusion, אם רצונך בכך. הערה: המחברים ברא כל לולאות של איסכמיה לפי סדר, החל עם הלולאה איסכמי 4 שעות והוא התקדם עובר הציר הקרוב (לצמצם את זמן הניתוח הכולל). כדי להתייחס לאפשרות כי השכנה איסכמי קטעי המעי עלול לגרום נזק לולאות סמוכים, הסדר של לולאות איסכמי יכולים להיות מגוונים. זה עשוי לשנות את הזמן כירורגי הכולל. הערה: מסגרת הזמן של פגיעה reperfusion יכולים להיות מגוונים בהתבסס על שאלת המחקר מעניינים או אם טיפולים רוצה להיבדק בתקופה פגיעה reperfusion. עם זאת, נזק לרקמות הופך חמור יותר מהעלאת המשכים של איסכמיה לבד, פגיעה reperfusion פגיעה סביר שאינה תורמת דבר נוסף אפיתל פציעה. פגיעה reperfusion ככל הנראה תפקיד בעקבות תקופות מתון של איסכמי.</li>
	<li>בין נקודות זמן איסכמיה, להשאיר את הבטן מכוסה או סגור באמצעות מגבת נקיה ו/או מגבת מלחציים. הערה: בתוך חיים בודד עבור ניסוי זה, שמונה מקטעים איסכמי יכולים להיווצר. זיהוי מקטע jejunal נוספים, מקורב ללולאה האחרונה איסכמי, שישמש כפקד נורמלי פנימי לפחות 5-10 ס"מ.</li>
	<li>לחסום כ שלוש ספינות מצע המעי העליון לכל קלאמפ וסקולרית בולדוג או מעוקל מהברים יתושים עוצר דימום. יש לנקוט במהלך היישום עוצר דימום בגלל כלי הם בטראומה בקלות. לנסות מחסנית בכלי הדם בתוך מלתעות המלחציים.</li>
	<li>בסוף הניסוי, המתת חסד הבאים עם פנטוברביטל 85-100 מ"ג לק"ג IV, לאסוף את כל לולאות של רקמה באמצעות קורות חיים, לאחר המוות אושרה עם אין דופק auscultated ואובדן הקרנית. התחל על ידי איסוף חתיכה שליטה של מעי צם נורמלי לפחות 5 - 10 ס מ proximal ללולאה האחרונה איסכמי.</li>
	<li>להפריד ולאחסן את. לולאות של כל נקודת זמן פציעה במכלים קטנים של PBS קר כקרח עד מוכן לבידוד הקריפטה. הערה: אם רצונך בכך, להפוך איסכמי לולאות מספיק זמן כדי לחלק את הדוגמאות נפרדים עבור היסטולוגיה והתרבות תאי גזע מעיים; עם זאת, המחברים מצאו לולאות גדול מכ 10 ס מ באורך סביר ביותר להפוך דימומית.</li>
</ol>3. קריפטה (תא גזע) בידוד מן איסכמי ולולאות שליטה
<ol><li>היפוך כל לולאה של המעי הדק באמצעות 20 גאייג-חוט רקמה מלקחיים לחשוף את השטח הרירית. לקשור העליון והתחתון של הלולאה בצורה מאובטחת לכבל באמצעות תפרים (2-0 נספגים משי או שווה ערך).</li>
	<li>לאחר היפוך, לשטוף כל לולאה ב- PBS קר קרח כדי להסיר את הלכלוך luminal.</li>
	<li>מקם דגימות ישר לתוך צינורות חרוט 50 מ ל, המכיל ד ר #1 על קרח למשך 30 דקות.</li>
	<li>לאסוף את לולאות מתחיל עם שליטה ופעל עם לולאות להגדיל בהפרש קבוע המשכים של איסכמיה. לולאות של רקמות שנפגעו פחות (כלומר שליטה ו- 1 h איסכמי רקמות) יכול רועד בחוזקה, הצמדה בשורש כף היד לקבלת התוצאות הטובות ביותר. רקמות רקמות שנפגעו קשות (h 3 ו 4 של איסכמיה) צריך בעדינות שולט או הפוך רק כפי רועדות מדי יגרום הפרעה קריפטה והרס רקמות נוספות. צינורות צריך להיות מזועזע או הפוכה כל 5 דקות בזמן על קרח.</li>
	<li>העברת דגימות לתוך ד ר #2 10 דקות באמבט מים 37 º C. לנער או היפוך צינורות בכל 5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, centrifuge הצינורות חרוט המכיל ד ר #1 מ- 2-4 h פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה אפשרי שכבר יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר דגימות של ד ר #2 ולמקם דגימות רקמה ישירות לתוך 25 מ של PBS קר על קרח (תווית כמו שטיפת #1). מניחים את הדוגמאות על תפקודי לב / נשימה-קרח-סל ד 60. להמשיך ללחוץ או היפוך כל שפופרת ב-30 s כל 2-5 דקות.</li>
	<li>לאחר העברת הרקמות, ספין הצינורות חרוט המכיל ד ר #2 מהתופת 2-4 פגום לולאות כדי להסיר את EDTA supernatant (200 גרם x עבור 5 דקות). רקמות אלה הם מאוד פגועה זה אפשרי כי יש להפוך הפומבית של כוכים. להסיר את תגובת שיקוע resuspend גלולה עם נפח קטן של PBS (5 מ"ל), המשך לשלב 3.9.</li>
	<li>להסיר aliquot 50 µL מ לשטוף #1 (או מ- DR) כדי לבדוק את מידת קריפטה דיסוציאציה, כמות פסולת. למקם את רקמת צינור חרוטי 50 מ ל (שטיפת #2, #3, וכו) מלא עם 25 מ של PBS קר ו- shake עד כוכים שלם מבודדים עם הלכלוך מינימלי, villi. הערה: המטרה היא היכולת לבודד חלק נקי עם כוכים שלם ופסולת מינימלי. כל כביסה נוספים ינקה את התאים אולם מדי רועד יתחילו לגרום נזק משני הרקמה תא. יתר על כן, התוצאות הטובות ביותר עם זיהום לפחות תושג אם כוכים הם מצופים צעד לשטוף ולא צעד ריאגנט דיסוציאציה.</li>
	<li>להסיר את הרקמה הנותרת, centrifuge השפופרות חרוט 50 מ ל- 200 גרם x 5 דקות כדי להסיר את תגובת שיקוע, לאחר מכן resuspend נותרת בגדר התת-קרקעי בנפח קטן יותר ל- PBS (5 מ"ל).</li>
	<li>שימוש במיקרוסקופ הפוכה, בחן 50 aliquots µL של כל דגימה כדי לקבוע מספר כוכים/שבר. המטרה היא 50-100 כוכים/50 µL, כמו זה יהיה בגודל של פטי מטריקס הסופי. הערה: אם המדגם הוא מרוכז מדי, להמשיך להוסיף PBS קר עד הריכוז הרצויה. אם המדגם הוא גם שתדללו, לקבוע מספר aliquots הדרושים כדי להשיג תשואה קריפטה הרצוי ולהתאים.</li>
	<li>אמצעי אחסון המתאים aliquot של כוכים (שנקבע על ידי תצפיות aliquot) לתוך צינור microcentrifuge. לדוגמה, אם לדוגמה מכיל 50 כוכים/50 µL ואז aliquot µL 50 לכל פטי משכפל X 3 = 150 µL / microcentrifuge צינור. אם המדגם מכיל רק 25 כוכים/50 µL ואז aliquots 2 הצורך / פטי X 3 משכפל = µL 300/צינור.</li>
	<li>צניפה כוכים ב g x 200 דקות 5-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בעדינות resuspend מגורען כוכים עם נפח מתאים של מיקס מאסטר (50 µL לכל טוב). לערבב ביסודיות על ידי במהירות pipetting 15 פעמים ללא יצירת בועות אוויר. הערה: מגניב מראש את הטיפ פיפטה תסיים סטרילי קר לפני כ רפה בעברית את תערובת הבסיס. זה יעזור למנוע את תערובת הבסיס מתפשט. טיפים יכול להיות גם לשמור במקרר, להציב בשכונה מיד לפני השימוש.</li>
	<li>מדבקות/ברקודים של מיקס מאסטר µL 50 פלוס קריפטה droplet לתוך המרכז של כל טוב של צלחת מראש ומחוממת טוב 24.</li>
	<li>דגירה לצלחת תרבות למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כיסוי כל פטי מטריקס עם 500 µL / טוב של IESC מדיה (אין צמיחה גורמים נוספים הדרושים ביום 0 הם כלולים בתוך המיקס מאסטר).</li>
	<li>להוסיף 500 µL PBS סטרילי כל בארות שאינם בשימוש השאיר על הצלחת לשמור על הלחות.</li>
	<li>ספירת מספר כוכים מצופה ביום 0. הערה: זה עוזר לרשת קדם כל תא תרבות צלחת לתוך הגזרות כדי להבטיח ספירה מדויקת יותר.</li>
	<li>מספר enterospheres כל 24 שעות ונטר לפיתוח enteroid מדי יום.</li>
	<li>הוסף גורמי גדילה על כל ה 48 טוב כל התקשורת IESC h 96 כל להסיר ולהחליף עם 500 µL טריים מדיה (גורמי גדילה ואז להתווסף מדיה).</li>
</ol>

<ol><li>Eltzschig, H. K., Eckle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia+and+reperfusion--from+mechanism+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation.</a> Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).</li>
<li>Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14740765">Treatment of gastrointestinal ischemic injury.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemia-reperfusion-induced+intestinal+injury%3A+progress+and+promise+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).</li>
<li>Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+immunity+and+inflammation.+V.+Innate+mechanisms+of+mucosal+defense+and+repair%3A+the+best+offense+is+a+good+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense.</a> Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).</li>
<li>Collard, C. D., Gelman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology%2C+clinical+manifestations%2C+and+prevention+of+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury.</a> Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).</li>
<li>Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+of+the+intestine+and+protective+strategies+against+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury.</a> Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+digestive+disease%3A+the+future+of+large+animal+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research.</a> Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).</li>
<li>Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+animal+models%3A+The+key+to+translational+discovery+in+digestive+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Meneses, A. M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids-Current+and+future+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids-Current and future applications.</a> Veterinary Sciences. 3 (4), 31(2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+gastrointestinal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human gastrointestinal development and disease.</a> Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).</li>
<li>Swindle, M. M., Smith, A. C. <a target="_blank" href="https://www.crcpress.com/Swine-in-the-Laboratory-Surgery-Anesthesia-Imaging-and-Experimental/Swindle-Smith/p/book/9781466553477">Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed</a>. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).</li>
<li>Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. <a target="_blank" href="https://trove.nla.gov.au/work/25432600">Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed</a>. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).</li>
<li>Parks, D. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+ischemia+and+reperfusion+to+mucosal+lesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation.</a> Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).</li>
<li>Schoenberg, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+neutrophils+in+postischaemic+damage+to+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine.</a> Gut. 32 (8), 905-912 (1991).</li>
<li>Nilsson, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+pathogenesis+during+ischemia+and+reperfusion+of+the+cat+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine.</a> Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).</li>
<li>Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ischemia%2Freperfusion+tolerance+in+the+rat+small+intestine.+An+epithelium-independent+event%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event.</a> J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).</li>
<li>Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+reperfusion+injury+an+important+cause+of+mucosal+damage+after+porcine+intestinal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia.</a> Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).</li>
<li>Shegarfi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CCN1+%28Cyr61%29+in+a+porcine+model+of+intestinal+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion.</a> Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).</li>
<li>Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27213580">Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הפיתוח של מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי ומרחיב על דגמים קודמים מאתר ומאפשר לימוד נקודות מרובות זמן הפגיעה רקמות בתוך אותה חיה. ישנן מספר נקודות לדיון ביקורתי של פרוטוקול זה כולל כלי ראוי מצדו, פגיעה reperfusion רקמות, תרבית תאים קריפטה מוצלחת.
כלי ראוי מצדו חיוני ליצירת דגם של איסכמיה מלאה. אם התפר קשורה באורח לא אחיד או המלחציים לא התהדקו לחלוטין, דם העורק בעובי דופן עלולה להמשיך להזין את הרקמה ולא יכול לצאת בשל קריסת הווריד דקות קיר. התוצאה היא extravasation של דם לתוך פרופריה. מוסקולריס גרימת נזק לרקמות נוספים. עם זאת, בהתאם לסוג הפגיעה איסכמי נחקר, איסכמיה מלאה או מדמם עשוי להיות הרצוי. לדוגמה, בתהליך של השתלת מעיים, המעי הגס מופרד לחלוטין מפני אספקת הדם (עורק, וריד) במהלך השלב כריתה של ההליך, דבר המתבטא איסכמיה מעיים מלאה. לחלופין, לעומת זאת, כאשר מצע המעי הוא מעוות במהלך אירוע כגון התפתלות המעים מעיים, השיבה ורידים לעיתים קרובות נחסמת קודם, המוביל דם נוסף בתוך רקמת לפני הישות אספקת העורק חסום, ובכך ליצור איסכמיה דימומית.
איסכמי גורמת נזק לרקמות מתחיל בקצה סיסי והארכת עד הבסיס של קריפטה3. במהלך איסכמיה, אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט ימשיך לשמש ומייצר את hypoxanthine מטבוליט. כאשר הרקמה הוא reperfused עם חמצן, hypoxanthine הופך מטבוליזם על ידי אוקסידאז xanthine ומייצרת סופראוקסיד רדיקלים חופשיים שמוביל לפציעה הרירית ואטרקציה של רקמת נזק נויטרופילים17,18. הבדלים בין המינים הרירית אדריכלות כלי הדם, כמו גם ביטוי בדרגות שונות של xanthine אוקסידאז, לגרום בדרגות שונות של פגיעה reperfusion פציעה3. מודלים של חתולים, מכרסמים של איסכמיה-פגיעה reperfusion רגישים יותר לפגיעה פגיעה reperfusion חמצן תגובתי מטבוליטים19,20. לעומת זאת, חזירים נמצאו יש פחות אוקסידאז xanthine ופציעות ולכן פחות פגיעה reperfusion, ביצוע מודל זה דומה יותר לזה של איסכמיה מעיים אנושיים21. בשלב זה, השימוש של מודלים חזירי מהונדס ללמוד פגיעה במעיים או נוק לא תואר, ממציא זה מגבלה עיקרית של מודל זה. הבחירה של המודל בעלי חיים תקין תלוי תהליך המחלה או תנאי ספציפי החוקר מבקש ללמוד. לדוגמה, מודלים חזירי של נזק איסכמי ועד 6 h כבר מתואר22, בעוד נהלים איסכמי ביותר במודלים מאתר 45-60 דקות23.
הבידוד מוצלח של כוכים מעיים מן המעי נורמלי ופגועות ischemically מאפשר המחקר של שחזור אפיתל בתרבות. מערכת זו מאפשרת החוקר להתמקד באופן ייחודי על האפיתל לבד, כפי שאין אספקת דם לא או רכיב תא החיסון לשקול. זה מציע הזדמנות ללמוד אינטראקציות תאים אפיתל ושחזור בעקבות פגיעה בנוסף תגובת גורמי גדילה שונים, או הטיפולים במהלך הניתוח או בידוד קריפטה הבאים להשלים את המדיה תרבות. שלב זה נותר הקשים ביותר, כמו בידוד של לולאות נפגע קשות דורש טלטול עדין והסרה מהירים של הפתרונות המכילה EDTA במקרה כוכים יש להפוך בטרם עת חלופה מועדפת. אם אלה לולאות המעי לא נשטפים ביסודיות, כוכים יש פוטנציאל תזדהם בתרבות. כתוצאה מכך, הוסיפו אנטיביוטיקה-antimycotic פתרון שני פתרונות ד ר בנוסף למדיה IESC. עוד נקודת הדיון מתמקד המעי שנאספו כפקד נורמלי. כמו בעלי החיים עוברים הרדמה עם שינויים אפשריים זלוף רקמות מערכתית, יחד עם האפשרות של מחזורי מתווכים דלקתיים משני איסכמיה, אפילו "נורמלית" שליטה רקמות לא מייצג פקד אמיתי. בניסויים אלה, זה של הערה כי הרקמה שליטה הופיע בגסות וללא בהיסטולוגיה להשוות ברקמות של בעלי חיים, כי לא עברה איסכמיה בניסויים אחרים (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
לסיכום, מתאר שיטה זו מודל לשחזור של חזירי איסכמיה מעיים, זה מקרוב מודלים מה מתרחש בפציעה איסכמי אנושי. בנוסף, מתוארת הבידוד של תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי, אשר מגישה ללמוד היענות לטיפול בתרבות ותיקון אפיתל.

נזק איסכמי מעיים, התוצאה של זמינות החמצן ירד עקב צמצום או סגר מוחלט של זרימת הדם אל המעי, נותרה מטרה משמעותית של תחלואה ותמותה בחולים אדם ובבעלי1,2. נזק איסכמי, שלאחר דלקת, חדירה תאית, מוביל לפגיעה מכשול הרירית. המכשול הרירית חיוני למניעת רוברטסונית חיידקים ורעלים המשויך לתוך מחזור מערכתי3,4. פגיעה reperfusion עוקבות של רקמות איסכמי יכול לגרום היווצרות של מינים חמצן תגובתי זה יכול להחמיר פציעות5פגיעה. מאז איסכמיה מעיים הוא לעיתים רחוקות למניעה, המחקר העדכני ביותר התמקדה בקידום טכניקות גילוי מוקדם של איסכמיה ופיתוח של רומן גישות טיפוליות להפחית פגיעה reperfusion פציעה או היעד לתיקון הרירית.
חייתיים היו בשימוש נרחב מדע בסיסי הידע של איסכמיה-פגיעה reperfusion פגיעה ולהישאר הכרחי עבור המחקר translational. מודלים מכרסם כבר בשימוש נרחב ביותר בשל היכולת שלהם להיות גנטי6. לאחרונה עם זאת, השימוש של דגמים בעלי חיים גדולים, במיוחד את החזיר כבר דגלו ללימודי translational בעתיד עקב מספר יתרונות כולל חזירים אנטומיים, הפיזיולוגיות הדמיון בני7,8. מגוון דגמים פציעה פותחו ללמוד איסכמיה-פגיעה reperfusion פציעה ואף כוללים חסימת כלי דם מלאה, איסכמיה תזרים נמוך, סגמנטלי מצע המעי העליון חסימת כלי דם. לסקירה מלאה של מודלים אלה הוא מחוץ לתחום של מאמר זה אולם המחברים ישיר לקוראים סקירה האחרונות3.
בנוסף אין ויוו מודלים, השימוש במערכות שמחוץ לתרבות הסלולר מציע כלי מבטיח ללמוד הומאוסטזיס מעיים ותיקון בעקבות פגיעה. תאי גזע המעי אחראים תאית שגשוג והמסירה של רירית אפיתל המעי. כאשר מבודד מן המעי נורמלי או פצוע, תאי גזע המעי יכול להישמר בתרבות, לשמש כלי או מודל לחקר תאי גזע וביולוגיה תאים אפיתל. השיטות לבודד ולהקים אלה תלת מימדי התרבות מערכות (הנקרא enteroids ו- colonoids כאשר נגזר מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה) תוארו עבור מגוון רחב של מינים ו עוגב מערכות9,10 ,11,12,13. באופן ספציפי, במסגרת מערכת העיכול, שימשו מערכות אלה תרבות למחלות במערכת העיכול מודל כולל סרטן, זיהום הפתוגן, מחלות מעי דלקתיות14. בשלב זה, ישנם דיווחים לא המתארת את הבידוד ואת התחזוקה של תאי גזע מעיים של המעי הדק פצוע ischemically של כל מין. לכן, כאן אנו מתארים את התהליך של איסכמיה מעיים במודל של הרומן, גדולים בעלי חיים חזירי שתוצאתה פגיעה לשחזור ואת היכולת לבודד תאי גזע מעיים מן המעי נורמלי ונפצעו ischemically לחקר נוספים שחזור ex-vivo.

<table><tbody><tr><td>מי מלח חומציים פוספט, Ca2+, מ"ג 2+ חינם</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>BP-399</td><td>דילול 1:10</td></tr><tr><td>מים מזוקקים, נטולי יונים (ddH2O)</td><td></td><td></td><td>משמש להכנת EDTA ו-PBS</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>20688</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ED45</td><td>יש להכין טרי לפני כל ניסוי; pH 7.4</td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיות חיים מתקדמות DMEM/F12</td><td></td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>אנטי אנטי תמיסה</td></tr><tr><td>רקומביננטית אנושית Wnt-3a</td><td>R & D Systems</td><td>5036 WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי Rspondin1</td><td>R & D Systems</td><td>4645- RS</td><td></td></tr><tr><td>נוגין אנושי רקומביננטי</td><td>מו"פ & D Systems</td><td>6057-NG</td><td></td></tr> מו<tr>"פ<td>EGF אנושי רקומביננטי</td><td> D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>LY2157299</td><td>SelleckChem</td><td>52230</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Cayman Chemical</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>Human [leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57067</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>מים, WFI איכות</td><td>קורנינג, בע"מ</td><td>25-055-CM</td><td>המכונה מים סטריליים (SW); עבור מניות גורמי צמיחה</td></tr> בקר <tr><td>סרום אלבומין (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix, GFR</td><td>Corning, Inc.</td><td>356231</td><td>פנול אדום חינם</td></tr><tr><td>24 Well Culture Dish</td><td>Corning, Inc.</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת חרוטי, 50 מ"ל&nbsp;</td><td>קורנינג בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>430828 ידית אזמל</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי מפלדת פחמן, מס' 10</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>504169</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>15918</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים רקמות Debakey</td> מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td>501239</td><td></td></tr><tr><td>מאיו</td><td>מספריים עולם מכשירים מדויקים</td><td>501752</td> מספריים <td>מעוקלים או ישרים</td></tr><tr><td>מצנבאום</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501739</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים נגד יתושים,</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td> מעוקלים <td>503724-12</td><td>מעוקלים או ישרים (503728-12)</td></tr> <tr><td>הופקינס בולדוג מהדק</td><td>סטולטינג ושות'</td><td>52120-40P</td> משי <td>ישר</td></tr><tr><td>, 2-0&nbsp;</td><td>הנרי שיין</td><td>685S-BUT</td><td>כל מותג דומה מקובל</td></tr><tr><td>מהדקי מגבות</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501700</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>World Precision Instruments</td><td>V503382</td><td></td></tr><tr><td>תפר תיל, 20 מד</td><td>הנרי שיין</td><td>19075</td><td>חתוך ויישר לפני השימוש.</td></tr><tr><td>מגבות כירורגיות</td><td>הנרי שיין</td><td>ST1833</td><td>כל מוצר דומה מקובל.</td></tr><tr><td>תמיסת צלצולים חלב</td><td>הנרי שיין</td><td>9851</td><td></td></tr><tr><td>קרצוף אנטיספטי כלורהקס (4%)</td><td>הנרי שיין</td><td>VINV-CHMX-SCRB</td><td>כל מותג דומה מקובל</td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול 70%</td> <td>הנרי שיין</td><td>MS071HS</td><td>כל מותג דומה מקובל</td></tr><tr><td>צנתר IV, 22 מד</td><td>הנרי שיין</td><td>2225PUR</td><td>עשוי להזדקק ל-20 גרם או 24 גרם בהתאם לגודל הווריד</td></tr><tr><td>קסילזין (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>הנרי שיין</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>קטמין (100 מ"ג/מ"ל)</td><td>הנרי שיין</td><td>11695-6835-1</td><td>תרופה מבוקרת</td></tr><tr><td>תמיסת איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>10015516</td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטל (תמיסת המתת חסד קטלנית פלוס (390 מ"ג/מ"ל))וורטק</td> <td>פארם.</td><td></td><td>מספר מותגים של נתרן פנטוברביטל זמינים.</td></tr><tr><td>כרית חימום&nbsp;</td>מערכת <td>Gaymar</td><td></td><td>Tpump Core Warming System; אחרים זמינים.</td></tr><tr><td>Mindray Datascope Monitor</td><td>Mindray צפון אמריקה</td><td></td><td>כל ציוד ניטור שווה ערך מקובל</td></tr><tr><td>Vaporizer&nbsp;</td><td>Vetland Medical</td><td></td><td>מומלץ להשתמש במערכת מעגל עם חתיכת Y; מספר ספקים זמינים.</td></tr><tr><td>משאבת נוזלים</td><td>Abbott Hospira</td><td></td><td>Plum A+; כל יצרן דומה מומלץ.</td></tr></tbody></table>

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

איסכמיה מעיים נשאר הגורם העיקרי התחלואה והתמותה בחולים אנושיים והטיפול. תהליכי מחלה רבים לגרום איסכמיה מעיים, כאשר אספקת הדם והחמצן ולכן הוא ירד אל המעי. זה מוביל לפגיעה הרקמה הבסיסית ואובדן של מכשול המעי. תאי גזע מעיים שוכנים למרגלות המופרש והם אחראים על חידוש מעיים במהלך הומאוסטזיס ופציעה הבאים. Ex-vivo תא תרבות טכניקות אפשרו לצורך המחקר המוצלח של תאי אפיתל אינטראקציות על-ידי יצירת תנאים תרבות תומכת הצמיחה של מערכות איבר דמוי אפיתל תלת-ממדי (הנקרא "enteroids" " colonoids"מן המעי קטנים וגדולים, בהתאמה). Enteroids אלה הינם מורכב קריפטה ותחומים כמו סיסי בוגר כדי לכלול את כל סוגי תאים הנמצאים בתוך האפיתל. מבחינה היסטורית, מודלים מאתר כבר נעזרו ללמוד פגיעה במעיים. עם זאת, מודל חזירי מציע מספר יתרונות כולל הדמיון של גודל, כמו גם מערכת העיכול אנטומיה ופיזיולוגיה לזה של בני האדם. על ידי ניצול מודל חזירי, אנחנו לבסס פרוטוקול בו לולאות סגמנטלי של איסכמיה מעיים יכולים להיווצר בתוך חיה יחידה, המאפשרת לימוד שונות נקודות הפגיעה איסכמי זמן ותיקון vivo בתוך. בנוסף, אנו מתארים שיטה כדי לבודד את התרבות תאי גזע מעיים של לולאות איסכמי של המעי, מתן אפשרות ללימודי המשך של תיקון אפיתל, מווסת על ידי תאי גזע, ex-vivo.

איסכמיה מעיים מלאה נוצר ב קטן לולאות מעיים באמצעות חסימת כלי דם עם תפר או מלחציים כמוצג באיור1. על ידי שחרור את התפסים, תקופה מבוקרת של פגיעה reperfusion יכול להתבצע, המאפשר לימוד נוספים של פגיעה reperfusion לאחר מכן פגיעה במידת הצורך. כל החיות שרדו במהלך ההליך עם סיבוך מינימלי עד המתת חסד. כירורגי. הסיבוך הנפוץ ביותר היה תת לחץ דם, אשר נפתרה עם תוספת של תייצב חיובי כגון dobutamine.
אם מבוצעת כהלכה, איסכמי מתחילים בקצה סיסי מעיים, להעביר למטה בתוך הקריפטה ככל שהמשך של איסכמיה גדל (איור 2). טעות נפוצה אחת עם טכניקה כירורגית עשויה להתרחש כאשר כלי הדם לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה. התוצאה היא איסכמיה מדמם (איור 3), שבו הווריד דקות קיר יתמוטט לפני העורק, התרת דם נוסף לחדור הרקמות. זה הוא לראות בגסות כהה סגול serosal משטח (איור 3, משמאל) לעומת משטח חיוורת במהלך מלאה איסכמיה (איור 3, ימין).
בעקבות הסרת של לולאות מעיים איסכמי, כוכים מעיים היו מבודדים בהצלחה בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה (איור 4). כצפוי, כוכים מ timepoints נפגע קשות יותר היו לעתים קרובות שבור (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. במהלך הפרוטוקול, בטח מנערים המעי נפגע קשות בעדינות כדי למנוע נזק נוסף הרקמה הבסיסית. רועד גם בערך יכול לגרום נזק התת-קרקעי נוסף, רוב כוכים גומרת בפתרונות ד ר המכילה EDTA, וכתוצאה מכך שיבושים נוספים.
ברגע מצופה, כוכים בין כל נקודות זמן איסכמיה לשרוד, הם מסוגלים להפוך הוקמה בתרבות (איור 5). מתי כוכים מעיים רגילה, המעטה פגום הם מצופה בתרבות, enterospheres טופס בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים מעיים לשרוד אך פגומים, וכתוצאה מכך להיווצרות של הספירות הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. בסך הכל, אין יעילות של צמיחה ירידה של כוכים, כמו גם גודל ירידה של enteroids נגזר רקמת המעי נפגע קשות (גונזלס, ל. מ, נתונים שלא פורסמו, 2017).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig1.jpg"> איור 1 : דגם כירורגי של איסכמיה מעיים מלאה במודל חזירי. א) מעי צם חזירי נורמלי אוזני. ב) כלי מצע המעי העליון יש כבר מאתרים בתפר יצירת איסכמיה מעיים. ג) איסכמיה שנוצרו באמצעות מלחציים וסקולרית בולדוג כדי לאפשר פגיעה reperfusion רקמות במידת הצורך. ד) להערכת המעי מיד לאחר הסרת התפסים כלי הדם. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig2.jpg"> איור 2 : עדות היסטולוגית (hematoxylin ואאוזין (H &amp; E) כתם) של הגדלת אפיתל נזק בעקבות המשכים ארוכים של איסכמיה מעיים מלאה. הנזק מתחיל בקצה סיסי עם אובדן הדרגתי של שכבת האפיתל תא בודד, סיסי blunting נזק תאי הארכת אל הקריפטה הבסיס עם פציעה קשה (משך h עד 4). בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig3.jpg"> איור 3 : ראיות ברוטו היסטולוגיים של איסכמיה דימומית. A) תצלום מגעיל השוואת hemorrhagic איסכמיה (הלולאה שמאל) ו איסכמיה מלאה (נכון הלולאה). כאשר להערכת לא מאתרים או כשכרטיס באופן שווה, דם יכול להמשיך לחדור הרקמות, והתוצאה היא דלקת נוספים ונזק. ב) תמונות H &amp; E של איסכמיה מדמם של הגדלת משך מ h 1-4. בנוסף נזק תאי אובחנה איסכמיה מלאה, יש עדויות של תאי הדם האדומים חדירה בתוך פרופריה. מוסקולריס שמסביב. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig4.jpg"> איור 4 : Aliquots של המעי כוכים מבודד לולאות המעי איסכמי ונורמלי. כוכים מעיים, מלאה, שלמה (כוכביות) היו מבודדים בהצלחה של כל לולאה של מעי. כצפוי, כוכים מנקודות הזמן נפגע קשות יותר, לעיתים קרובות היו שבורות (f; פרגמנט) והכילה קריפטה שברים יותר רקע הסלולר פסולת בהשוואה לאלו שעברו לא או נזק קל. בר בקנה מידה 100 מיקרומטר. אני = איסכמיה. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57647/57647fig5.jpg"> איור 5 : מסלול הזמן צמיחת תאי המעי בעקבות בידוד מן לולאות איסכמי של המעי הדק. כאשר כוכים מעיים רגילה מצופים בתרבות, enterospheres נוצרו בתוך 24-48 שעות. עם נזק איסכמי חמור (3 ו 4 h), כוכים לשרוד אך יוצרים כדורים הרבה יותר קטן בתחילה. על ידי h 72-120, enteroids הופך מורכב יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצני. 20 מיקרומטר סולם בר אלא אם כן צוין. <a href="/files/ftp_upload/57647/57647fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>גורם גידול</td>
			<td>Diluent</td>
			<td>ריכוז מניות</td>
			<td>דילול מניות</td>
			<td>דילול עובד</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin</td>
			<td>PBS</td>
			<td>100 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>µg 1/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>הראש</td>
			<td>SW/0.1%BSA</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>µg 100/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
			<td>10 מ מ חומצה אצטית</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>µg 500/ml</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>A-83-01</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>מיקרומטר 500</td>
			<td>500 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>SB202190</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>3000 X</td>
			<td>30 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamide</td>
			<td>SW</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>1 מ'</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>גסטרין</td>
			<td>PBS</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>100 מיקרומטר</td>
			<td>10 ננומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Y-27632</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>10 מ מ</td>
			<td>10 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>LY2157299</td>
			<td>דימתיל סולפוקסיד</td>
			<td>10,000 X</td>
			<td>5 מ מ</td>
			<td>0.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHIR99021</td>
			<td>PBS</td>
			<td>1000 X</td>
			<td>2.5 מ מ</td>
			<td>2.5 מיקרומטר</td>
		</tr>
<tr>
<td>Wnt3a</td>
			<td>PBS</td>
			<td>2000 X</td>
			<td>µg 200/ml</td>
			<td>100 ננוגרם למ"ל</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: טבלה ריאגנט Growth factor- סיכום של פתרונות מניות פקטורי גדילה ופתרונות עבודה בשימוש בפרוטוקול זה.

פרוטוקול זה יאפשר לקוראים בהצלחה לבסס מודל חזירי של איסכמיה מעיים סגמנטלי, לאחר מכן לבודד, תרבות מעיים בתאי גזע לצורך המחקר של אפיתל תיקון בעקבות פגיעה.

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההשפעות של איסכמיה במעי על תאי גזע אפיתל במעי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי גזע, כגון כיצד תאי גזע מתנגדים לפציעה ותורמים לתיקון לאחר פגיעה איסכמית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במודל בעלי חיים גדול שניתן להשתמש בו לחקר מחלות מעיים קליניות ותיקון.ידגימו את ההליך איימי סטיילר סטיוארט, סטודנטית לתואר שני, וג'ון פרוינד, מומחה מחקר מהמעבדה שלי. התחל בשימוש בלהב אזמל כדי לבצע חתך בקו האמצע הגחוני של שמונה עד 10 סנטימטרים על הבטן שבמרכזו הטבור של חזיר יורקשייר בן שמונה עד 10 שבועות. אתר את הג'ג'ונום, כ -40 סנטימטרים אוראליים לצומת האילאוצקלי.קשרו את המעי פעמיים כדי לתחום לולאות ג'ג'ונום באורך 10 סנטימטר עם סנטימטר אחד בין כל קשירה. צור שתי לולאות לכל נקודת זמן של איסכמיה הסמוכות זו לזו, אחת לאיסכמיה ואחת לאיסכמיה עם שעה נוספת של רפרפוזיה. כדי לגרום לאיסכמיה מלאה הפיכה, השתמש במלחציים וסקולריים של בולדוג או בהמוסטטים כדי לחסום כשלושה כלי דם מזנטרי לכל מהדק לפרק הזמן הניסיוני המתאים.שמור על הבטן מכוסה לאורך כל התקופה האיסכמית. בסוף הניסוי, השתמש במספריים של מצנבאום כדי לאסוף תחילה פיסת ביקורת של ג'ג'ונום רגיל לפחות חמישה עד 10 סנטימטרים קרוב ללולאה האיסכמית האחרונה, ולאחר מכן לאסוף את שאר הלולאות. אחסן את הלולאות מכל נקודת זמן של פציעה במיכלים קטנים של PBS קר כקרח עד לבידוד הקריפטה.כדי לבודד את תאי הגזע של הקריפטה, השתמש בחוט בגודל 20 ומלקחיים של רקמות כדי להפוך כל לולאה של המעי הדק כך שמשטח הרירית ייחשף. תפרו את החלק העליון והתחתון של כל לולאה היטב לחוט, ושטפו כל לולאה הפוכה ב-PBS קר כקרח. לאחר הסרת כל הפסולת הלומינלית, הנח מיד את הדגימות בצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה מספר אחת על קרח למשך 30 דקות עם ניעור והיפוך כל חמש דקות.בתום תקופת הדגירה, העבירו את הדגימות לצינורות תואמים של 50 מיליליטר המכילים 30 מיליליטר של מגיב דיסוציאציה מספר שתיים וגלולה את דגימות הלולאה האיסכמית של שעתיים עד ארבע שעות על ידי צנטריפוגה. השעו מחדש את הכדורים בחמישה מיליליטר PBS והשתמשו בכמות של 50 מיקרוליטר מכל דגימה כדי לבדוק את מידת האסוציאציה של הקריפטה וכמות הפסולת במיקרוסקופ אור. לאחר מכן, הניחו את הדגימות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם ניעור או היפוך כל חמש דקות.לאחר מכן העבירו את הדגימות ישירות ל-25 מיליליטר של PBS קר כקרח על קרח בשייקר מסלולי המוגדר ל-60 סל"ד למשך שתיים עד חמש דקות של ניעור עם ניעור ידני נוסף או היפוך כל 30 שניות. בתום הדגירה המטלטלת, בדוק את מידת הקשר של הקריפטה וכמות הפסולת והעביר את הדגימות לצינורות חרוטיים חדשים של 50 מיליליטר המכילים 25 מיליליטר PBS קר לטלטול עד לבידוד קריפטות שלמות עם מינימום פסולת ווילי. לאחר שהלולאות התנתקו לחלוטין, הסר את הרקמה שנותרה, הטיל את הדגימות על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את כדורי הקריפטה הנותרים בחמישה מיליליטר של PBS טרי.לאחר מכן מביאים 150 קריפטות לכל שפופרת לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגות בודדים ומגלגלים את הקריפטות על ידי מיקרו-צנטריפוגה. בעזרת פיפטה מקוררת מראש, השעו בעדינות את הכדורים עם 50 מיקרוליטר תערובת מאסטר לבאר ואחריה פיפטינג מהיר 15 פעמים לערבוב. לאחר מכן, הוציאו טיפת קריפטה של 50 מיקרוליטר למרכז כל באר של צלחת 24 בארות מתולעת ומרושתת מראש והניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.לאחר 30 דקות, כסו כל קציצת מטריצה ב-500 מיקרוליטר לבאר של מדיום תאי גזע אפיתל במעי והוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל בארות שאינן בשימוש כדי לשמור על לחות ולספור את מספר הקריפטות המצופות, יום אפס. הוסף גורמי גדילה לכל באר כל 48 שעות, והחלף את הסופרנטנט כל 96 שעות ב-500 מיקרוליטר של מדיום טרי בתוספת גורם גדילה. איסכמיה מלאה של המעי נוצרת בלולאות המעי הדק על ידי שימוש בחסימת כלי דם עם תפרים או מהדקים, כפי שמוצג.אם מבוצעת כהלכה, הפגיעה האיסכמית תתחיל בקצה וילי המעי ותנדוד מטה בתוך הקריפטה ככל שמשך האיסכמיה גדל. טעות נפוצה אחת בטכניקה הכירורגית יכולה להתרחש כאשר כלי הדם אינם קשורים או מהודקים באופן שווה, וכתוצאה מכך איסכמיה דימומית שבה הווריד בעל הדופן הדקה קורס לפני העורק, ומאפשר לדם נוסף לחדור לרקמות. לאחר הסרת לולאות המעי האיסכמיות, ניתן לבודד בהצלחה את קריפטות המעי בעקבות פרוטוקול הדיסוציאציה כפי שהודגם זה עתה.קריפטות מנקודות זמן שנפגעו בצורה חמורה יותר נשברות לעתים קרובות ומכילות יותר פסולת סלולרית ברקע בהשוואה לאלה שלא עוברות נזק או נזק קל. כאשר קריפטות מעיים רגילות ופגועות קלות מצופות בתרבית, אנטרוספירות נוצרות תוך 24 עד 48 שעות. עם נזק איסכמי חמור, קריפטות המעי שורדות אך נפגעות וכתוצאה מכך נוצרות כדורים קטנים בהרבה בתחילה.ב-72 עד 120 שעות, אנטרואידים מכל הקריפטות הופכים מורכבים יותר עם לומן מרכזי ברור ומבנים ניצנים, ועם ירידה כללית ביעילות צמיחת הקריפטה, כמו גם ירידה בגודל האנטרואידים שמקורם ברקמת המעי שנפגעה קשות. לאחר השליטה, ניתן להשלים את הליכי בידוד הקריפטה תוך כשעתיים-שלוש אם הם מבוצעים כראוי. עדיף שהקריפטות שנאספו לציפוי נגזרות מכביסות ולא משברי ניתוק בשל הסבירות המוגברת לזיהום תרבית בשבר הניתוק.ניתן להשתמש בשיטה זו גם לבדיקת יעילותן של תרופות לטיפול בפגיעות אפיתל הנובעות מאיסכמיה פלוס או מינוס רפרפוזיה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של מערכת העיכול לחקור את השפעת האיסכמיה על האפיתל במיוחד על תאי גזע במעי במודל של בעלי חיים גדולים תרגומי ורלוונטי מבחינה קלינית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור איסכמיה במעי עם או בלי רפרפוזיה וכן לבודד קריפטות מעיים לתרבית תלת מימדית בעקבות פגיעה in vivo.

intestinal-stem-cell-isolation-culture-porcine-model-segmental-small

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מאמר זה ולהציג את הווידאו הנלווה הפרוטוקול שלנו ליצירת רקמות מהונדסות מעי בעכבר, באמצעות גישת organoid יחידות על פיגום.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

כאן אנו מתארים את ההליך המפורט של reperfusion איסכמיה מעיים בעכברים שתוצאתה הפגיעה לשחזור ללא תמותה לעודד סטנדרטיזציה של טכניקה זו על פני השדה. מודל זה של פגיעת איסכמיה-רה-פרפוזיה במעי יכול להיות מנוצל כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של פציעה והתחדשות.

דגם Murine של פגיעת המעיים איסכמיה reperfusion

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות לביסוס אורגנואידים של המעי הדק של מורין, בידוד תאי לימפואידים מולדים מסוג 1 מהלמינה פרופריה של המעי הדק מורין, והקמת תרביות משותפות תלת-ממדיות (3D) בין שני סוגי התאים כדי לחקור אינטראקציות דו-כיווניות בין תאי אפיתל במעי לבין תאי לימפואידים מולדים מסוג 1.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד mesenchyme המעי murine, כולל telocytes. אלה יכולים לשמש למספר יישומים, כגון תרבות משותפת עם עכבר או אורגנואידים שמקורם בבני אדם, כדי לתמוך בצמיחה ולשקף טוב יותר את המצב ברקמה המקורית.

בידוד של מזנכימה במעי מורין וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של טלוציטים

אנו מתארים כיצד ליצור מודל כירורגי נפוץ של פגיעה איסכמיה רפרפוזיה במעיים (IRI) במכרסמים. ההליך כרוך חסימה של העורק mesenteric העליון ואחריו שחזור זרימת הדם. מודל זה שימושי למחקרים הבוחנים גורמים חוסמים של IRI במעיים הן ברפואה וטרינרית והן ברפואה אנושית.

מודל מכרסם של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה במעי באמצעות חסימה של העורק המזנטרי העליון

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה. אנו מתארים גם שיטה להקמת חד-שכבות תאים הנגזרות מאורגנואידים תלת-ממדיים, המאפשרים גישה לצד האפי של תאי אפיתל.

תרבית אורגנואידים תלת-ממדיים במעי חזרזיר מקריפטים אפיתליאליים שמורים בהקפאה והקמת חד-שכבות תאים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב לרכישת לבלב חזירי לבידוד וטיהור איונים.

זילוח כירורגי ובידוד הלבלב החזירי לבידוד האי

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

למדו לבודד תאי גזע מעיים מחזירי יורקשייר לאחר איסכמיה סגמנטלית. הפרוטוקול מדגים בידוד קריפטים, תרבות תלת-ממדית והיווצרות אנטרוספירות לחקר תיקון אפיתל לאחר פגיעה איסכמית.

בידוד תאי המעי ותרבות במודל של חזירי של סגמנטלי איסכמיה במעיים קטן

גלה סרטונים נוספים