מערך Glycan המודפס: טכניקה רגישה לניתוח של הרפרטואר של מחזורי נוגדנים אנטי-פחמימות בבעלי חיים קטנים

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את הפרופיל של נוגדנים אנטי-גליקנים במחזור בסרום של בעלי חיים קטנים באמצעות מערך גליקן מודפס המבוסס על טכנולוגיה. לגישה זו יש פוטנציאל באבחון המוקדם והטיפול הנכון בתנאים פתולוגיים מסוימים שבהם נוגדנים נגד מבנים גליקניים ממלאים תפקיד חשוב. היתרון העיקרי עם טכניקה זו, הוא האפשרות למדוד באותה הגדרה ניסיונית מאות מטרות גליצן עם רגישות גבוהה מאוד באמצעות כמות מינימלית של מדגם.

כדי להכין את מערך המיקרו, השתמש במערכ רובוטי ללא מגע. מדפיס שישה שכפולים של 50 גליקנים מילימולריים ו-10 מיקרוגרם לפוליסכרידים מיליליטר ו-300 מילימולרים PBS, pH 8.5 על n-הידרוקסי 6 שקופיות זכוכית נגזרות cinnamic. כל שקופית מכילה ארבעה בלוקים שונים של תת-סדרים שחוזרים על עצמם שש פעמים.

כל תת-סדר נוצר על ידי 112 כתמי גליקנים שונים כולל פקדים. הדגירה את המגלשות בתיבת לחות בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. כדי לחסום את מערכי המיקרו, הדגירה את השקופיות למשך שעה וחצי עם חוצץ חסימה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן לשטוף את שבב גליקול עם מים טהורים במיוחד ולייבש אותו באוויר. הכן את המאגר 1 עד מאגר 4 כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין את שבבי גליקול ודגימות, לשים את תיבת האחסון עם השקופיות על השולחן עד שהם מגיעים לטמפרטורת החדר.

פתח את התיבה ולהעביר את שבב גליקול לתוך תא הדגירה אשר צריך להיות כבר מותנה עם נייר מסנן רטוב כדי לשמור על קבוע הלחות בתוך התא. בינתיים, לדלל את סרום העכברים עם חיץ אחד בצינורות 1.5 מיליליטר. הומוגניזציה של תספורת הסרום לחמש שניות עם מערבל מערבולת.

לאחר ההומוגניזציה, הדגירה את הסרום מדולל ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות באמבט מים, כדי למנוע צבירה אימונוגלובולין. ואז צנטריפוגה הצינורות במשך שלוש דקות ב 10, 000 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant ולהשליך כל חומר זירז.

מניחים את שבב הגליקול בזהירות בתא הדגירה. דגירה זה עם מיליליטר אחד של חיץ שלוש כדי לחסל כל חומר שיורית על פני השטח של שבב גליקול. במשך 15 דקות, ב 25 מעלות צלזיוס.

החזק את שבב הגליקול במצב אנכי, ושטיפתו מחדש עם כמה טיפות של חיץ שלוש באמצעות פיפטה פסטור פלסטיק. לאחר מכן, הסר בזהירות את המאגר מפני השטח של שבב הגליקול באמצעות נייר סינון. מניחים את שבב הגליקול בחזרה לתא הדגירה.

מורחים את דגימת הסרום המדוללת על משטח שבב הגליקול באמצעות מיקרו פיפטה. ודא כי כל האזורים היבשים של משטח שבב גליקול מכוסים על ידי מדגם סרום מדולל באמצעות קצה פיפטה. דגירה עם תסיסה מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 1/2 שעות.

לאחר הדגירה, להסיר כל מדגם עודף לטבול את שבב גליקול במשך חמש דקות במאגר שלוש ב 25 מעלות צלזיוס. מעבירים את שבב הגליקול למיכל עם חיץ 4 ולבסוף שוטפים את שבב הגליקול במים טהורים במיוחד. צנטריפוגה שבב גליקול במשך דקה אחת ב 175 פעמים G ו 25 מעלות צלזיוס כדי להסיר את הנוזל.

לאחר הנחת שבב הגליקול בחזרה לתא הדגירה, להפיץ פתרון של עז נגד עכבר נדנוד ביוטין על פני השטח שבב גליקול. דגירה עם תסיסה מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הסר את השבר הלא מאוגד וחזור על שלבי הכביסה.

לאחר הצנטריפוגה, הדגירה שבב גליקול בחושך ב 25 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם שני מיקרוגרם למיליליטר של פתרון סטרפטוודין פלואורוכרום המקביל במאגר 2. לאחר עבודה בחשיכה כדי להסיר את השבר הלא מאוגד ולחזור על מדרגות הכביסה, לייבש את שבב גליקול באוויר. כדי לסרוק את המערך, להשאיר את שבב גליקול על השולחן עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר בחושך.

במקביל, הפעל את סורק השקופיות ואת הלייזר. מחזיק את מערך המיקרו, להחליק את שבב גליקול לתוך החריץ עד שהוא נוגע בגב. סרוק את שבב הגליקול על-ידי הפעלת EasyScan ושמור את הסריקה כקובץ tif.

כימת את המערך באמצעות מערכת ניתוח ScanArray. פתח את התמונות שנסרקו בעבר על-ידי לחיצה על קובץ בקבוצת התצורה והקובץ בחלון הראשי. טען את תבנית קובץ המערך המתאימה בתבנית GAL המייצגת את פריסת הגליקנים המודפסים בשקופית הזכוכית.

התאם את תבנית GAL על-ידי יישור זהיר של המערך עם הנקודות בתמונה והתחלת כימות. בחר את היקפי הכימות כסוג כימות להפעיל קל כימות ושיטת כימות מעגל קבוע. שחרר את כל האפשרויות עבור נקודות חיפוש אוטומטי ובחר lowess עבור שיטת הנורמליזציה.

שמור את הנתונים לכמת כקובץ csv. העבר נתונים אלה לקובץ גיליון אלקטרוני משותף באמצעות Microsoft Excel או יישום מתאים אחר. עכברים זהים גנטית לא צריך להיחשב מקבילות אימונולוגיות כי הם פיתחו דפוסים שונים של נוגדנים אנטי פחמימות טבעיות.

כפי שמוצג כאן, רק 12 ספציפיות גליקנים היו שמורים. מוצג כאן, הוא דוגמה מייצגת של התמונות המתקבלות סריקת שבבי מיקרו באמצעות סורק פלורסנט. לאחר מכן, הרשת מיושרת לנקודות בכל מערך משנה יחיד.

פלורסנט מזוהה עבור כל נקודה והתוצאות מועברות לקובץ גיליון אלקטרוני משותף. לאחר הדגירה עם סרום העכבר, שבבי הגליקו נסרקו באמצעות קורא מערך סריקה. הנתונים נותחו באמצעות מערכת ניתוח מיקרו מערך והתוצאות באו לידי ביטוי ב- RFU כחציון פלוס של מינוס הסטייה המוחלטת החציונית.

צבעי כחול-לבן מייצגים אותות איגוד ברקע של פחות מ- 4000 RFU. צבע אדום מייצג אותות איגוד חיוביים הגדולים או שווים ל- 4000 RFU. רוב המבנים הגליקנים שנחשפו בשבבי הגליקול לא זוהו על ידי הרפרטואר של נוגדנים אנטי גליקאניים במחזור של עכברי BALP C.

לאחר השליטה בטכניקה זו ניתן לעשות בחמש שעות ו 45 דקות אם זה מבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להשתמש בטכנולוגיית מערך גליקון מדפסת כדי לחקור את הרפרטואר ואת רמות הנוגדנים נגד פחמימות במחזור בדגימות סרום. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי שבב גליקו חייב להיות מניפולציה על ידי חלק תחתון של אור המשקפיים.

היכן שהברקוד ממוקם. כדי להימנע ממגע עם הגליקנים המודפסים. כמו כן, ודא כי כל האזור היבש של שבב גליקו מכוסה על ידי מדגם סרום מדולל באמצעות קצה פיפטה.

הנפח הדרוש כדי לכסות לחלוטין משטח אחד של שבב גליקו הוא כמיליליטר. בעקבות הליך זה, ניתן לעשות שיטות אחרות כמו מערך השעיית בסיס מיקרוספרה על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לגילוי מולטיפלקס גמיש של פרופיל נוגדנים אנטי גליקנים. לאחר השקתה טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מולקולות הביומקראלים והאימונולוגיה לחקור אינטראקציה לא חלבון גליקול בקבוצה של בעלי חיים קטנים.