העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לספק שיטה לפרופיל בו-זמני של חלקי התאים החיסוניים והסרטניים התורמים למיקרו-סביבה החיסונית של גידולים מוצקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האונקולוגיה החיסונית, כגון אילו שינויים סדרתיים חיסוניים ולא חיסוניים מתרחשים בתוך הגידול לאחר טיפול נתון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת העשרה יעילה של רכיבים חיסוניים ולא חיסוניים של הגידול, ומאפשרת פרופיל יסודי של המצב החיסוני של הגידול.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור פרופיל יעיל של המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול ולזהות שינויים הנגרמים על ידי הטיפול. לאחר ריסוס העכבר באתנול 70% למניעת זיהום שיער, הסר בניתוח את הגידולים התת עוריים, תוך הקפדה על כך שהגידולים יהיו נקיים מכל רקמה מזהמת. לאחר מכן, הנח כל גידול ב-1.8 מיליליטר של מדיום בסיס RPMI 1640 ללא סרום בקר עוברי בבארות בודדות של צלחת של 24 בארות על קרח.

לאחר איסוף כל הגידולים, השתמש במספריים כדי לחתוך את הדגימות לחתיכות של פחות ממילימטר מעוקב אחד ולהוסיף 200 מיקרוליטר של קוקטייל דיסוציאציה טרי 10X שהוכן המכיל קולגנאז-1, קולגנאז-4 ו-DNase אחד לכל באר. לאחר שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס, בשייקר צלחת אורביטלי ב-60 עד 100 סל"ד, נטרל את התגובה עם מיליליטר אחד של מדיום RPMI 1640 בתוספת 5% FBS ושני מילי-מולרי EDTA, והשתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר כל דגימת תמיסת גידול לצינורות חרוטיים בודדים של 50 מיליליטר ומעליהם מסננות בודדות של 40 מיקרומטר. בעזרת בוכנת מזרק של 10 מיליליטר, יש לפרק מכנית את חלקי הגידול דרך המסננות, ולשטוף מעת לעת כל מסננת בשני מיליליטר RPMI 1640 בינוני פלוס 5% FBS עד שהמסננות נקיות מהגידול.

כאשר כל הגידולים התפרקו, הוסף מדיום לכל צינור לפי הצורך כדי להביא את כל הדגימות לאותו נפח ולגלול את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, השתמש בפיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר כדי להשעות את הכדורים בשני מיליליטר של מדיום בתוספת FBS לכל צינור. כדי להפריד בין חלקי תאי החיסון והגידול, הוסף שלושה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לתחתית צינור חרוטי אחד של 15 מיליליטר לכל דגימה ושכבה איטית של שני מיליליטר של תרחיף תאי גידול לאורך הצד של כל צינור על כל שיפוע.

הקפד לוודא כי תרחיפי תאי הגידול מעורבבים היטב לפני השכבות, שמתלי התאים מוזרמים לאט במורד צד הצינורות, וכי הצינורות מטופלים בזהירות כדי למנוע ערבוב של השכבות. הפרד את התאים על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות ואסוף בזהירות את המדיום העליון ואת שכבות הלויקוציטים החודרים לגידול לצינור חדש אחד של 15 מיליליטר לכל דגימה. השלך את אמצעי שיפוע הצפיפות הנותרים והשהה מחדש את כדורי הגידול בשני מיליליטר של מדיום בתוספת FBS לכל צינור.

לאחר מכן, יש לצנטריפוגה של כל הדגימות ולהשעות מחדש את הגידול החודר לויקוציטים ב-200 מיקרוליטר ואת תאי הגידול בשני מיליליטר של מדיום בתוספת FBS לכל צינור על קרח. כדי לצלחת את התאים, סמן צלחת U תחתונה אחת של 96 בארות לכל לוח צביעה חיסוני בתוספת צלחת נוספת לספירת תאים וחלק את מתלי התאים הבודדים לכל אחת מלוחות לוח הצביעה וצלחת החיד. שטפו את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS של Dulbecco לכל דגימה וחסמו את התאים עם 50 מיקרוליטר של בלוק FC לבאר למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה החוסמת, הוסף 50 מיקרוליטר של נוגדנים ממוקדים חוץ-תאיים מרוכזים פי 2 ותערובת כתמי כדאיות ניתנת לתיקון לכל באר למשך 30 דקות בחושך. בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימות פעמיים עם מאגר FACS ולהשעות את הכדורים ב-200 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע וחדירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור. למחרת, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה, ואחריה שטיפה עם 200 מיקרוליטר של מאגר חדירות לבאר.

סמן את התאים עם 100 מיקרוליטר של לוח צביעת נוגדנים תוך תאיים במאגר חדירות למשך 30 דקות דגירה בחושך, ולאחר מכן שטיפת חיץ חדירה נוספת. לאחר מכן, שטפו את התאים שוב עם מאגר FACS והשעו מחדש את הדגימות ב-300 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי לניתוחם על ידי ציטומטריית זרימה. עיכול הגידול, כפי שהודגם, עם או בלי העשרה בינונית של שיפוע צפיפות, מביא לאוכלוסיית תאי גידול שלמה בת קיימא של כ-70 עד 90% כפי שהוערך על ידי ציטומטריית זרימה.

העשרה בינונית של שיפוע צפיפות מקדמת עלייה גדולה מפי שניים במקטע הלויקוציטים החודר לגידול חיובי CD45, בהשוואה לעיכול גידול לא מועשר, כמו גם תת-קבוצות רבות של תאים חיסוניים שנצפו בדרך כלל במחקרי מיקרו-סביבה חיסונית. ניתן לאפיין את מקטע תאי הגידול השלילי CD45 גם עבור תכונות גידול רבות, כגון כדאיות הגידול הכוללת או אפופטוזיס, יכולת התפשטות וביטוי של סמנים מדכאי חיסון שונים. כדי לקבוע כיצד תת-קבוצות אימונולוגיות מיאלואידיות ולימפוציטים משתנות לאורך גידול מוצק יחיד, ניתן לחלק את הגידול לארבעה חלקים שווים באופן שכל חלק מכיל אזורים תוך-גידוליים שווים בערך, כמו גם חלקים עוריים וצפק שווים.

לאחר מכן ניתן לעכל כל חתיכה בנפרד ולנתח, כפי שהודגם, לנוכחות של אוכלוסיות שונות של תאי חיסון. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך ארבע עד 8 שעות, תלוי בכמה דוגמאות יש לך. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעבוד במהירות אך ביעילות כדי לשמר את כדאיות התאים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי הדיסוציאציה וההפרדה כוללים טכניקות שקשה ללמוד על ידי טקסט כתוב בלבד. לאחר הליך זה, ניתן לבצע ציטומטריית זרימה כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו אוכלוסיות תאים משתנות בתוך גידול, הן מבחינת שפע והן מבחינת פנוטיפ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להפריד ולנתח את המרכיבים החיסוניים והלא חיסוניים של גידול עכברי תת עורי מבוסס באמצעות טכניקות העיכול והפרדת שיפוע הצפיפות המוכחות.