לכימות מיקרוגלייה מורפולוגיה של Photomicrographs של אימונוהיסטוכימיה מוכן רקמות באמצעות ImageJ

המטרה הכוללת של שיטות ניתוח שלד ופרקטלים אלה היא למדוד מורפולוגיה של מיקרוגליה מרקמה שהוכנה על ידי IHC, תוך שימוש בשיטות כמותיות שהן גם בעלות תפוקה גבוהה בטבע וגם רגישות לאיתור הבדלים קטנים בצורות התאים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירו-דלקתי, על ידי הגדרת הניואנסים של צורת מיקרוגליה ותפקודה במהלך בריאות וחולי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מכמתת מורפולוגיה של מיקרוגליה באמצעות משתנים רציפים ולא קטגוריים.

השיטות המתוארות כאן אינן דורשות תוכנה קניינית, וניתן להשתמש בהן לסינון אזורי מוח או לניתוח תא אחר תא. מי שתדגים את ההליך תהיה קימברלי יאנג, טכנאית מהמעבדה שלי. לפני שתתחיל, ודא שהתוסף AnalayzeSkeleton הורד ל-ImageJ או לפיג'י.

לאחר מכן פתחו ערימת Z של 30 מיקרון המציגה מוח מוכתם חיסוני של Iba1. אם אתם משתמשים בפוטומיקרוגרף פלואורסצנטי, ודאו שהתמונה היא בגודל 8 סיביות, והמירו לגווני אפור כדי להמחיש בצורה הטובה ביותר את כל הצביעה החיובית. השתמש בסרגל הכלים ולחץ על תמונה, טבלאות חיפוש, גווני אפור.

אם אתה משתמש בצילום שדה בהיר של DAB, השתמש תחילה בתוסף המסנן FFT Bandpass עם הגדרות ברירת המחדל. לחץ על תהליך, FFT, מסנן פס פס ולאחר מכן המר לסולם אפור. אם התמונה עמומה מכדי להמחיש את תהליך המיקרוגליה, השתמש בסרגל הכלים ולחץ על Image, Adjust, Brightness/Contrast.

התאימו את מחווני המינימום או המקסימום בהתאם לצורך, עד לקצוות ההיסטוגרמה, אך לא מעבר לכך. התאמת הבהירות מייצרת את השונות הגדולה ביותר בניתוח הנתונים, ולכן היא השלב הקריטי ביותר. לאחר מכן, הפעל מסנן Unsharp Mask כדי להגדיל עוד יותר את הניגודיות, על-ידי לחיצה על Process, Filters, Unsharp Mask.

בצע שלב הסרת כתמים כדי להסיר רעשי מלח ופלפל שנוצרים על ידי מסכת Unsharp. השתמש בסרגל הכלים ולחץ על Process, Noise, Despeckle. המר את התמונה לבינארית על-ידי בחירה באפשרות Image, Adjust, Threshold.

לאחר מכן החילו את הפונקציה Despeckle על התמונה הבינארית כדי להסיר את הרעש שנותר מפיקסל בודד. לאחר מכן החל את סגור פונקציה על ידי לחיצה על תהליך, בינארי, סגור, כדי לחבר פיקסלים כהים המופרדים בשני פיקסלים לכל היותר. לאחר מכן, הסר חריגים על ידי לחיצה על תהליך, רעש, הסר חריגים.

לאחר שמירת התמונה כקובץ נפרד לשימוש עתידי, שלד את התמונה באמצעות סרגל הכלים, בלחיצה על Process, Binary, Skeletonize. בחר את התמונה השלדית והפעל את התוסף AnalyzeSkeleton על ידי לחיצה על תוספים, שלד, ניתוח שלד וסימון תיבת המידע של הענף. העתק את הנתונים מהתוצאות ופלטי המידע של הענף, והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני של Excel.

ב- Excel, חתוך את הנתונים כדי להסיר מקטעי שלד הנובעים מ- IHC ומרכישת תמונות. קבע איזה אורך של שברים ייחתך מסל הנתונים על ידי פתיחת התמונה השלדית ב-ImageJ ובחירה בכלי Line. מדוד מספר קטעים, שים לב לאורך הממוצע, והחליט על ערך חיתוך, שאמור להיות עקבי לאורך כל מערך הנתונים.

מיין את הגיליון האלקטרוני של Excel בהתאמה אישית על-ידי לחיצה על מיון וסינון, מיון מותאם אישית. מיין לפי ווקסלים של נקודות קצה מהגדול לקטן ביותר, וברמה חדשה, לפי ענף Mx PT מהגדול לקטן ביותר. הסר כל שורה המכילה שתי נקודות קצה עם אורך הסתעפות מרבי של פחות מערך החיתוך.

סכם את הנתונים בעמודה נקודות קצה כדי לחשב את המספר הכולל של נקודות קצה שנאספו מהתמונה. חזור על הפעולה עבור נתוני מידע ענף לאחר מיון לפי אורך ענף. לאחר שכל הנתונים נחתכו וסוכמו, חלקו את הנתונים מכל תמונה במספר המיקרוגליה סומה בתמונה המתאימה.

הזן את נקודת הקצה הסופית ואת אורך התא ונתוני הענף לכל תא לתוכנה סטטיסטית. ודא שהתוסף FracLac הורד. לאחר מכן השתמש בכלי המלבן כדי לצייר את ההחזר על ההשקעה.

ודא שהתיבה גדולה מספיק כדי ללכוד את התא כולו, ויכולה להישאר עקבית לאורך כל מערך הנתונים. בחלון מנהל החזר ההשקעה, בחר עדכן כדי לנעול את ההחזר על ההשקעה בתא שנבחר באופן אקראי בפוטומיקרוגרף. פתח את התמונה הבינארית המכילה את התא שנבחר.

לחצו פעמיים על הכלי Paintbrush, קבעו את הצבע לשחור והתאימו את רוחב המברשת בהתאם לצורך. השתמש בפוטומיקרוגרף התואם כהפניה, השתמש במכחול כדי להסיר תהליכי תאים סמוכים, לחבר תהליכים מקוטעים ולבודד את התא המבוקש. לאחר בידוד התא הבינארי, שמור את הקובץ הבינארי.

המר את התא הבינארי למתאר באמצעות סרגל הכלים, באמצעות תהליך, בינארי, מתאר. בסרגל הכלים, פתח את FracLac באמצעות סרגל הכלים, על-ידי לחיצה על תוספים, ניתוח פרקטלי, FracLac, ובחר BC לספירת תיבות. ב-Grid Design, קבעו את Num G על ארבע.

תחת אפשרויות גרפיקה, סמן את תיבת המדדים כדי לנתח את הגוף הקמור והמעגל התוחם של התא. בסיום, בחר בסדר ולאחר מכן בחר בלחצן סריקה כדי להפעיל סריקה של ספירת תיבות בתמונה שנבחרה. בחלון תוצאות גוף ומעגל, העתק את כל תוצאות הנתונים הרצויות.

לאחר מכן עשה את אותו הדבר בחלון סיכום ספירת תיבות. העברת הנתונים המועתקים לקובץ אקסל או לתוכנה סטטיסטית. גרף זה מציג נתוני סיכום של נקודות קצה של מיקרוגליה לתא ואורך מעובד לתא ברקמת קליפת המוח הלא פגועה והפצועה.

זו התוצאה של הניתוח עם הפרוטוקול שהוחל. בשני המקרים, ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן T של סטודנטים, ושלוש תמונות נותחו. יש לנקוט בזהירות לגבי שונות בין משתמשים ביישום הפרוטוקול.

הבדלים כאלה מסוכמים כאן, כאשר אותו מערך נתונים נותח על ידי שני משתמשים עצמאיים המיישמים פרוטוקול זהה. למרות שהמגמות דומות לאורך כל הדרך, השונות בין המשתמשים משפיעה על משמעות הנתונים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהמטרה היא להשיג שלד או מודל מתאר המייצג את הפוטומיקרוגרף המקורי.

המשמעות היא שהשלבים עשויים להיות ניתנים לשינוי לצרכים הספציפיים של החוקר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לכמת במהירות מורפולוגיה של מיקרוגליה מצולומים מיקרוגרפים של רקמות אימונוהיסטוכימיות באמצעות תוכנת מחשב זמינה.