Name: שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: למד שיטת הכנה מדגם משופרת ל-MALDI MS לניתוח פחמימות. הפרוטוקול משתמש בריקריסטליזציה במתנול לשיפור אינטנסיביות האות והאיכות הקריסטלית של הדגימה לתוצאות אנליטיות אמינות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים לא תודות לך

1. מדגם פלייט Preconditioning
<ol><li>
ניקוי של צלחת מדגם
	<ol>
<li>ללבוש nitrile כפפות כדי למנוע זיהום של צלחת מדגם במהלך הניקוי.</li>
		<li>יד-לשטוף הצלחת מדגם עם mL 100.0 בפתרון דטרגנט (1.0 mg/mL).</li>
		<li>יד-לשטוף הצלחת מדגם במים מזוקקים-יונים (DDW).</li>
		<li>לשטוף את המשטח צלחת מדגם mL 30.0 של MeOH.</li>
		<li>לשים. את הצלחת מדגם גביע 600 מ ל, מילוי עם DDW עד לצלחת מדגם מלא שקועה בתוך המים.</li>
		<li>לשים את הספל אולטרה סאונד אמבטיה (ראה טבלה של חומרים), sonicate את הצלחת מדגם למשך 15 דקות (200 W, 40 קילו-הרץ).</li>
		<li>להוציא לצלחת לדוגמה, לפוצץ את טיפות המים באמצעות חנקן בלחץ.</li>
		<li>להפקיד 0.2 µL של MeOH על הצלחת לדוגמה כדי לבדוק אם MeOH מתפשטת למקומות אחרים. הערה: אם MeOH מתמזג עם מקומות אחרים, חזור על השלבים 1.1.3-1.1.5; אם לא, המשך לשלב הבא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
רגולציה של ייבוש קאמרית טמפרטורה
	<ol>
<li>השתמש תא ייבוש בתנאים יציב להתייבש טיפות, כפי שתואר לעיל11,12,13. בפרט, השתמש בהליך מפורט שתואר בשלבים 2.1-2.5 של Ou, י'-מ'. et al. 201612. בקצרה:<ol>
<li>לטהר את החדר הייבוש על-ידי חנקן בטמפרטורת החדר בספיקה קבועה כדי לשמור על סביבת לחות יחסית נמוך.</li>
			<li>לשמור על מדגם פלייט טמפרטורה קבועה רגיל - (25 ° C) או תנאים ייבוש מהיר (50 ° C), מוסדר על ידי גוש נחושת מבוקרי טמפרטורה בחדר הייבוש.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אופן ההכנה של פתרונות מטריקס ו- analyte
	<ol>
<li>
הכנה של מטריקס פתרונות
		<ol>
<li>להמיס DHB ב- 50% acetonitrile (לחצן מצוקה): 50% DDW להכין פתרון 0.1 M.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
הכנת analytes פחמימות
		<ol>
<li>להמיס מירה כהןA ב DDW להכין 10-4 פתרון מ'.</li>
			<li>להמיס MH ב DDW להכין ז 10-4 פתרון.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. לטעום התצהיר ו- Recrystallization
הערה: ההליכים ממוטב עבור ניתוח קטן ורגיל כמויות של דגימות מתוארים כאן. ודא כי הטמפרטורה צלחת מדגם הוא התייצב על הטמפרטורה הרצויה לפני הפקדת את הפתרונות. אם המדגם משתרעת שטח גדול כדי לכסות במקומות אחרים דוגמת במהלך recrystallization, להכין מדגם חדש או חזור על שלב 1.1.
<ol><li>
לניתוח של כמות קטנה (0.1 µL) של מדגם הערה: השלבים הבאים פותחו עבור משימותינו דוגמה והשעה. היא מתאימה לניתוח כמותי של דוגמאות אמיתיות עם כמות מוגבלת או IMS מהיר עבור ניתוח כימות.<ol>
<li>Premix µL 0.25 DHB פתרון ו 0.25 µL של מירה כהןA או פתרון MH צינור microcentrifuge.</li>
		<li>מערבולת הפתרון מעורבת באמצעות מערבל מערבולת 3 s.</li>
		<li>ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).</li>
		<li>השתמש פיפטה כדי למשוך µL 0.1 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם. הערה: בעת הפקדת כמות קטנה של דגימה, לא שים הפתרון מעורבבים מראש קצה פיפטה עבור למעלה מ- 10 s.</li>
		<li>המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.</li>
		<li>השתמש פיפטה להפקיד 0.2 µL של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד. הערה: להבטיח כי התצהיר כשההליך יסתיים ב- 3 s כדי למנוע אידוי משמעותית אובדן MeOH.</li>
		<li>לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.1.1-2.1.6 להכין מדגם חדש.</li>
		<li>ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לניתוח כמות רגילה (1 µL) של מדגם הערה: השלבים הבאים מפותחים עבור למקסם ההומוגניות של פחמימות דגימות עם שימוש בדרך כלל כמות מדגם MALDI. התהליך מתאים שגרתית ו כמותני. תהליך recrystallization מפזרת מחדש מטריצות באופן שווה על אזורים גדולים יותר ודוגמאות.<ol>
<li>Premix 2.5 µL של פתרון DHB ו 2.5 µL מורן סלםA או פתרון MH צינור microcentrifuge.</li>
		<li>מערבולת הפתרון מעורבבים מראש עם מערבל מערבולת עבור 5 s.</li>
		<li>ספין למטה הפתרון מעורב ומפרידה מיני עבור 2 s (2000 x g).</li>
		<li>השתמש פיפטה כדי למשוך µL 1.0 של הפתרון מעורבבים מראש מיד להפקיד אותו בצלחת מדגם. הערה: לא להשתמש הנותרים premixed פתרון שוב לאחר הפקדת את הדגימות.</li>
		<li>המתן המדגם להתייבש. ייבוש פעמים טיפוסי מוצגים בטבלה 1.</li>
		<li>השתמש פיפטה להפקיד µL 1.5 של MeOH ימינה אל המקום דגימת יבשים. המדגם יהיה רטוב ויבש מיד. הערה: במקרים עם טמפרטורה צלחת מדגם גבוה (50 ° C), השלב recrystallization צריך להיעשות בתוך 5 s כדי למזער את אידוי MeOH בעצת פיפטה.</li>
		<li>לבחון את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ. אם מורפולוגיות קריסטל אינם כמו שציפיתי (ראה איור 1 לדוגמה של התוצאות הרצויות), חזור על השלבים 2.2.1-2.2.6 להכין מדגם חדש.</li>
		<li>ללבוש את הכפפות nitrile, להוציא בזהירות את הצלחת דגימה מן החדר הייבוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. מסה ספקטרומטר נתוני הרכישה וניתוח
הערה: הניתוח מתבצע באמצעות מסחרית זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (טבלה של חומרים) מצוידים עם מקור יון MALDI. המכשיר מופעל על ידי תוכנת שליטה ספציפי (טבלה של חומרים) עם עיכוב מיצוי מיטבי מראש ואנרגיה לייזר. ספקטרה נרשמים במצב לינארי עם מגוון מסה m/z = 0 – 1500. הצלחת מדגם פוטנציאלי הוא ±25 קוו וכל ספקטרום חישוב ממוצע 10 יריות לייזר. המשתמשים צריכים לנהל כלי אופטימיזציה וניתוח מדגם באמצעות תוכנה תואם ובצע את ההוראות של יצרן כלי.
<ol><li>פתח את תוכנת בקרת מכשיר (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>הכנס את הצלחת מדגם ספקטרומטר מסה.</li>
	<li>בחר את שיטת רכישת נתונים ממוטבת מראש בתוכנה.</li>
	<li>להירשם האזור כל מדגם IMS שימוש בתוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). הערה: דלג על שלב זה אם לא עושה IMS.</li>
	<li>התחל הנתונים במצב אצווה של תוכנת שליטה.</li>
	<li>להתוות את התמונות יון שימוש בתוכנת הדמיה לאחר השלמת רכישת נתונים.</li>
	<li>נתח ספקטרום המונית באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) אם הנתונים מתועד ללא תמונה יון.</li>
</ol>

<ol><li>Holme, D. J., Peck, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolme%2C+DJ+%22Analytical+Biochemistry%22">Analytical Biochemistry</a>. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).</li>
<li>Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time%2C+life+...+and+mass+spectrometry+-+New+techniques+to+address+biological+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions.</a> Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).</li>
<li>Caroff, M., Karibian, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14670707">Structure of bacterial lipopolysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).</li>
<li>Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+in+clinical+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry.</a> Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10639030">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates.</a> Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/0008621584852428">A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.</a> Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).</li>
<li>Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+chromatographic%2C+electrophoretic+and+mass+spectrometric+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis.</a> Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).</li>
<li>Nishikaze, T., Amano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+thin+layer+method+for+enhanced+ion+yield+of+oligosaccharides+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).</li>
<li>Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+matrix+crystal+structure+on+ion+abundance+of+carbohydrates+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).</li>
<li>Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+fast-evaporation+sample+preparation+method+for+improving+quantification+of+angiotensin+II+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).</li>
<li>Lai, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Spatial+Heterogeneity+of+MALDI+Samples+with+Marangoni+Flows+During+Sample+Preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).</li>
<li>Ou, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Homogeneous+MALDI+Samples+for+Quantitative+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+carbohydrate+ion+yield+by+controlling+crystalline+structures+in+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).</li>
<li>Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0169433296005302">Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes.</a> Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).</li>
<li>Sadeghi, M., Vertes, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169433297006363">Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization.</a> Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

לדוגמה הטרוגניות היא שבעיה מכרעת בדמוקרטיה. גברת MALDI הוא הכי נפוץ שיטת הכנה דגימה, אך הקריסטלים תוצאות מאוד הטרוגנית. דוגמאות כאלה מציגות הפארמצבטית נמוכה של אות ירה--ירייה, לדוגמה-כדי-sample. לכן, בחיפוש אחר "מתוק כתמים" באזורים דוגמת במהלך איסוף הנתונים הוא הליך נפוץ בניסויים MALDI. . הדגימות הטרוגנית כזה ומבניות על כימות בניתוח שגרתי
במחקר הנוכחי, מורפולוגיה מדגם MALDI ממוטבת על-ידי recrystallization. השיפור פחמימות אות עוצמה ויציבות נתונים על-ידי recrystallization מיוחס התאגדות משופרת בי...

ניתוח פחמימות הוא נושא חשוב ומאתגר. פחמימות ונגזרותיהם תפקיד חשוב לחיות אורגניזמים1,2,3. מולקולות אלה סיבכו מבנים, נוטים מתפרקים. רבים מהם לא יכול להיות ברור מאופיין בשל קשיים הפרדה וזיהוי. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) ספקטרומטר מסה (MS) הוחלה על ניתוח של מגוון רחב של מולקולות, בשל הרגישות שלה תוצאות מובנים4, ניתוח פחמימות באמצעות MALDI-MS ממשיכה להיות אתגר גדול בשל היעילות יינון נמוכה של מולקולות כאלה5. Derivatization כימית היא דרך נפוצה כדי לשפר את יעילות יינון של פחמימות6,7, אבל הליכים כאלה הם לדוגמה לצרוך וזמן. חוץ מזה, היעילות יינון של פחמימות derivatized הוא עדיין נמוך מזה של חלבונים. לפיכך, בפיתוח שיטות לשיפור האות פחמימות MALDI-MS ללא פרוצדורות מסובכות הכרחי.
היישום של MALDI-MS כדי ניתוח כמותי הוא נושא מאתגר אחר. אחת הבעיות המרכזיות של MALDI-MS היא כי שלה הפארמצבטית רגישות ונתונים מסתמך באופן ביקורתי על מדגם הכנת פרוטוקולים ופרמטרים ניסיוני. במקרים רבים, ניתוח כמותי על-ידי MALDI-MS הוא לא אמין עקב מדגם הטרוגנית מורפולוגיות והפצה analyte. דוגמה ידועה היא דגימות המוכנים מטריצה (DHB) MALDI 2, 5-dihydroxybenzoic חומצה. כאשר DHB הוא גיבש אט-אט תחת סביבת אמביינט, מידת השתלבות analyte מטריקס קריסטלים הוא בלתי צפוי, כי תוצאות דגימות הראו מורפולוגיות לא סדיר. דוגמאות כאלה בדרך כלל מורכב גבישים גדולים בצורת מחט, בסדר. כאשר DHB מוכנה תוך שימוש של ממס נדיף ו/או צלחת המדגם מחומם, תהליך ייבוש מהיר התוצאה קריסטלים בסדר הומוגנית יותר תוצאות כמותיות8,9,10. טכניקה זו ידועה בשם "recrystallization" של דגימות MALDI. השיפור מיוחס יותר תיאגוד analytes לתוך מטריצה בסדר קריסטלים במהלך תהליך התגבשות מהר. גם הראו כי התאמת הסביבה הכנה מדגם צמצם את הטרוגניות של פחמימות אות ושיפור תוצאות כמותיות11,12. הממצאים בעבודות אלה מראים כי מדגם המורפולוגיה היא גורם קריטי בקביעת איכות אות פחמימות. כדי לפתח אסטרטגיה כללית לניתוח יומי, שיטה הרפורמציה מדגם יעיל במתן פחמימות משופרת רגישות נדרש.
בחנו באופן שיטתי המתאם בין מדגם מורפולוגיה, פחמימות רגישות ב MALDI-MS דו ח זה התבצעה13. התוצאות שהושגו באמצעות כמה פחמימות חשובה, הצג מטריצות שיפור האות הטוב ביותר מתגשמת מאת recrystallizing מיובשים MALDI דגימות. המורפולוגיה של דגימות שהוכנו בשיטת רביב מיובשות קונבנציונליות (DD) תוקן על ידי recrystallization מהיר עם מתנול (MeOH). הפרוטוקולים הכנה מפורטת מדגם מודגמות כאן. הפרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים, כולל מדגם פלייט preconditioning, דוגמת התצהיר, recrystallization, וניתוח ספקטרומטר מסה. הפחמימות שימוש כוללים sialyl-לואיס (מירה כהןA), maltoheptaose (MH). DHB משמש מודל מטריצה. התוצאות מציגות עוצמת האות פחמימות והפצה המרחבי השתפר בצורה ניכרת אחרי recrystallization. השיטה ניתן ליישם דגימות עם מטריצות פופולריים אחרים, כולל 2,4,6-trihydroxyacetophenone (תאפ) וα- cyano-4-hydroxycinnamic חומצה. שיטה זו משמשת בגישה כללית אשר ניתן לשלב בקלות בתוך השגרה מעבדה לניתוח פחמימות.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנט</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אבקת דטרגנט</td><td>אלקונוקס</td><td>242985</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Merck</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>Merck</td><td>100003</td><td></td></tr><tr><td>2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB)</td> <td>Alfa</td><td>Aesar A11459</td><td></td></tr><tr><td>sialyl-lewis A (SLeA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1782</td><td></td></tr><tr><td>Maltoheptaose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה</td><td>מטלר טולדו</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q מערכת טיהור מים</td><td>Millipore</td><td>ZMQS6VFT1</td><td></td></tr><tr><td>כפפות ניטריל ללא אבקה</td><td>Microflex</td><td>SU-690</td><td></td></tr><tr><td>600 מ"ל</td><td>דוראן</td><td>2110648</td><td></td></tr><tr><td>מנקה אולטרסאונד</td><td>דלתא</td><td>DC300H</td><td></td></tr><tr><td>מד לחות</td><td>Wisewind</td><td>5330</td><td></td></tr><tr><td>מד זרימת גז חנקן</td><td>Dwyer</td><td>RMA-6-SSV</td><td></td></tr><tr><td>צמדים תרמיים מסוג K</td><td>Digitron</td><td>311-1670</td><td></td></tr><tr><td>מערבל וורטקס</td><td>תעשיות מדעיות</td><td>&nbsp; SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>Select BioProducts</td><td>Force Mini&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>Rainin</td><td>pipet-lite XLS</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>תא ייבוש לשליטה בטמפרטורה</td><td>מעבדה זו Ultraflex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>II TOF / TOF ספקטרומטר מסה</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTP 384 צלחת יעד פלדה מלוטשת BC</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Flexcontrol גרסה 3.4</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Control תוכנה</td></tr><tr><td>Fleximaging גרסה 2.1</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>תוכנת הדמיה</td></tr><tr><td>Flexanalysis גרסה 3.4</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td>Analysis תוכנה</td></tr></tbody></table>

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטריית

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

הכנת הדוגמא היא תהליך קריטי בניתוח ספקטרומטר מסה (MS) של פחמימות. למרות לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון (MALDI) MS הוא שיטת הבחירה בניתוח פחמימות, יון המסכן הפארמצבטית אותות ונתונים של פחמימות דגימות ממשיכות להיות בעיות קשות. לניתוח כמותי של פחמימות, פרוטוקול אנליטי יעיל לספק איכות מעולה הנתונים יש צורך. וידאו זה מדגים דוגמת פרוטוקולים הכנה כדי לשפר את עוצמת האות ולצמצם את הנתונים וריאציה של פחמימות MALDI-MS. לאחר ייבוש, התגבשות של מדגם טיפות, המורפולוגיה קריסטל תוקן על ידי מתנול לפני ניתוח המוני spectrometric. שיפור פחמימות אות נבדק עם MALDI הדמיה ספקטרומטר מסה (IMS). תוצאות ניסויית להראות כי קריסטל הרפורמציה התאמת מבנים גבישיים, מפזרת מחדש פחמימות analytes. לעומת שיטת הכנה droplet יבשים MALDI קונבנציונלי-MS, רפורמה מורפולוגיות קריסטל פחמימות עם מתנול מראה עוצמת האות טוב יותר באופן משמעותי, יון התמונה התפלגות נתוני יציבות. מאז הפרוטוקולים הפגינו בזאת אינן כוללות שינויים בהרכב לדוגמה, הם חלים באופן כללי על פחמימות שונים, מטריצות.

תמונות SEM נציג של מירה כהןA מעורבב עם DHB המוכנים DD, שיטות recrystallization מוצגים באיור1. מורפולוגיה DHB טיפוסי כפי שהוכנו על ידי שיטת DD הוא גבישים גדולים בצורת מחט, rim, מבנים גבישיים בסדר במרכז נקודות דגימה. טיפוסי אורך כזה בגביש בצורת מחט הם ~ 100 מיקרומטר. אחרי recrystallization על ידי MeOH, הדגימה יש אזור גדול יותר אחיד מכוסה גבישי בשבב אבן דמוי משובחים. אורך הקריסטלים "פתית" הם בערך 20-50 מיקרומטר. Recrystallized דגימות לספק שטחים משטח י...

פרוטוקול לשיפור אותות יון פחמימות ספקטרומטריית MALDI על ידי מבנים גבישיים רפורמה במהלך תהליכי הכנה מדגם הוא הפגין.

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

הליך הכנת דגימה פשוט פותח כדי לשפר את השיטה הקונבנציונלית בספקטרומטריית מסה של יינון לייזר בעזרת מטריצה על ידי רפורמה במורפולוגיה הפשוטה במהלך תהליך הייבוש. היתרון בטכניקה זו הוא שניתן לשפר ביעילות את עוצמת האות של דגימות פחמימות שהוכנו בשיטה אופטימלית זו. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ששלב הורדת לחץ המתנול הוא חיוני מאוד ויש לעשות זאת במכה אחת.כל היסוס יפחית את איכות הנתונים. כדי להתחיל, תוך לבישת כפפות ניטריל, השתמש ב 100 מיליליטר תמיסת ניקוי כדי לשטוף ידנית את צלחת הדגימה. השתמש במים מזוקקים-דה-יוניים, או DD, כדי לשטוף את הצלחת ביד.לאחר מכן, עם 30 מיליליטר מתנול, שטפו את פני השטח שלו. הכנס את צלחת הדגימה לכוס של 600 מיליליטר ומלא אותה במי DD עד שהצלחת שקועה במלואה. לאחר מכן הכניסו את הכוס לאמבטיה אולטרסאונד והפכו את הצלחת לסוניקציה למשך 15 דקות.הסר את לוחית הדגימה מהכוס והשתמש בחנקן בלחץ כדי לפוצץ את טיפות המים. לאחר מכן הפקידו 0.2 מיקרוליטר מתנול על לוחית הדגימה כדי לבדוק אם הוא מתפשט למקומות אחרים. אם כן, חזור על הכביסה, הסוניקציה והטיפול בחנקן כפי שהודגם זה עתה.לאחר הכנת תא הייבוש על פי פרוטוקול הטקסט, יש לערבב מראש 0.25 מיקרוליטר של תמיסת חומצה 2, 5-דיהידרוקסיבנזואית ו-0.25 מיקרוליטר של סיאליל-לואיס A, או תמיסת מלטוהפטאוז בצינור המיקרו צנטריפוגה. לאחר מכן מערבל את הצינור למשך שלוש שניות. סובב את התמיסה המעורבת בצנטריפוגה המיני ב-2000 פעמים G למשך שתי שניות.ואז מיד פיפטה 0.1 מיקרוליטר מהתמיסה המעורבבת מראש על צלחת הדגימה. כאשר הדגימה התייבשה, תוך כדי עבודה מהירה כדי למנוע אידוי, פיפטה 0.2 מיקרוליטר מתנול ישירות על נקודת הדגימה. הדגימה תתמוסס מחדש ולאחר מכן תתייבש מיד.שלב שקיעת המתנול הוא השלב הקשה ביותר הקובע את איכות הנתונים ויכולת השחזור. כדי להבטיח את הביצועים הטובים ביותר, אנו ממליצים למשתמש לסיים את התצהיר תוך שלוש עד חמש שניות כדי למנוע אובדן אידוי משמעותי של מתנול. ללבוש כפפות ניטריל ולהוציא בזהירות את לוחית הדגימה מתא הייבוש.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ, בדוק את הדגימה. אם מורפולוגיות הגביש אינן כצפוי, חזור על ערבוב הדגימה ואיתור על לוחית הדגימה. כדי להבטיח שלגבישי הדגימה יש את המורפולוגיה האופטימלית לאחר התגבשות מחדש, השתמש תמיד במיקרוסקופ כדי לבחון אותם.קשה לקבוע נכון את איכות המורפולוגיה הגבישית בעין בלתי. כדי לנתח דגימת מיקרוליטר אחת, יש לערבב מראש 2.5 מיקרוליטר של תמיסת חומצה 2, 5-דיהידרוקסיבנזואית ו-2.5 מיקרוליטר של תמיסת סיאליל-לואיס A או מלטוהפטאוז בצינור מיקרו צנטריפוגה. מערבולת את התמיסה המעורבבת מראש למשך חמש שניות.סובב את התמיסה המעורבת ב -2000 פעמים G למשך שתי שניות, ואז מיד פיפטה מיקרוליטר אחד מהתמיסה המעורבת מראש על צלחת הדגימה. לאחר שהדגימה מתייבשת, פיפטה 1.5 מיקרוליטר מתנול ישירות על נקודת הדגימה המיובשת. הדגימה תתמוסס מחדש ותתייבש מיד.הסר בזהירות את הדגימה מתא הייבוש. בדוק את הדגימה במיקרוסקופ. אם מורפולוגיות הגביש אינן כצפוי, חזור על הכנת התמיסה כפי שהודגם זה עתה.כדי לבצע ספקטרומטריית מסה, פתח את תוכנת הבקרה של ספקטרומטר המסה והכנס את לוחית הדגימה למכונה. בחר את שיטת רכישת הנתונים המותאמת מראש בתוכנה, ולאחר מכן באמצעות תוכנת ההדמיה, רשום את כל אזור הדגימה להדמיית ספקטרומטריית מסה. התחל רכישת נתונים במצב אצווה של תוכנת הבקרה.לאחר השלמת איסוף הנתונים, השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לשרטט את תמונות היונים ולנתח את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. תמונות SEM מייצגות של סיאליל-לואיס A מעורבב עם 2, 5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית שהוכנה בשיטות טיפות מיובשות והתגבשות מחדש מוצגות כאן. מורפולוגיה טיפוסית של חומצה 2, 5-דיהידרוקסיבנזואית היא גבישים גדולים בצורת מחט בשפה ומבנים גבישיים עדינים במרכז נקודות הדגימה.לאחר התגבשות מחדש על ידי מתנול, לדגימה יש שטח גדול יותר המכוסה באופן שווה בגבישים עדינים דמויי פתיתים. איור זה מתאר תוצאות הדמיה של ספקטרומטריית מסה של סיאליל-לואיס A ומלטוהפטאוז עם ובלי התגבשות מחדש של מתנול. לאחר התגבשות מחדש, ההתפלגות של אותות סיאליל-לואיס A ו-maltohepaose תואמת היטב את תמונות השדה הבהיר של כתמי הדגימה.עוצמות האות של דגימות הפחמימות שהתגבשו מחדש משופרות גם הן בהשוואה לדגימות טיפות יבשות קונבנציונליות. גרף זה משווה את עוצמת האות של מצב יונים סודיאט או חיובי ופחמימות במצב יונים דה-פרוטונים או שליליים של דגימות שהתגבשו מחדש ביחס לזו של דגימות טיפות מיובשות. בממוצע, התגבשות מחדש של דגימות סיאליל-לואיס A ומלטוהפטאוז הגדילה את האותות הסודיים בגורמים של 3.9 ו-3.3.אותות יונים של סיאליל-לואיס A נטולי פרוטונים שופרו בפקטור של 4.7 לאחר התגבשות מחדש. לאחר השליטה, ניתן להכין דגימות תוך 10 דקות בטכניקה זו אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב שטיפות המתנול יופקדו באופן מיידי ומדויק על נקודת הדגימה.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לשלוט ביעילות במורפולוגיה הגבישית של דגימות מרובות כדי להשיג את אותות היונים הטובים ביותר לניתוח שגרתי.

an-efficient-sample-preparation-method-to-enhance-carbohydrate-ion

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

וידאו זה מדגים את הכנת שכבת מטריצה ​​/ אנליטי דקים לניתוח פפטידים וחלבונים על ידי מטריקס בסיוע לייזר desorption Ionization המוניים ספקטרומטריית (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

מדידת מסה מדויקת מייצגת צעד חשוב במהלך החקירה של חלבונים. desorption / יינון בסיוע מטריקס לייזר (MALDI) ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לשמש לקביעה כאמור והיתרון המרכזי שלו הוא הסובלנות למלחים, חומרי ניקוי וחומרים מזהמים. כאן אנו מדגימים גישה נגישה לניתוח חלבונים גדולים יותר מאשר על ידי MALDI-MS 100 kDa.

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון זמן של טיסה (MALDI-TOF) Mass ניתוח Spectrometric של חלבונים שלמים גדול מ100 kDa

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמה של מולקולות קטנות; פרוטוקולים לשימושם של DT להדמית MALDI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות על ידי חיובי יון MALDI-MS במכשיר quadrupole-FTICR רזולוציה ultrahigh מסופקים כאן.

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

פרוטוקול להפחתת heterogeneities המרחבי של אותות יון ספקטרומטריית MALDI ההמונית על ידי ויסות טמפרטורת מצע במהלך תהליכי ייבוש מדגם מודגם.

הכנת דוגמאות MALDI אחידה עבור יישומים כמותי

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשחזור אמין עבור הכנת פורמלין קבוע רקמות המיועדים ספקטרומטר מסה דימות מבוסס-סובלימציה.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

פרוטוקול עבור לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS) אפיון של פולימרים סינתטיים מתואר כולל אופטימיזציה של הכנת הדוגמא, רכישת ספקטרלי וניתוח נתונים.

אפיון של פולימרים סינתטיים באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption יינון שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה

ספקטרומטריית ניידות יונים (IMS) היא השלמה מעניינת לספקטרומטריית מסה לאפיון ביומולקולות, בעיקר משום שהיא רגישה לאיזומריזם. פרוטוקול זה מתאר ניסוי IMS (IMS/IMS) דו-מושבי, המאפשר בידוד של מולקולה ויצירת פרופילי הניידות של שבריה.

שימוש בספקטרומטר ניידות יונים מחזורי לניסויי ניידות יון דו-מושבית

שיטת הכנת דגימות חדשנית מודגמת לניתוח של מקרוקולוניות חיידקים מבוססות אגר באמצעות ספקטרומטריית מסה של הדמיית ספיחה / יינון בלייזר בסיוע מטריצה.

חקירת שיתוף פעולה מיקרוביאלי באמצעות ניתוח ספקטרומטריית מסות הדמיה של מושבות חיידקים הגדלות על אגר וברקמות במהלך זיהום

פרוטוקול זה נועד לתאר הנחיות מפורטות להכנת קטעי דגימת זרעים קשים עם תכולת מים נמוכה לניתוח MALDI-IMS, שמירה על הפיזור והשפע המקוריים של האנליסטים ומתן אות ורזולוציה מרחבית באיכות גבוהה.

הכנת זרעי דקל קשים לניתוח ספקטרומטריית מסה בסיוע מטריקס בלייזר/יינון-הדמיה

פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות ודוגמאות להכנת דגימות, רכישת נתונים וניתוח נתונים לאפיון פולימרים סינתטיים עם פיזור וקבוצות קצה משתנות באמצעות ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה בלייזר בעזרת מטריצה.

שיטת MALDI-ToF MS לאפיון פולימרים סינתטיים בעלי פיזור וקבוצות קצה משתנות

למד שיטת הכנה מדגם משופרת ל-MALDI MS לניתוח פחמימות. הפרוטוקול משתמש בריקריסטליזציה במתנול לשיפור אינטנסיביות האות והאיכות הקריסטלית של הדגימה לתוצאות אנליטיות אמינות.

שיטת הכנה מדגם יעיל לשיפור אותות יון פחמימות לייזר בסיוע מטריקס Desorption/יינון ספקטרומטריית

גלה סרטונים נוספים