Name: לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: למדו לבודד תאי סטרומה רירית הרחם אדם ולגרות דצידואליזציה מלאכותית במבחנה באמצעות תוספות הורמונליות. הפרוטוקול מדגים גם השתקת גנים ספציפית באמצעות שתילת siRNA מבוססת ליפידים לחקר מנגנונים מולקולריים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים אין לחשוף.

<ol><li>Maruyama, T., Yoshimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+mechanisms+for+differentiation+and+regeneration+of+the+uterine+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium.</a> Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+Stromal+Decidualization+Responds+Reversibly+to+Hormone+Stimulation+and+Withdrawal%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal.</a> Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).</li>
<li>Ahn, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-Response+Element-Binding+3-Like+Protein+1+%28CREB3L1%29+is+Required+for+Decidualization+and+its+Expression+is+Decreased+in+Women+with+Endometriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis.</a> Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).</li>
<li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).</li>
<li>Telgmann, R., Gellersen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker+genes+of+decidualization%3A+activation+of+the+decidual+prolactin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene.</a> Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).</li>
<li>Camden, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+regulation+by+estrogen+in+breast+cancer+1+%28GREB1%29+is+a+novel+progesterone-responsive+gene+required+for+human+endometrial+stromal+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization.</a> Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).</li>
<li>Kommagani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promyelocytic+Leukemia+Zinc+Finger+Transcription+Factor+Is+Critical+for+Human+Endometrial+Stromal+Cell+Decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization.</a> PLoS Genetics. 12, e1005937(2016).</li>
<li>Large, M. J., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+embryo+implantation+and+endometrial+decidualization+by+progesterone+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).</li>
<li>Zhang, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal-epithelial+transition+during+in+vitro+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization.</a> Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).</li>
<li>Kommagani, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+the+glycolytic+flux+by+steroid+receptor+coactivator-2+is+essential+for+endometrial+decidualization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization.</a> PLoS Genetics. 9, e1003900(2013).</li>
<li>Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+decidualization%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endometrial decidualization: of mice and men.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).</li>
<li>Tamura, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Function+of+a+Transcription+Factor+WT1+in+Regulating+Decidualization+in+Human+Endometrial+Stromal+Cells+and+Its+Molecular+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism.</a> Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).</li>
<li>Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Decidual+Stromal+Cells+as+a+Component+of+the+Implantation+Niche+and+a+Modulator+of+Maternal+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity.</a> Journal of Pregnancy. , 8689436(2016).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+endometritis+modifies+decidualization+in+human+endometrial+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16(2017).</li>
<li>Garcia-Elias, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+quantification+methods+and+optimizing+protocols+for+microarray+hybridization+of+circulating+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs.</a> Scientific Reports. 7, 7725(2017).</li>
<li>Brosens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endometrial+fibroblasts+immortalized+by+simian+virus+40+large+T+antigen+differentiate+in+response+to+a+decidualization+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus.</a> Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).</li>
<li>Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+rapid+actin+assembly+in+human+endometrial+cells+without+affecting+its+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).</li>
</ol>

עבודה זו נתמכת על ידי מימון של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) / המכון הלאומי של גרנט ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R00 HD080742), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון הזנק מממן את ר. ק ברצוננו להודות המרפאה לפוריות אוניברסיטת וושינגטון למתן את דגימות ביופסיה רירית הרחם.

המחזור החודשי הרבייה הנשי מאופיין על ידי עלייה ברמות הפרוגסטרון לאורך כל שלב luteal, ובכך גרימת את decidualization של ESC לתוך תאים הפרשה עגול, אפיתל דמויי3,8. אתחול של decidualization הוא מין התלויים. בבני אדם, decidualization מתרחשת באופן ספונטני על עליית ריכוז הפרוגסטרון, ואילו עכברים דורשים הבלסטוציסט נוכחות10,11. זה חוסר עקביות decidualization מדגימה את היתרונות translational של הלומדים התמיינות תאים...

בין השלבים של הוסת, גיל המעבר, נשים בגיל הפריון לעבור מחזורים חודשיים של הורמון מוסדר התפשטות רירית הרחם, בידול, ושפך הבאים לקראת הריון בתהליך המכונה הווסת1 ,2. ושינויים פיזיים אלו של רירית הרחם האדם נחוצים להשתלת עובר תקין לתוך הרחם1. שינויים של רירית הרחם, כולל עיבודים מורפולוגי וביוכימי, הן מתווכת לאורך המחזור החודשי באמצעות הורמונים סטרואידים השחלות אסטרוגן ופרוגסטרון (P4)3,4,5. במסגרת שלב המקדימות (או הזקיקים), רמות אסטרוגן preovulatory עלייה, ייזום עיבוי רירית הרחם. בעקבות ביוץ, השלב הפרשה (או luteal) מקדמת לעלייה משמעותית בריכוז P4, גרימת שינוי מורפולוגי תאי סטרומה רירית הרחם (ESC) של פיברובלסט דמוי מראה מעוגל, תאי אפיתל דמויי decidual בתהליך המכונה decidualization4,6. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה עבור ההשתלה כשל ו עוקבות בתחילת העובר הפלה4,7,8. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון באבחון וטיפול של אובדן הריון מוקדם.
כיום, מספר מתודולוגיות מנוצלים כדי לחקור את ההשפעות הבסיסית של decidualization על תאי סטרומה רירית הרחם. In vivo, הרחם העכבר יכולה להיגרם באופן מלאכותי על decidualization באמצעות גירוי מכני (קרי,מגרד) או שמן ההזרקה הרחם הורמונאלית להתקפת9. נבדל בני אדם, גירוי מלאכותי זה מקדם את הבידול של לומן הרחם על ידי מתן את המראה של הבלסטוציסט נוכחות, צעד זה נדרש עבור אתחול של decidualization מכרסמים10,11. בהתאם לכך, עקב סיבוכים translational הקשורים בבעלי חיים של דילמות סביב ויוו המבוסס על מחקרים בבני אדם, decidualization מבוסס מודלים ביותר בהצלחה נלמדים במבחנה.
במחקר זה, נושאים מגויסים דרך המיקום של פרסומות בעיתונים מקומיים בשתי באנגלית ובספרדית. נושאים מזוהה מועמדים מתאימים למחקר זה מובאים להיפגש עם מתאם מחקר, שבו מתוארים על גילוי מלא של סיכונים פוטנציאליים. אישור ההזמנה הבנה מלאה של הסיכונים הפוטנציאליים, מושגת ההסכמה של הנבדקים בצורות בכתב ומילולית. נושא הסכמה כוללת רשות (1) עוברים דם ורידי אחסון (2) לטווח ארוך של הרקמות שלהם למטרות מחקר עתידי, (3) מסכים ליצירתו של תרבויות העיקרי של דגימות רקמה שנאספו. בעקבות הסכמה, נותנים לנסיינים טופס כדי להשלים איזו self-identification המותר של גזע/מוצא אתני ו/או הזכות של סודיות. ביקור עוקבות מתוזמנת כדי להשיג את הביופסיה רירית הרחם בהתבסס על המחזור החודשי של הנושא. מתנדבים מגויס מחקר זה לשקף שני אתנית וגזעית דמוגרפיים של אזור המטרופולין סנט לואיס כפי שתועדו בידי מפקד 2012 ו לא היה כרוך ההשתתפות של כל אוכלוסיה פגיעה כולל נשים בהריון, העוברים, עוברי, ילדים מתחת לגיל 18 שנים של גיל או קבוצות פגיעות אחרות. דרישות הכשירות להשתתפות האוסף דגימת ביופסיה כוללים (1) להיות בין הגילאים 18-45 שנים (2) שיש מווסת סדירה (25-32 ימים) (3) לאחר ההריון הנוכחי וללא שימוש באמצעי מניעה הורמונליים/תוך רחמי ההתקן 30 ימים לפני ההרשמה (4) אין זיהום נרתיקי הנוכחי או מחלות המועברות במגע מיני (5) נתקל אין טיפולים אנטיביוטיים הנוכחי, ו (6) נתקל אין פאפ חריגות הנוכחי.
במסגרת מחקר זה, תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם תרבותי, המושרה באופן מלאכותי לעבור במבחנה decidualization דרך תוספת של הורמונים (אסטרדיול (E2) medroxyprogesterone אצטט (MPA), אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה)) למדיום. בשיטה זו, היא מידת decidualization שונה בהתבסס על המספר הכולל של ימים של טיפול הורמונלי. יחד עם התמורות cytoskeletal, תוספי ההורמונלי גורם עיבודים ביוכימי שבו התאים decidual לחוות הפרשה כמו איכויות2,4. הביטוי של גנים הולמרק, פרולקטין (PRL) ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין מחייב חלבון 1 (IGFBP1), יכול להיות מנוצל כדי לאשר ולכמת את מידת HESC decidualization5,12, 13 , 14. חשוב, הכדאיות של פרוטוקול זה לנהל גנים ספציפיים נוקאאוט גם הוכח.

<table><tbody><tr><td>Opti-MEM I (1X) סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>למדיית דצ'כפולליזציה</td></tr><tr><td>DMEM / F12 (1:1) (1X)</td> <td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0.4%)</td> <td>Gibco</td><td>15250-061</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>PureLink RNA Mini Kit</td><td>Invitrogen</td><td>12183018A</td><td>לבידוד / טיהור RNA</td></tr><tr><td>TaqMan 2X אוניברסלי PCR Master Mix</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת</td><td>גבוהה יישומי ביוסיסטמס 4374967</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eukaryotic 18S rRNA בקרה אנדוגנית</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>4319413E</td><td>לבקרה פנימית qPCR</td></tr><tr><td>בדיקת ביטוי גנים TaqMan בדיקת פרולקטין</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>4331182</td><td>לבקרה פנימית qPCR</td></tr><tr><td>ביטוי גנים TaqMan בדיקת IGFBP1 בדיקה</td><td>יישומית ביו-מערכות</td><td></td><td>4331182 לבקרה פנימית qPCR</td></tr><tr><td>מגיב פלואידין-iFluor 488 - ציטו-פיינטר</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>ערכת פרולקטין אנושי ELISA</td><td>Invitrogen</td><td>EHIAPRL</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>אלפא Aesar</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין מקבע RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>מגיב טרנספקציה</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade Reagent עם DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td>להרכבה</td></tr><tr><td>0.25% טריפסין-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מופשט פחם</td><td>Sigma</td><td>F6765-500ML</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS ריאגנט</td><td>פישר 45001749</td><td></td><td></td>מדעי</tr><tr><td>קולגנאז מ- Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I מלבלב בקר</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone 17-אצטט</td><td>Sigma</td><td>M1629-1G</td><td>עבור EPC מדיה</td></tr><tr><td>אסטרדיול</td><td>סיגמא</td><td>E1024-1G</td><td>עבור EPC מדיה</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A6885-100MG</td><td>עבור EPC מדיה</td></tr><tr><td>מספריים תפר ישר</td><td>עדין Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351372</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי,</td><td>Gibco</td> מושבת בחום <td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>תרמו אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי</td><td> </td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>מדעי האנק' s תמיסת מלח מאוזנת&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>21-021-cv</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור פלקון פוליפרופילן חרוטי</td><td>קורנינג</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>דומונט #5/45 מלקחיים</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 מ"מ צלחת פטרי זכוכית</td><td>VWR</td><td>75845-546</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 40 מיקרון</td><td>Midsci</td><td>229481</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 215 אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FS-215</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה LSE&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>NCOA2 אנושי siRNA&nbsp;</td><td>Dharmacon</td><td>L-020159-00</td><td>בדיקת qPCR ספציפית לגן</td></tr><tr><td>חממת Steri-cycle i160 CO2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030301</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>לכימות RNA</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50146771</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ בקבוק תרבית תאים צוואר משומר</td><td>קורנינג</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>6 באר צלחת תרבית תאים לא פירוגנית</td><td>קורנינג</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>בקר פיפט אולטרה</td><td>קורנינג</td><td>4099</td><td></td></tr><tr><td>פוטושופ</td><td>Adobe</td><td>19.0.1.334</td><td></td></tr><tr><td>25 ס"מ בקבוק תרבית תאים צוואר שימור</td><td></td><td>7200876</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור פלקון פוליפרופילן חרוטי</td><td>מזרק קורנינג</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל BD</td><td></td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>1300 סדרה A2 קולט אדים בטיחות ביולוגית</td><td>Thermo Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>accuspin Micro17 צנטריפוגה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13100675</td><td></td></tr><tr><td>7500 מהיר מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>3052632</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Immunofluorescence Microscope</td><td>Life Technologies</td><td>01414-155G-291</td><td></td></tr><tr><td>Leica Inverted Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Illrustrator</td><td>Adobe</td><td>22.0.1.253</td><td></td></tr><tr><td>Excel Spreadsheets</td><td>Microsoft</td><td>2016</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser 18 מ"מ משקפי כיסוי</td><td>NeuVitro</td><td>GG-18</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line Hemacytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>פישר ביוריאגנטים</td><td>BP176-100</td><td>למאגר ליזה RNA</td></tr><tr><td>1.2 מ"ל 430658 קורנינג בקבוקון קריוגני פוליפרופילן הברגה חיצונית</td><td></td><td></td><td>להקפאת תאי HESC&nbsp;</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650-100mL</td><td>להקפאת מדיה</td></tr></tbody></table>

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

הבידול של רירית הרחם סטרומה תאים אנושיים (HESC) ממראה כמו פיברובלסט. לתוך רותמי הפרשה היא שינוי נדרש השרשת לתוך הרחם רירית רחם אימהי. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה כשל השרשה, הבאים הפלה העובר מוקדם. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון בשיפור שיעור לידות מוצלחות. In vivo המבוסס על מחקרים של decidualization מלאכותיים הם הגבלת לעיתים קרובות עקב דילמות אתיות המשויך מחקר אנושי, כמו גם הסיבוכים translational בתוך חייתיים. כתוצאה מכך, במבחנה מבחני דרך התרבות התא הראשי מנוצלים לעיתים קרובות כדי לחקור את האפנון של decidualization באמצעות הורמונים. מחקר זה מספק נוהל מפורט בידודו של HESC ו- decidualization מלאכותיים עוקבות באמצעות תוספת של הורמונים למדיום culturing. עוד יותר, מחקר זה מספק שיטה מעוצב היטב נוקאאוט בכל הגן עניין על-ידי ניצול siRNA מבוססי השומנים transfections. פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה של טוהר התרבות, כמו גם התשואה מוצר, ובכך למקסם את היכולת לנצל את המודל הזה בתור שיטה אמינה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization, כימות עוקבות של סוכנים מופרשים על-ידי decidualized תאי סטרומה רירית הרחם.

Decidualization בתרבות HESC
בעקבות בידוד, תאי סטרומה רירית הרחם אדם היו בתרבית היווצרות חד שכבתי עם 80-90% confluency, שנגזרות עבור במבחנה decidualization בטיפול עם 10 ננומטר E2 1 מיקרומטר MPA, מחנה 50 מיקרומטר (EPC). משמרות מורפולוגי המשויך במבחנה decidualization היו דמיינו ב איור 1A. על decidualization, HESCs לעבור שחלוף cytoskeletal מתאי מוארך, fibroblastic לתאי...

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בתחום רפואת הרבייה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של דצידואליזציה, והבנת התפקידים של גנים ספציפיים בדצידואליזציה של תאי סטרומה של רירית הרחם. מחקר זה מספק פרוטוקול מפורט לבידוד תאי סטרומה של רירית הרחם האנושית ודיציואליזציה מלאכותית לאחר מכן על ידי הוספת הורמונים למצע התרבית. ניתן להשתמש בביטוי של שינוי הורמונלי, כגון פרולקטין וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין כדי לאשר ולכמת את מידת הדצידואליזציה.חשוב לציין, הכדאיות של פרוטוקול זה לבצע נוקדאון ספציפי לגנים מודגמת גם היא. העבירו את הביופסיה עם מלקחיים מעוקרים לתוך שפופרת של 50 מיליליטר המכילה עשרה מיליליטר HBSF טרי, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-500x G למשך 90 שניות. בעזרת פיפטה של מ"ל אחד, הסר את המדיה והוסף שלושה מ"ל מדיית בידוד hES מחוממת מראש.שפכו את הביופסיה לתוך צלחת של 10 ס"מ המכילה חמישה מ"ל של חומר בידוד hES, והתחילו לקצוץ בעזרת מלקחיים של Dumont 5 ומספריים עדינים עם תפרים ישרים למשך כ-20 דקות. בעזרת פיפטה אחת של מ"ל, העבירו את הביופסיה הקצוצה לתוך צינור חדש של 50 מ"ל, והוסיפו עוד שבעה מ"ל של אמצעי בידוד hES לצלחת, כדי להעביר את החלקים הנותרים לצינור של 50 מ"ל. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה למשך שתי דקות ב-800x G, והסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של מ"ל אחד.לאחר מכן, מסננים את תערובת העיכול של DNase-1 וקולגנאז דרך מסנן של 0.2 מיקרון המחובר למזרק של 10 מיליליטר ישירות על הגלולה. לאחר מכן מערבל את הצינור למשך 10 שניות כדי להשעות מחדש את הגלולה, ודגירה למשך 90 דקות באמבט מים. לאחר כל 10 דקות, מערבל את הצינור למשך 10 שניות כדי לוודא שהרקמה מתעכלת כראוי.לאחר הדגירה, סנן את התרחיף דרך מסננת תאים של 40 מיקרון שנערמה על צינור חדש של 50 מיליליטר כדי לשחזר את תאי הסטרומה, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים שנאספו ב-800x G למשך 2.5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסר בעדינות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, והקפד לא להפריע לכדורית התא. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התא ב-10 מיליליטר של אמצעי בידוד hES טריים, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-800x G למשך 2.5 דקות.לאחר צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט בזהירות, והשעו מחדש את התאים בשישה מיליליטר מדיה hES טרייה. לאחר מכן, כדי להסיר תאי דם, שכבו לאט תאים תלויים על שלושה מיליליטר של מדיה שיפוע צפיפות, וצנטריפוגה את הדגימה ב-400x G למשך 30 דקות. לאחר צנטריפוגה, אסוף את הסופרנטנט מבלי להפריע למדיית שיפוע הצפיפות.לאחר מכן הוסף מדיית hES כדי להגדיל את הנפח הכולל ל-10 מיליליטר, וצנטריפוגה שוב את הדגימה ב-800x G למשך 2.5 דקות. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים בשישה מיליליטר של מדיה hES. לאחר מכן צלחת את התאים בבקבוק של 75 סנטימטר על ידי הוספת שישה מיליליטר של מתלה התא ו -10 מיליליטר של מדיה hES לבקבוק, ולאחר מכן ערבוב עדין באמצעות נדנוד הבקבוק.לאחר הציפוי, בדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ, ולאחר מכן תרבית את התאים באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% למשך שלושה עד חמישה ימים, והקפד להחליף את מדיית ה-hES כל יומיים. לאחר 48 שעות, התאים צריכים לגדול כשכבה אחת. בדרך כלל לאחר חמישה ימים, התאים משיגים מפגש של 80 עד 90% בבקבוק של 75 סנטימטר.עבור טרנספקציה של siRNA, התחל בציפוי של 800,000 תאים לבאר בצלחת של שש בארות בשלוש פעמים לכל מצב, ודגר את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% למשך יומיים כדי להתכונן לטרנספקציה. לאחר יומיים, הוסף 150 מיקרוליטר של חומר חופשי בסרום Opti-MEM בשפופרת של חמישה מ"ל, ולאחר מכן הוסף חמישה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה. מערבבים היטב על ידי היפוך, ודוגרים במשך חמש דקות.לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום Opti-MEM בשפופרת חדשה של חמישה מ"ל, ואחריה תוספת של 16 ננומול של SRC-2 siRNA. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה נטולת סרום Opti-MEM בשפופרת של חמישה מ"ל, ולאחר מכן תוספת של 16 ננומול בקרת siRNA. לאחר הדגירה, שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם SRC-2 siRNA וערבב היטב על ידי פיפטינג קדימה ואחורה.לאחר מכן שלב את מגיב הטרנספקציה המדולל עם ה-siRNA הבקרה וערבב היטב על ידי פיפטינג קדימה ואחורה. ואז דגרו על המתחמים למשך חמש דקות. במהלך הדגירה הזו, שאפו החוצה את מדיית ה-hES, והוסיפו מיליליטר אחד של מדיית שינוי לכל באר.לאחר חמש דקות של דגירה, צנטריפוגה את הקומפלקסים ב-500x G למשך שתי דקות כדי לאסוף את התמיסה. לאחר מכן הוסיפו 250 מיקרוליטר של קומפלקסים של ריאגנטים של טרנספקציה siRNA לכל באר המכילה תאים ומדיה, וערבבו על ידי נדנוד עדין, ולאחר מכן דגירה באינקובטור פחמן דו חמצני של 5% למשך חמש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש שעות, שאפו את המדיה והחליפו למדיה hES, והמשיכו בדגירה במשך יומיים כהכנה לבדיקת דצידואליזציה במבחנה.לאחר טרנספקציה של 48 שעות ולפני התחלת בדיקת הדצידואליזציה במבחנה, אסוף את היום אפס בקרת siRNA ותאי SRC-2 siRNA שעברו טרנספטציה. ראשית, שאפו את המדיה ושטפו עם מ"ל PBS אחד לכל באר. לאחר מכן הסר את ה- PBS, והוסף 300 מיקרוליטר של מאגר ליזה RNA לבאר ודגירה למשך שלוש דקות.לאחר שלוש דקות של דגירה, אסוף את התאים במאגר ליזה של RNA לתוך צינור של 1.5 מ"ל לניתוח מאוחר יותר במורד הזרם. לאחר מכן הכינו את מדיית ה-EPC על ידי ציטוט הנפח המתאים של אמצעי הדצידואליזציה, והוסיפו 10 אסטרדיול ננו-מולרי, מדרוקסיפרוגסטרון אצטט מיקרו-מולרי אחד, ו-50 אדנוזין מונופוספט מחזורי מיקרו-מולרי בשפופרת של 50 מיליליטר. עבור בארות היום השישי הנותרות, הוסף שני מיליליטר של מדיה EPC לכל באר, ודגר את התאים בחממת פחמן דו חמצני של 5% ב-37 מעלות צלזיוס למשך שישה ימים, והחלף את מדיית ה-EPC כל 48 שעות.לאחר היום השישי, אסוף את היום השישי של siRNA הבקרה והיום השישי SRC-2 siRNA שהועבר כדורי תאים במאגר ליזה RNA לניתוח במורד הזרם באמצעות PCR בזמן אמת. השראת הדצידואליזציה על ידי אסטרוגן מדרוקסיפרוגסטרון אצטט ואדנוזין מונופוספט מחזורי, מביאה לסידור מחדש של השלד הציטו של תאי סטרומה מתאים פיברובלסטיים מוארכים לתאי אפיתל מעוגלים. צביעת פלואידין של תאי סטרומה של רירית הרחם חושפת עוד יותר את הארגון מחדש של שלד הסיבים הפעילים האופייני לדצידואליזציה של hES.ב-hES שטופלו ברכב, התאים נשארים פיברובלסטיים במראה, ואילו בתאים שטופלו ב-EPC, hES נראה כמו אפיתלואיד. כדי לאשר את היעילות של בדיקת הדצידואליזציה במבחנה, רמות תעתיק mRNA של סמני דצידואליזציה פרולקטין וחלבון קושר גורם גדילה דמוי אינסולין-1 הוערכו במשך תקופה של 6 ימים. עם דצידואליזציה של תאי סטרומה של רירית הרחם האנושית, רמות הפרולקטין וה-IGFBP1 עלו באופן תלוי זמן.העלייה תלוית הזמן ברמות הפרולקטין המופרשות אושרה גם על ידי בחינת מצע תרבית רקמת hES בשיטת ELISA. השפעות נוקדאון ספציפיות לגנים על השינויים התאיים והמולקולריים של דצידואליזציה של תאי סטרומה ברירית הרחם האנושית הוערכו ביום השישי של התרבית לאחר טרנספקציה של siRNA של 48 שעות, עם מפעיל משותף של קולטן סטרואידים או 2 siRNA. בקרה siRNA שהועברה hES הדגימה שינויים תאיים ומולקולריים, התואמים לדיציואליזציה נכונה, כולל שינוי מורפולוגי מרוצף אבן ורמות תעתיק מוגברות של סמני דצידואליזציה PRL ו-IGFBP1.ב-SRC-2 siRNA, hES נשאר פיברובלסטי במראה בהשוואה ל-siRNA הביקורת שעבר hES, והראה ירידה משמעותית ברמות התעתיק של PRL ו-IGFBP1. רמות התעתיק של SRC-2 ירדו באופן משמעותי ב-hES שעבר טרנספטציה של SRC-2 siRNA בהשוואה ל-siRNA ביקורת, מה שמעיד על הכדאיות של שיטה זו להשתקת גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד תאי סטרומה ראשוניים מביופסיות רירית הרחם לצורך דצידואליזציה במבחנה והפלת גן ספציפי מעניין באמצעות טרנספקציה של siRNA.

isolation-human-endometrial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמת מערכות עיקריות של רירית הרחם סטרומה תא תרבות מדגימות כריתת רחם היא טכניקת ערך ביולוגית וצעד חיוני לקראת רודף מגוון רחב של מחקר שואף. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המשמשות להקמת תרבויות סטרומה מרקמות של רירית הרחם שעברו כריתה כירורגית של חולים אנושיים.

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

מחקר זה מציג שיטה סטנדרטית ומאומתים עבור בידוד והתרבות של סטרומה רירית הרחם העכבר העיקרי ותאי אפיתל, אשר ניתן להשתמש בהם במערכת coculture ללמוד decidualization במבחנה.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

הפרוטוקול מציג מודל ניסוי חדש במבחנה שיכול לסכם את הביולוגיה של שני סוגים של קווי תאים דבקים עם פיגום מודפס תלת מימדי (תלת מימד). מתוארים בניית מודל זה ונהלי הפעלה, מהכנת תאים ותרבית תאים ועד לניתוח והערכה.

מודל תרבית משותפת באמצעות שני סוגים של קווי תאים דבקים

ניתן להגדיר את הטרוגניות השעתוק בתוך תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי ברמת התא הבודד באמצעות סמני פני התא וגנים אוסטאוגניים.  אנו מתארים פרוטוקול המשתמש בזרימה ציטומטרית לבידוד תת-אוכלוסיות תאים עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, אשר עשוי לשמש לשיפור שחזור השלד הגולגולתי.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

בזאת אנו מתארים שיטות לנתיחה של רקמות יולדות ועובר מן שלית מונח אנושית, ואחריו בידוד והרחבת גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) מרקמות אלה.

בידוד הרחבת גזע mesenchymal / תאי סטרומה נגזרו רקמה אנושית שליה

תאי סטרומה שמקורם בשומן עשויים להיות שימושיים להנדסת רקמה חדשה מתאי המטופל עצמו. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של תת-אוכלוסייה של תאי סטרומה שמקורם בשומן אנושי (ASCs) עם פוטנציאל אוסטאוגני מוגבר, ואחריו יישום התאים בבדיקת ריפוי קלוריאלי in vivo.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.

בידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal מן טבורי אדם העובר שליה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור יעיל של תאים טרופובלסטיים אנושיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות חלבון מורפוגני בעצם 4 ומעכבים של מסלולי האקטיבין/צמתים. שיטה זו מתאימה להתמיינות יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים ויכולה לייצר כמויות גדולות של תאים למניפולציה גנטית.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

למדו לבודד תאי סטרומה רירית הרחם אדם ולגרות דצידואליזציה מלאכותית במבחנה באמצעות תוספות הורמונליות. הפרוטוקול מדגים גם השתקת גנים ספציפית באמצעות שתילת siRNA מבוססת ליפידים לחקר מנגנונים מולקולריים.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

גלה סרטונים נוספים