לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת הרבייה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של דצידואליזציה, והבנת התפקידים של גנים ספציפיים בדצידואליזציה של תאי סטרומה של רירית הרחם. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד תאי סטרומה של רירית הרחם האנושית ודיציואליזציה מלאכותית לאחר מכן על ידי הוספת הורמונים למצע התרבית. ניתן להשתמש בביטוי של שינוי הורמונלי, כגון פרולקטין וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין כדי לאשר ולכמת את מידת הדצידואליזציה.

חשוב לציין, הכדאיות של פרוטוקול זה לבצע נוקדאון ספציפי לגנים מודגמת גם היא. העבירו את הביופסיה עם מלקחיים מעוקרים לתוך שפופרת של 50 מיליליטר המכילה עשרה מיליליטר HBSF טרי, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-500x G למשך 90 שניות. בעזרת פיפטה של מ"ל אחד, הסר את המדיה והוסף שלושה מ"ל מדיית בידוד hES מחוממת מראש.

שפכו את הביופסיה לתוך צלחת של 10 ס"מ המכילה חמישה מ"ל של חומר בידוד hES, והתחילו לקצוץ בעזרת מלקחיים של Dumont 5 ומספריים עדינים עם תפרים ישרים למשך כ-20 דקות. בעזרת פיפטה אחת של מ"ל, העבירו את הביופסיה הקצוצה לתוך צינור חדש של 50 מ"ל, והוסיפו עוד שבעה מ"ל של אמצעי בידוד hES לצלחת, כדי להעביר את החלקים הנותרים לצינור של 50 מ"ל. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה למשך שתי דקות ב-800x G, והסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של מ"ל אחד.

לאחר מכן, מסננים את תערובת העיכול של DNase-1 וקולגנאז דרך מסנן של 0.2 מיקרון המחובר למזרק של 10 מיליליטר ישירות על הגלולה. לאחר מכן מערבל את הצינור למשך 10 שניות כדי להשעות מחדש את הגלולה, ודגירה למשך 90 דקות באמבט מים. לאחר כל 10 דקות, מערבל את הצינור למשך 10 שניות כדי לוודא שהרקמה מתעכלת כראוי.

לאחר הדגירה, סנן את התרחיף דרך מסננת תאים של 40 מיקרון שנערמה על צינור חדש של 50 מיליליטר כדי לשחזר את תאי הסטרומה, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-800x G למשך 2.5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, והקפד לא להפריע לכדורית התא. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של אמצעי בידוד hES טריים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-800x G למשך 2.5 דקות.

לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט בזהירות, והשעו מחדש את התאים בשישה מיליליטר מדיה hES טרייה. לאחר מכן, כדי להסיר תאי דם, שכבו לאט תאים תלויים על שלושה מיליליטר של מדיה שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה את הדגימה ב-400x G למשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה, אסוף את הסופרנטנט מבלי להפריע למדיית שיפוע הצפיפות.

לאחר מכן הוסף מדיית hES כדי להגדיל את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר, וצנטריפוגה שוב את הדגימה ב-800x G למשך 2.5 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בשישה מיליליטר של מדיה hES. לאחר מכן צלחת את התאים בבקבוק של 75 סנטימטר על ידי הוספת שישה מיליליטר של מתלה התא ו -10 מיליליטר של מדיה hES לבקבוק, ולאחר מכן ערבוב עדין באמצעות נדנוד הבקבוק

לאחר הציפוי, בדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ, ולאחר מכן תרבית את התאים באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% למשך שלושה עד חמישה ימים, והקפד להחליף את מדיית ה-hES כל יומיים. לאחר 48 שעות, התאים צריכים לגדול כשכבה אחת. בדרך כלל לאחר חמישה ימים, התאים משיגים מפגש של 80 עד 90% בבקבוק של 75 סנטימטר.

עבור טרנספקציה של siRNA, התחל בציפוי של 800,000 תאים לבאר בצלחת של שש בארות בשלוש פעמים לכל מצב, ודגר את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% למשך יומיים כדי להתכונן לטרנספקציה. לאחר יומיים, הוסף 150 מיקרוליטר של חומר חופשי בסרום Opti-MEM בשפופרת של חמישה מ"ל, ולאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה. מערבבים היטב על ידי היפוך, ודוגרים במשך חמש דקות.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום Opti-MEM בשפופרת חדשה של חמישה מ"ל, ואחריה תוספת של 16 ננומול של SRC-2 siRNA. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום Opti-MEM בשפופרת של חמישה מ"ל, ולאחר מכן תוספת של 16 ננומול בקרת siRNA. לאחר הדגירה, שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם SRC-2 siRNA וערבב היטב על ידי פיפטינג קדימה ואחורה.

לאחר מכן שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם ה-siRNA הבקרה וערבב היטב על ידי פיפטינג קדימה ואחורה. ואז דגרו על המתחמים למשך חמש דקות. במהלך הדגירה הזו, שאפו החוצה את מדיית ה-hES, והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית שינוי לכל באר.

לאחר חמש דקות של דגירה, צנטריפוגה את הקומפלקסים ב-500x G למשך שתי דקות כדי לאסוף את התמיסה. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של קומפלקסים של ריאגנטים של טרנספקציה siRNA לכל באר המכילה תאים ומדיה, וערבבו על ידי נדנוד עדין, ולאחר מכן דגירה באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% למשך חמש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש שעות, שאפו את המדיה והחליפו למדיה hES, והמשיכו בדגירה במשך יומיים כהכנה לבדיקת דצידואליזציה במבחנה.

לאחר טרנספקציה של 48 שעות ולפני התחלת בדיקת הדצידואליזציה במבחנה, אסוף את היום אפס בקרת siRNA ותאי SRC-2 siRNA שעברו טרנספטציה. ראשית, שאפו את המדיה ושטפו עם מ"ל PBS אחד לכל באר. לאחר מכן הסר את ה- PBS, והוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה RNA לבאר ודגירה למשך שלוש דקות.

לאחר שלוש דקות של דגירה, אסוף את התאים במאגר ליזה של RNA לתוך צינור של 1.5 מ"ל לניתוח מאוחר יותר במורד הזרם. לאחר מכן הכינו את מדיית ה-EPC על ידי ציטוט הנפח המתאים של אמצעי הדצידואליזציה, והוסיפו 10 אסטרדיול ננו-מולרי, מדרוקסיפרוגסטרון אצטט מיקרו-מולרי אחד, ו-50 אדנוזין מונופוספט מחזורי מיקרו-מולרי בשפופרת של 50 מיליליטר. עבור בארות היום השישי הנותרות, הוסף שני מיליליטר של מדיה EPC לכל באר, ודגר את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% ב-37 מעלות צלזיוס למשך שישה ימים, והחלף את מדיית ה-EPC כל 48 שעות.

לאחר היום השישי, אסוף את היום השישי של siRNA הבקרה והיום השישי SRC-2 siRNA שהועבר כדורי תאים במאגר ליזה RNA לניתוח במורד הזרם באמצעות PCR בזמן אמת. השראת הדצידואליזציה על ידי אסטרוגן מדרוקסיפרוגסטרון אצטט ואדנוזין מונופוספט מחזורי, מביאה לסידור מחדש של השלד הציטו של תאי סטרומה מתאים פיברובלסטיים מוארכים לתאי אפיתל מעוגלים. צביעת פלואידין של תאי סטרומה של רירית הרחם חושפת עוד יותר את הארגון מחדש של שלד הסיבים הפעילים האופייני לדצידואליזציה של hES.

ב-hES שטופלו ברכב, התאים נשארים פיברובלסטיים במראה, ואילו בתאים שטופלו ב-EPC, hES נראה כמו אפיתלואיד. כדי לאשר את היעילות של בדיקת הדצידואליזציה במבחנה, רמות תעתיק mRNA של סמני דצידואליזציה פרולקטין וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין-1 הוערכו במשך תקופה של 6 ימים. עם דצידואליזציה של תאי סטרומה של רירית הרחם האנושית, רמות הפרולקטין וה-IGFBP1 עלו באופן תלוי זמן.

העלייה תלוית הזמן ברמות הפרולקטין המופרשות אושרה גם על ידי בחינת מצע תרבית רקמת hES בשיטת ELISA. השפעות נוקדאון ספציפיות לגנים על השינויים התאיים והמולקולריים של דצידואליזציה של תאי סטרומה ברירית הרחם האנושית הוערכו ביום השישי של התרבית לאחר טרנספקציה של siRNA של 48 שעות, עם מפעיל משותף של קולטן סטרואידים או 2 siRNA. בקרה siRNA שהועברה hES הדגימה שינויים תאיים ומולקולריים, התואמים לדיציואליזציה נכונה, כולל שינוי מורפולוגי מרוצף אבן ורמות תעתיק מוגברות של סמני דצידואליזציה PRL ו-IGFBP1.

ב-SRC-2 siRNA, hES נשאר פיברובלסטי במראה בהשוואה ל-siRNA הביקורת שעבר hES, והראה ירידה משמעותית ברמות התעתיק של PRL ו-IGFBP1. רמות התעתיק של SRC-2 ירדו באופן משמעותי ב-hES שעבר טרנספטציה של SRC-2 siRNA בהשוואה ל-siRNA ביקורת, מה שמעיד על הכדאיות של שיטה זו להשתקת גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי סטרומה ראשוניים מביופסיות רירית הרחם לצורך דצידואליזציה במבחנה והפלת גן ספציפי מעניין באמצעות טרנספקציה של siRNA.