ייצור של מעבר צבע Nanopattern על ידי טכניקת Nanoimprinting תרמית והקרנת התגובה של תאים אנושיים המושבה יוצרי אנדותל
1 ביולי 2018
כאן, אנו מציגים עבור הזיוף של צלחות nanopattern מעבר צבע באמצעות nanoimprinting תרמי ואת שיטת הקרנה התגובות של האדם ובתאים אנדותל nanostructures פרוטוקול. באמצעות הטכנולוגיה המתואר, זה אפשרי לייצר לפיגום שיכול להשפיע על התנהגות התא על ידי הגירויים הפיזיים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לייצר דפוסי שיפוע עם יכולת שחזור גבוהה ומאפשרת הקרנה של תגובת התאים למבני תצפית של טפילים. התגובה לגירוי פיזי עדיין לא התגלתה במלואה. אנו מאמינים כי השיטה שלנו תהיה כלי חיוני לחשיפת המנגנונים הלא ידועים הללו.
כדי להתחיל, חבר ז'קט כפולה המכילה את תמיסת האלקטרופוליש לסירקולטור והגדר את הטמפרטורה על שבע מעלות צלזיוס. השאירו את התמיסה תוך ערבוב למשך 30 דקות לפחות עד שהטמפרטורה יורדת לשבע מעלות צלזיוס. טבלו את לוחית האלומיניום הטהורה במיוחד ואת אלקטרודת הפחמן לתוך תמיסת האלקטרופוליש באמצעות קליפס תנין וחוטי נחושת.
התאם את מיקום לוחית האלומיניום באלקטרודת מונה הפחמן כך שתפנה זו לזו. חבר את לוחית האלומיניום למסוף החיובי וחבר את אלקטרודת מונה הפחמן למסוף השלילי של ספק כוח זרם ישר. לאחר הפעלת מתח של 20 וולט, לוחית האלומיניום עוברת ממשטח מחוספס חסר ברק למשטח דמוי מראה בצבע כסף.
כדי לבצע את האנודיזציה הראשונית, שפכו ליטר אחד של האלקטרוליט לכוס ז'קט כפול של שני ליטר. טבלו את לוחית האלומיניום המלוטשת ואלקטרודת הפחמן לתוך התמיסה בעזרת קליפס תנין בחוט נחושת. התקן פיר אנכי על כן בצורת U.
חבר מערבל תקורה ומאיץ באמצעות מתכת clamps. מקם את המדחף של האימפלר ליד הקצה התחתון של שתי האלקטרודות. הגדר את מהירות הסיבוב של הערבוב התקורה בין 200 ל-300 סל"ד והפעל מתח של 195 וולט תוך ערבוב למשך 16 שעות.
לאחר אנודיזציה ראשונית, צבע לוח האלומיניום משתנה מכסף לאפור. לביצוע גירוד אלומינה, טבלו את לוחית האלומיניום האנודייז בתמיסת התחריט. אטמו את החלק העליון של הכוס בנייר אלומיניום והניחו לערבב לפחות 10 שעות.
בשלב התחריט צבע לוח האלומיניום משתנה מאפור ללבן. עבור האנודיזציה המשנית, הגדר את אותם תנאי ניסוי כמו האנודיזציה הראשונית והפעל שוב מתח של 195 וולט למשך שש שעות. לאחר אנודיזציה משנית, צבע לוח האלומיניום משתנה מלבן לאפור.
כדי לבצע את הרחבת נקבוביות השיפוע, חבר תחילה את הז'קט הכפול המכילה תמיסת חומצה זרחתית לסירקולטור והגדר את הטמפרטורה על 30 מעלות צלזיוס. הנח שלב נע ליניארי אנכית ליד הכוס והצמד סוגר לחלק הנע של השלב הליניארי. הגדר את החלק הנע של השלב הליניארי למצב הבית.
חבר את התפס של התושבת וטען את לוחית האלומיניום האנודייז. תפעל את מיקום לוחית האלומיניום באופן ידני כך שלוחית האלומיניום תגיע ממש מעל פני התמיסה. טבלו בהדרגה את לוחית האלומיניום בתמיסה במהירות של ארבע נקודות שמונה שישה מיקרון לשנייה למשך 120 דקות ליצירת תבנית AAO בגודל 35 מילימטר עם שיפוע גודל מ-120 ננומטר ל-200 ננומטר
.הפעל שעון עצר ברגע שלוחית האלומיניום נוגעת במשטח התמיסה. לאחר שחלפו 100 דקות, מחצית מתבנית ה-AAO צריכה להיות בתמיסה. כדי להכין תבניות GP 200 עד 280 ו-GP 280 עד 360, טבל את כל השטח של תבנית GP 120 עד 200 בתמיסת הרחבת הנקבוביות למשך שעתיים עד ארבע שעות בהתאמה.
טבלו את תבנית ה-AAO ותמיסת הפיראנה למשך 30 שניות באמצעות פינצטה לא מתכתית. שוטפים את תבנית ה- AAO מספר פעמים במים נטולי יונים. משרים את התבנית במים נטולי יונים למשך 30 דקות ומכניסים לאלכוהול מתיל למשך 30 דקות נוספות.
ייבש לחלוטין את תבנית ה- AAO בוואקום למשך שלוש שעות. לתצהיר חד-שכבתי בהרכבה עצמית, טבלו את תבנית ה-AAO ב-57 מיליליטר של מסוננים והקסאן וכוס של 100 מיליליטר. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של תמיסת מלאי HDFS ל-N הקסאן כדי ליצור תמיסת HDFS של 2.9 מילי-מולרית והמתן 10 דקות עד שהתגובה תמשיך.
לאחר העברת תבנית ה-AAO לטרי והקסאן, השרה את תבנית ה-AAO ב-60 מיליליטר מתוקסי-נונאפלואורובוטן. נקה את תבנית ה-AAO באופן אולטרסאונד בכוס למשך 10 שניות בפעם אחת כדי להסיר מולקולות HDFS שנספגו פיזית. חזור על הליך הניקוי 10 פעמים לפני ייבוש תבנית ה-AAO בוואקום למשך 24 שעות.
חותכים יריעת פוליסטירן בעובי נקודה אחת של מילימטר אחד לגודל של שתי נקודות תשעה מילימטרים רוחב על שלוש נקודות שבעה מילימטרים אורך באמצעות חותך מעגלים מודפסים. בעבודה בחדר נקי, חותכים את תבנית ה- AAO 35 מילימטרים מהתחתית בעזרת ציפורן. סמן את השם לדוגמה ואת יצרן הנתונים מאחור.
נקו פרוסה בגודל שמונה נקודות אפס אינץ' עם המינון הקטן של אלכוהול אתילי, ולאחר מכן הניחו את יריעות הפוליסטירן על הוופל והרכיבו את תבנית ה-AAO. לאחר מכן, הכניסו את הסרט התחתון למגירה של מדפיס תרמי והצמידו את הסרט העליון לאטם, ואז הניחו את הוופל על הסרט התחתון והניחו את האטם על הוופל. וודאו שאין אבק על הוופל.
לאחר סגירת המגירה של התרמית והמדפסת מפעילים 165 מעלות צלזיוס של חום ולחץ של 620 נקודות חמש/שניים קילופסקל מ-100 שניות. לאחר מכן מצננים את הדגימה לטמפרטורת החדר. לאחר שהתקרר, אוורור את החדר והלחץ יירד לאפס קילו פסקל.
סובב בעדינות את יריעת הפוליסטירן כדי לשחרר את תבנית ה-AAO. אסוף 50 מיליליטר דם אנושי באמצעות צינור מעכב הפרין. הכניסו שישה מיליליטר של תמיסת פוליסכריד הידרופילית לצינור של 15 מיליליטר והוסיפו שמונה מיליליטר דם לתמיסת הפוליסכריד ההידרופילית.
יש לאסוף דם מיד ולהוסיף לאט לאט על גבי תמיסת הפוליסכריד ההידרופילית. לאחר צנטריפוגה של הצינור ב-1020 פעמים G למשך 20 דקות כדי לגלול את התאים, קצרו את שכבת התאים האטומה והעבירו לצינור חדש של 15 מיליליטר. ב-10 מיליליטר PBS המכיל 10% FBS בצנטריפוגה, הצינור ב-1020 כפול G למשך 10 דקות כדי לגלול את התאים.
הסר את הסופרנטנט והוסף מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות. לאחר דגירה על קרח במשך חמש דקות ב-PBS המכיל 10% FBS וצנטריפוגה את הצינור ב-1020 כפול G למשך חמש דקות כדי לגלול את התאים. הסר את הסופרנטנט והוסף מיליליטר אחד של מדיום הרחבת תאי אנדותל בתוספת 10% FBS.
זרע שמונה נקודות אפס מיליון תאים לבאר עבור כל מנה מקודדת קולגן. לגרום לתאים היוצרים מושבה אנושית ואתרית כמתואר בפרוטוקול הטקסט ולגדל את התאים למעבר שבע לניסויים נוספים. לאחר מכן, צפו את לוחות דפוס הננו השיפוע במיליליטר אחד של תמיסת ציפוי חלבון אפס נקודת אחוז אחד ב-PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הכינו השעיה של ECFCs אנושיים מצלחת התרבית בשיטת פיצול תאים סטנדרטית באמצעות טריפסין. לאחר דילול תרחיף התא כדי להשיג את המפגש הרצוי, זרע ה-ECFCs האנושיים מפסיקים על לוחות דפוס הננו השיפוע בבקרה שטוחה. תרבית את התאים על לוחות דפוס ננו שטוחים או שיפוע במשך יומיים בחממה.
תמונות אלה מציגות את תבניות ה-AAO המיוצרות בשלושה תנאי הרחבת יציקה שונים. צד אחד עם הזמן הקצר ביותר שקוע בתמיסת תחריט חומצה זרחתית הוא בעל גודל הנקבוביות הקטן ביותר, ואילו הצד השני בעל הזמן הארוך ביותר בתמיסת התחריט הוא בעל גודל הנקבוביות הגדול ביותר. מכיוון שתבנית הננו הועברה לפוליסטירן בשיטת ההטבעה התרמית, נוצרים מבני עמודי ננו על פני הפוליסטירן ושיפוע הגודל של תבנית AAO נשמר בלוחות דפוס ננו.
ה-ECFCs האנושיים המשולבים הראו אבן מרוצפת טיפוסית כמו מורפולוגיה של מושבה שניתן להבחין בה בקלות במיקרוסקופ ניגוד פאזה. לאחר יומיים של גידול ECFCs אנושיים על השטוח בלוחות דפוס ננו שיפוע, נצפתה צמיחה משמעותית של פילופודיה בתאים שגודלו ב-GP 120 עד 200. לעומת זאת, לא נצפה שינוי יוצא דופן ב-GP 200 ל-280 או GP 280 ל-360 בהשוואה לבקרה השטוחה.
תוצאה זו מצביעה על כך שתגובת התאים שונה בהתאם לגודל מבנה הננו של פני השטח. ישנם שלבים רבים לייצור צלחת דפוס ננו. אז זה יכול להיות מסובך בהתחלה, אבל ברגע שתשלוט, תקבל דפוסים עם שיפוע גודל רצונות ללא כל קשיים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לך הבנה רבה כיצד לייצר לוחות דפוס ננו שיפוע ואת הטיפוח לסדרות יוצרות מושבות אנושיות ומטופשות יותר על צלחת דפוס הננו. כמו כן, שיטה זו זמינה לסוגים שונים של סדרות. שיטה זו יכולה לספק גשר בין הנדסת חומרים לביוטכנולוגיה שיסייע בהבנת הזרקות התאים וטופוגרפיית ננו פני השטח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור פלטות עם תבניות ננויות בעלות מדרג באמצעות הדפסה ננוית תרמית (thermal nanoimprinting) ובדיקת התגובות של תאי פרוגניטור אנדותליאליים אנושיים למבנים ננויים אלו. טכניקה זו מאפשרת ייצור של פיגומים שיכולים להשפיע על התנהגות תאים באמצעות גירויים פיזיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ננוטכנולוגיה
רקע
- ניתן להפיק דפוסי מדרג (Gradient) עם הדירות גבוהה.
- התגובה של תאים לגירויים פיזיקליים אינה מובנת באופן מלא.
- שיטה זו שואפת לחשוף מנגנונים לא ידועים של התנהגות תאים.
- פוליש אלקטרוליטי (Electropolishing) הוא שלב מפתח בתהליך הייצור.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה ליצירת דפוסי ננו-גרדיאנט (gradient nanopatterns).
- בדיקת האופן שבו תאי פרוגניטור אנדותליאליים אנושיים מגיבים לדפוסים אלו.
- בחינת ההשפעות של גירויים פיזיים על התנהגות התאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדפסה ננו-חום (Thermal nanoimprinting) ליצור פלטות בעלות תבניות ננומטריות.
- פוליש חשמלי (Electropolishing) של פלטות אלומיניום בתמיסה מבוקרת.
- סריקת תגובות תאים למבני הננו שיוצרו.
- בקרת טמפרטורה במהלך תהליך הפוליש החשמלי.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של תבניות ננו-מדורגות.
- הושגה רמת שחזור גבוהה של התבניות.
- תצפיות ראשוניות על תגובות תאים לגירויים פיזיקליים.
- פוטנציאל לחשיפת מנגנונים חדשים בהתנהגות תאים.
מסקנות
- השיטה שפותחה מהווה כלי בעל ערך למחקר במדעי העצבים.
- נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין באופן מלא את תגובות התאים.
- גישה זו עשויה להוביל להתקדמות ברפואה רגנרטיבית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ייצור הדיר של פלטות עם דפוסי ננו-מדרג (gradient nanopattern plates) לצורך סריקת תגובות תאיות לטופוגרפיות ננו מוגדרות, ובכך הוא נותן מענה לפער מרכזי בסריקת חומרים ביומטריים עבור הנדסת רקמות כלי דם. על ידי קישור מדרגי גודל של ננו-עמודים (nanopillars) להתנהגות של תאי מושבה אנדותליאליים (endothelial colony-forming cells), השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי תיקוף היעד המוקדמים עבור טיפולים אנגיוגניים. גישה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה וכלכלית לסריקה פנוטיפית של מסלולים רגישים למכניקה בתאי פרוגניטור אנושיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון כיצד מדרגי גודל של ננו-עמודים (nanopillars) משפיעים על צמיחת פילופודיה של תאים אנדותליים יוצרי מושבות, ובכך תומך בבדיקת היפותזות הנוגעות למסלולי העברה מכנית (mechanotransduction).
- ערך תפעולי: מספק כלי סריקה סטנדרטי מבוסס-מדרג להפחתת סיכונים של מטרות על ידי קורלציה בין ננו-טופוגרפיה לבין פנוטיפים תאיים תפקודיים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יצירת מערכי ננו-תבניות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית (GP 120/200, GP 200/280, GP 280/360) לצורך סריקה דמוית תגובה למינון של הידבקות ותבנית תאים.
- ערך תפעולי: אספקת פלטות ננו-תבניות מבוססות פוליסטירן הניתנות לשחזור ומותאמות לזרימות עבודה סטנדרטיות של תרביות תאים, המאפשרות יישום של בדיקות במבנה הניתן להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שימוש בתאים אנדותליאליים יוצרי מושבות אנושיים — סוג של תאי פרוגניטור בעלי רלוונטיות קלינית — להערכת השפעות של ננו-טופוגרפיה, מה שמעלה את הרלוונטיות התרגומית (translational) לאסטרטגיות של רגנרציה וסקולרית.
- ערך תפעולי: תמיכה ברצף פרה-קליני באמצעות אספקת שלב מוגדר לסריקת ביו-מטריאלים לפני תיקוף in vivo של פוטנציאל אנגיוגני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מיצירת היפותזת המטרה, דרך סריקה פנוטיפית ועד לאישור פרה-קלני, ובאופן ספציפי מאפשרת סריקת תאי מקור אנדותליים לצורך אישור מטרות אנגיוגניות.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד הננו-טופוגרפיה כמשתנה בלתי תלוי לבחינת השפעתה על התנהגותם של תאי endothelial colony-forming.
- סריקה: מייצרת פלטות עם תבניות ננו-מדורגות המאפשרות הערכה כמותית וסטנדרטית של תגובות תאיות על פני טווחים מוגדרים של גדלי ננו-עמודים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני קריאה מורפולוגיים (למשל, צמיחת filopodia) המאפשרים השוואה בין תגובות תאיות לתבניות ננו-מדורגות לעומת ביקורות שטוחות.
- מחקר תרגומי: משתמשת בתאי endothelial colony-forming אנושיים כדי לגשר בין סריקת תבניות ננו למודלים פרה-קליניים של רגנרציה וסקולרית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לייצור תבניות ננו, שניתן להחילה על סוגי תאים מרובים ועל קמפיינים של סריקת מכנו-ביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי קישור ננו-טופוגרפיה מוגדרת לתגובות פנוטיפיות של תאי פרוגניטור אנדותליאליים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור של הבדיקה באמצעות שלבי ננו-הטבעה תרמית מבוקרים ביותר והרחבת נקבים מדורגת.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) בבחירת מטרות אנגיוגניות על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין תאים לחומרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות מותאם לסיכון על בסיס פנוטיפים אנדותליאליים המגיבים לננו-טופוגרפיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור ננו-חומרים, אלקטרוכימיה וטכניקות הטבעה תרמית.
- תלוי במכשור ייעודי הכולל צירקולטורים, בוחשים עיליים (overhead stirrers), מכשירי הטבעה תרמית ומערכות ייבוש בוואקום.
- מחייב תנאי חדר נקי לחיתוך פוליסטירן ולטיפול בתבניות AAO כדי למנוע זיהום.
- כולל שלבי ייצור הנפרסים על פני מספר ימים (ליטוש אלקטרוכימי, אנודיזציה, תסריט/חריטה, הטבעה) הדורשים סטנדרטיזציה קפדנית של התהליך.
- התאמה לסוגי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של תנאי הציפוי והתרבית תוך שמירה על דיוק הננו-תבנית.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Preparation of Aluminum (Al) Substrate by Electropolishing
1:34
Fabrication of Gradient Anodic Aluminum Oxide (AAO) Mold with Phosphoric Acid Electrolyte
4:28
Deposition of Anti-Sticking Layer on Gradient AAO Mold with Self-Assembled Monolayer
5:46
Fabrication of Gradient Nanopattern Plates by Thermal Imprinting
7:08
Cultivation of hECFCs and Culture on the Gradient Nanopattern Plates
9:14
Results: Evaluation and Analysis of Culturing hECFCs on Fabricated Gradient Nanopattern Plates
10:37
Conclusion
