זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

המטרה הכוללת של בדיקת קינאז במבחנה זו היא לזהות אתרי זרחון בחלבון מעניין הספציפיים לקינאז 1 התלוי בקינאז ציקלין. הזיהוי של אתרי זרחון ספציפיים ל-CDK1 חשוב מכיוון שהם מספקים תובנות מכניסטיות לגבי האופן שבו CDK1 שולט במחזור התא. ויסות מחזור התא הוא קריטי להפרדת כרומוזומים מלאה בשלב ופגמים מובילים לסטיות כרומוזומליות ולסרטן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסתמכת על חלבונים מטוהרים ולכן ניתן ליישם אותה על כל אורגניזם מודל ומניבה תוצאות אמינות, במיוחד בשילוב עם מחקרים פונקציונליים בתאים. שיטה זו חשובה מכיוון שהמספר הידוע של מטרות CDK1 עדיין נמוך, למרות העובדה ש-CDK1 מזרחן כ-8 עד 13% מהפרוטאום. למרות ששיטה זו מזהה אתרי זרחון ספציפיים ל-CDK1, ניתן לשנות אותה כדי לזהות אתרי זרחון עבור קינאזות אחרות בתנאי שהקינאז המטוהר זמין.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לייעל את התנאים לבדיקת הקינאז עבור כל יעד חלבון כדי להשיג יעילות זרחון גבוהה. רצוי 100%השתמש בתוכנת IGPS 3.0 ובקר בשרת האינטרנט כדי לחזות את אתרי הזרחן הספציפיים ל-CDK1 ברצף חלבון המטרה CENP-F. בדוק את אתרי הזרחן מול רצף הקונצנזוס של CDK1.

התחל את ביטוי החלבון על ידי הכנת תרבית מוקדמת. בהתאם להוראות היצרן, הפוך מיקרוליטר אחד של פלסמיד הביטוי ל-50 מיקרוליטר של תאים מוכשרים E.coli. לאחר הוספת הפלסמיד, דגרו את התאים על הקרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן דגרו על התאים למשך 45 שניות בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הניחו את התאים על קרח למשך דקה אחת ואז הוסיפו 400 מיקרוליטר של LB לתאים, ואז דגרו את התרבית למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול. לאחר מכן צלחת 200 מיקרוליטר של התרבית על צלחות אגר LB, בתוספת האנטיביוטיקה המעניינת, בהתאם למבנה.

לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 20 שעות מבלי לרעוד. לאחר מכן בחרו מושבה מצלחת האגר LB וחיסנו את המושבה ב-50 מיליליטר של מדיום LB בתוספת השילוב האנטיביוטי הרצוי. דגרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור במהירות של 160 עד 180 סיבובים לדקה למשך 12 עד 20 שעות.

עבור כל ליטר מדיום LB הוסף את האנטיביוטיקה ו -10 מיליליטר של 40% משקל בנפח של תמיסת גלוקוז מסוננת סטרילית. למדיום זה מוסיפים 20 מיליליטר מהתרבות המוקדמת שגדלה בצפיפות. לאחר מכן דגרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול במהירות של 160 עד 180 סיבובים לדקה.

בדוק את ספיגת התרבית ב-600 ננומטר במרווחי זמן קבועים. ברגע שהספיגה מגיעה ל-0.5 עד 0.6, יש לגרום לביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG של 0.2 מילי-מולרי. לאחר מכן דגרו על התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות תוך כדי ניעור.

לאחר שלוש שעות קוצרים את התאים על ידי צנטריפוגה ב -4, 100 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, באמצעות רוטור מתנדנד החוצה. לאחר הצנטריפוגה, גרש את הסופרנטנט. השעו מחדש את כדור התא ב-20 מיליליטר של מאגר קשירת GST עבור CENP-F ואת מאגר הקישור שלו עבור karyopherin alpha עבור כל ליטר תרבית.

לאחר מכן אחסן את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לטהר את CENP-F, תחילה יש להפשיר את התאים עם מבנה CENP-F. לאחר מכן כוונן את עוצמת הקול ל -20 מיליליטר עם מאגר מחייב GST.

לאחר התאמת הנפח, הוסף את כל המפחיתים ומעכבי הפרוטאז בזה אחר זה כדי להכין את תרחיף התאים לליזה שלאחר מכן. לאחר מכן, העבירו את מתלה התאים בכוס זכוכית וטבלו את הכוס באמבט מי קרח. ואז סוניקציה של התרבות.

לאחר סוניקציה הוסף 250 PMSF מיקרו-מולרי לליזאט, ואז בדוק את הליזאט, שאמור להיות שקוף בשלב זה. לאחר מכן צנטריפוגה את הליזאט ב 12, 000 עד 40, 000 פעמים G למשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את העמודה על ידי הוספת שני מיליליטר של גלוטתיון אגרוז אחד לאחד לעמודת כרומטוגרפיה חד פעמית.

כדי לאזן את העמוד, שטפו אותו תחילה עם 25 מיליליטר מים טהורים במיוחד ולאחר מכן 25 מיליליטר של מאגר מחייב GST. לאחר סיום הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ואז סננו את הסופרנטנט דרך גודל מזיגה של 0.2 מיקרומטר. לאחר מכן, שפכו את הליזאט על העמוד המחובר לשלב הכריכה.

מכסים את העמוד ומדגרים אותו בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תוך כדי אגוזים עדינים והימנעו מקצף. לאחר 30 דקות העבירו את העמוד על מתלה ותנו לשרף להתייצב. לאחר מכן אסוף את הזרימה ושטוף את העמוד פעמיים עם 25 מיליליטר של מאגר מחייב GST.

לאחר השלמת הכביסה, חבר שוב את העמודה. לאחר מכן הוסף לעמודה 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב GST ו-250 מיקרוליטר של מלאי פרוטאז PS עם פעילות של 1000 יחידות למיליגרם. שוב מכסה את העמוד וסובב את העמוד בעדינות כדי להשעות מחדש את השרף במאגר, ואז דגר את העמוד בארבע מעלות צלזיוס למשך 16 עד 20 שעות.

לאחר סיום תקופת הדגירה, הוסף ארבעה מיליליטר של מאגר מחייב GST כדי לחסל את שבר ה-CENP-F מהעמודה שנבקעה באופן פרוטאוליטי. לאחר מכן להעלים את תג ה- GST חבר שוב את העמודה. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של מאגר פליטת GST המכיל גלוטתיון לעמודה.

לאחר מכן דגרו את העמודה למשך 10 דקות כדי להסיר את תג ה-GST המאוגד. לאחר 10 דקות אוספים את האלואט. לאחר מכן בצע אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד SDS כדי לנתח את שברי הפליטה של פרוטאז PS וגלוטתיון.

לאחר מכן כדי לרכז את דגימת החלבון, פיפטה את פרוטאז ה-PS נפלט לתא העליון של יחידת מסנן צנטריפוגלית עם חתך משקל מולקולרי של שלושה קילודלטון. לאחר מכן צנטריפוגה את הפליטה ב-4, 100 פעמים G במרווחים של 10 עד 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ברוטור מתנדנד החוצה, כדי לרכז את הדגימה. לאחר כל תוספת מערבבים את דגימת החלבון במסנן הריכוז על ידי פיפטינג בעדינות למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות שיפוע ריכוז.

כדי לטהר את CENP-F על ידי סינון ג'ל, חבר עמוד סינון ג'ל למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבונית מהירה. לאחר מכן, אזנו את העמודה עם נפח עמודה אחד של מאגר סינון ג'ל. לאחר מכן צנטריפוגה את שבר ה-CENP-F בצינור מיקרו-צנטריפוגה ב-21, 700 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר סיום הצנטריפוגה, הזרקו את הדגימה על העמודה, ואז השליכו את העמודה עם מאגר סינון ג'ל ואספו שברים של 0.6 מיליליטר משבר ה-CENP-F. לאחר מכן נתח את פרופיל סינון הג'ל והפעל SDS-PAGE של שברי השיא. שברי מאגר המכילים CENP-F טהור.

לאחר מכן רכז את שבר ה- CENP-F המטוהר ל -3.3 מיליגרם למיליליטר. כדי לקבוע את ריכוז החלבון יש לדלל את שבר ה- CENP-F ביחס של אחד ל -100 עם מים טהורים במיוחד. לאחר מכן רשום את הספקטרום מאורך גל של 220 עד 300 ננומטר בספקרופוטומטר.

לאחר מכן, הכינו כמויות של 50 מיקרוליטר של ה-CENP-F המטוהר במיקרו-צינורות של 0.5 מיליליטר, ולאחר מכן הקפיאו את הצינורות בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס. לבדיקת הקינאז מערבבים את שבר ה-CENP-F עם ATP ו-CDK1 ציקלין B יחד עם מאגרים אחרים במיקרו-צינור של 0.5 מיליליטר. לאחר מכן הכינו דגימה שנייה ללא CDK1 ציקלין B כבקרה שלילית.

לאחר מכן דגרו את הדגימות באמבט מים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה עד 16 שעות. לזיהוי מוצלח של אתרי הזרחן על ידי ספקטרומטריית מסה, קריטי שיעילות הזרחן תהיה גבוהה ככל האפשר, רצוי 100%כדי להגביר את יעילות הזרחן הוסף עוד קינאז ולהגדיל את זמן הדגירה ל-16 שעות. לאחר מכן הוסף נפחים שווים של תמיסת גואנידין הידרוכלוריד שש טוחנת לתגובת בדיקת הקינאז הנותרת ולבקרה השלילית ובצע ספקטרומטריית מסה כדי לזהות את אתר הזרחון.

כדי להשיג נתוני ספקטרומטריית מסה באיכות גבוהה, חשוב גם שדגימת החלבון המטוהר תהיה טהורה והומוגנית ביותר. ניתוח SDS-PAGE הראשון נעשה המראה תזוזה ברורה כלפי מעלה של הרצועה על הג'ל עבור ה-CENP-F הזרחני בהשוואה לבקרה השלילית ללא CDK1, מה שמצביע על כך שה-cNLS של CENP-F הוא מצע CDK1. ספקטרומטריית המסה הבאה נעשית כדי לנתח את המספר והיעילות של אתרי הזרחן של CENP-F.

ספקטרום המסה של מלכודת היונים ESI של ה-CENP-F הזרחני השלם במבחנה מראה שישנן חמש פסגות, המצביעות על ארבעה אתרי זרחון והשיא החמישי הוא החלבון הלא זרחני. לאחר מכן, פרופיל פליטת אי הכללה בגודל זה מראה כי נפח הפליטה של שיא האלפא של קריופרין עובר למסה גבוהה יותר עם הוספת הסוג הפראי CENP-F, שאינו נצפה בהוספת המוטציה CENP-F. זה מצביע על כך שהגרסה הפוספומימטית S3048D של CENP-F אכן מחלישה את האינטראקציה של CENP-F cNLS עם קריופרין אלפא.

לבסוף, ניתוח SDS-PAGE שנעשה מראה כי מקטע CENP-F מסוג פרא עם cNLS שלם מתחבר לקריופרין אלפא, מה שמעיד על אינטראקציה חזקה. עם זאת, המוטציה S3048D של CENP-F ו-karyopherin alpha מתפוגגת בפסגות נפרדות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבדוק את אתרי הזרחן המתקבלים מול רצף הזרחן הקונצנזוס של CDK1 ולוודא שהמצע המזוהה ממוקם באותו תא סלולרי כמו CDK1.

לאחר הליך זה יש לבצע אימות תפקודי בתאים או במודלים של בעלי חיים על מנת לאשר שלאתרי הזרחן שזוהו יש פונקציה פיזיולוגית. קיימים מספר כלים לאימות תפקודי כגון מעכבי CDK1 ספציפיים ומוטציות פוספומיות. בשל המספר הגדול של מצעי CDK1 בפרוטאום, עדיין יש לגלות מצעי CDK1 אנושיים רבים ובדיקת קינאז במבחנה תהיה כלי חשוב לזיהוי, מיפוי ואימות אתרים אלה.

זיהוי אתרי זרחון אלה מאפשר מחקרים מכניסטיים על האופן שבו CDK1 שולט במחזור התא. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות אתרי זרחון ספציפיים של CDK1 וחלבוני מטרה על ידי בדיקת קינאז במבחנה.