אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון כיצד מוסדרים היווצרות מורכבים של תיקון DNA, לוקליזציה ורזולוציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לזהות באופן חד משמעי שינויים ולתקן לוקליזציה וקינטיקה מורכבים. בנוסף לחוקרים לתואר ראשון במעבדה שלי, שלושה סטודנטים לתארים מתקדמים יבצעו את הניסויים.

אלה יהיו צ'אנגקון הו, דלטון דאקוס וסטיבן וולטרהאוס. כדי להתחיל, גדל תאי U2OS / DR-GFP על צלחת תרבית רקמה של 10 סנטימטר עד שהם מתכנסים 85 עד 90%. לאחר מכן הסר את המדיום, הוסף שלושה מיליליטר EDTA ודגר את התאים בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.

החלף את ה-EDTA במיליליטר אחד של טריפסין ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר DMEM כדי לנטרל את הטריפסין. לאחר ספירת התאים, זרעו שש פעמים 10 עד התאים השלישיים לבאר ב-200 מיקרוליטר מדיום בצלחת זכוכית של 96 בארות.

לחלופין, זרעו ארבע פעמים 10 לשש הבארות בשמונה מיליליטר של מדיום על תלושי כיסוי של 12 מילימטר המונחים בצלחת של 10 סנטימטרים, ואז גדלו את התאים במהלך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לגרום לשבירת גדיל כפול, או DSBs, החלף את המדיום במי חמצן מדולל לריכוז של 25 מיקרומולר עם DMEM בתוספת 10% FBS ודגר את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. שטפו את התאים שלוש פעמים עם 1x PBS, ואז הוסיפו DMEM טרי.

כדי לתקן את התאים לאחר הדגירה שלהם, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הצלחת שלוש פעמים. לאחר מכן השתמש במחט ובמלקחיים כדי להסיר בזהירות את החלקת הכיסוי מהצלחת של 10 סנטימטר לכל נקודת זמן ולהניח אותה בבאר אחת של צלחת של 24 בארות. הוסף 4% PFA ודגר על התאים למשך 15 דקות.

ואז אנחנו PBS לשטוף את הכיסוי מחליק שלוש פעמים. כדי לחדור לתאים, הוסף 0.5% חומר ניקוי לא יוני ו- PBS. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.

לאחר מכן שטפו את התאים שוב עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסף 3% BSA ו-0.1% חומר ניקוי לא יוני מדולל ב-PBS להחלקות הכיסוי בצלחת של 24 בארות ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן הוסיפו נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון התיקון המעניין ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר שטיפת התאים עם PBS שלוש פעמים, הוסיפו DAPI ודגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן דגרו את הדגימות עם נוגדנים משניים. לאחר שטיפת התאים כמו קודם, השתמש במגיב הרכבה כדי להרכיב את הכיסוי מחליק את צד התא כלפי מטה על שקופיות.

לחץ בזהירות על החלקות הכיסוי והשתמש במגבון כדי לספוג כל מגיב הרכבה עודף. אטום את החלקות הכיסוי עם לק שקוף המתייבש במהירות והקפד על אטימה מלאה של החלקת הכיסוי עם השקופית. צלם תמונות מיקרוסקופ קונפוקלי על ידי התמקדות בערוץ DAPI.

כדי להגדיר את הגרעינים בתמונות אימונופלואורסצנטיות, פתח את התמונות הקונפוקליות על ידי גרירת קובץ התמונה לחלון ImageJ או על ידי בחירת מייבא פורמטים ביולוגיים מסרגל הכלים של התוסף ב-ImageJ. לאחר מכן בחר ערוצים מפוצלים. תחת אפשרויות צבע, בחר צבעוני מהתפריט הנפתח.

בחר OK כדי לפתוח את תמונות DAPI ו- histone H2AX כחלונות נפרדים ובחר את תמונת DAPI. לאחר מכן בחר את סרגל הכלים של התמונה באפשרות סף ההתאמה כדי לבחור את הגרעין. לאחר מכן, כוונן את סף התמונה על ידי החלקת הסרגל התחתון של חלון הסף ימינה לחלוטין

כוונן את הסרגל העליון עד שהגרעינים נראים אדומים לחלוטין עם קווי מתאר ברורים והרקע שחור. לאחר מכן בחר בסרגל הכלים ניתוח ובאפשרות ניתוח חלקיקים. הזן את הגודל המינימלי של הגרעין.

מהתפריט הנפתח הצג בחר מתאר ולאחר מכן בחר באפשרות הוסף למנהל. לחץ על אישור כדי לפתוח חלון מנהל החזר ROI. מחלון מנהל החזר ההשקעה, הקצה מספרים לגרעינים לפי בחירה.

כדי להשתמש ב-ImageJ כדי לכמת מוקדי H2AX ותמונות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית, בחר בחלון מוקדי H2AX. לאחר מכן בחר בסרגל הכלים תהליך ובחר מצא מקסימום כדי למצוא מוקדים בתוך הגרעין. מהתפריט הנפתח של סוג הפלט, בחר באפשרות הנקודות הבודדות ובחר בבחירת נקודת התצוגה המקדימה כדי להמחיש את מוקדי המקסימום.

לאחר מכן הזן ערך סובלנות לרעש בהתאם לעוצמת הפריחה של התמונה. מחלון מנהל ה-ROI בחר את הגרעינים שעבורם יש לכמת מוקדי H2AX. בחר מידה כדי למדוד את מספר מוקדי המקסימום בתוך הגרעינים שנבחרו.

העתק את ערכי העוצמה הגולמיים והדבק אותם בתוכנה לניתוח נתונים. לאחר הושבת תאים על צלחות של 96 בארות עם החלקות כיסוי כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, לגרום לשבירת גדיל כפול על ידי שימוש בחומר טרנספקציונרי מבוסס ליפידים כדי להעביר תאים עם וקטור הביטוי I-SceI. כדי לרכוש דמיון לאחר שטיפת תאים חדירים וחסומים כפי שהוצג קודם לכן, הוסף נוגדנים נגד גמא H2AX ותקן חלבון מעניין.

עם שטיפת PBS 1x, כיסוי הצלחת בן 96 הבארות מחליק שלוש פעמים. לאחר מכן דגרו על החלקות כיסוי הצלחת של 96 בארות עם נוגדנים משניים. לבסוף, לאחר זיהוי התאים שיש להם מיקוד גמא H2AX גרעיני גדול, ספרו ידנית את אלה שמראים גם קולוקליזציה עם חלבון התיקון המעניין.

נתון זה מראה אפליית רעש של 90 ומסמן את המספר הנכון של מוקדים. גרעינים בקצה ומוקדים מחוץ לגרעינים אינם נספרים במהלך הכמות. הפאנל המוצג כאן מתאר סובלנות רעש נמוכה של 50.

מקסימום רב מזוהה מחוץ לגרעין ובתוך הגרעין. סובלנות גבוהה לרעש של 220 נמצאת בתא זה. זוהה מוקד אחד בלבד.

קולוקליזציה של מוקד גמא H2AX וחלבון תיקון מעניין מתואר באיור זה. תא לא טרנספטנטי מוצג כאן, ותא עם מיקוד גמא H2AX לא גרעיני מוצג בפינה הימנית העליונה. בהגדלה גבוהה יותר ניתן להבחין בתמונה ברורה יותר של מיקוד פנימי אמיתי ומיקוד לא גרעיני או חיצוני.

לבסוף, דוגמה למיקוד גמא גרעיני H2AX ללא קולוקליזציה של חלבון תיקון מוצגת כאן. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו משקעים קו-מוטורים על מנת לזהות אינטראקציות בין חלבוני תיקון מעניינים.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתבונן בהיווצרות וברזולוציה של מתחמי תיקון DNA על ידי גרימת הפסקות גדיל כפול חולפות ב- DNA. תלמד גם כיצד להבחין באופן חד משמעי בין מיקום שגוי של גורמי תיקון לבין גיוס מאוחר על ידי גרימת נגעים ארוכי טווח.