דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התכנות מחדש של הלב, כגון זיהוי אילו מסלולים מקדמים או מתקנים קרדיו-מיוגנזה. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שאנו יכולים לייצר קרדיומיוציטים מושרים פונקציונליים, ביעילות גבוהה יותר משיטות שפורסמו בעבר. מחלות לב כימיות אלה גורמות לאובדן קרדיומיוציטים ולפגיעה בתפקוד הלב.

לכן, טכניקה זו עשויה לסייע בתיקון גבוה, על ידי המרת פיברובלסטים לקרדיומיוציטים מושרים פונקציונליים. כדי להתחיל בייצור רטרו-וירוס, גדל תאי פלטינה E, או PE במדיום PE. השלם אותו עם סמני בחירה בצלחת של 10 ס"מ, בארון ברמת בטיחות ביולוגית שתיים.

כל יומיים עוברים את התאים, באחד עד ארבע, או באחת עד חמישית. יום אחד לפני הטרנספקציה המתוכננת, זרעו תאי PE ב-10 מ"ל של מצע גידול, בצלחת תרבית של 10 ס"מ, ולאחר מכן נדנדו בעדינות את הכלים קדימה ואחורה. מניחים בזהירות את הכלים בחממה, כדי לאפשר פיזור אחיד של התאים, ודוגרים למשך 24 שעות.

ביום ההעברה, הוסיפו את קוקטייל GHMT2M, לצינור של 1.5 מ"ל. לאחר מכן הוסף 360 מיקרוליטר של חומר סרום מופחת, לצינור נפרד של 1.5 מ"ל. לאחר מכן, הוסף 36 מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה למדיה המופחתת בסרום, והעביר בעדינות את הצינור כדי לערבב.

דגירה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. מגיב הטרנספקציה המשמש בשלב זה נקשר לפלסטיק. כדי למנוע יעילות טרנספקציה, הקפד להחדיר את מגיב הטרנספקציה, ישירות לתוך אמצעי הסרום המופחת, והימנע מלגעת בקצה הפיפט בדופן הצינור.

לאחר מכן הוסף את תערובת ריאגנט טרנספקציה של מדיה מופחתת בסרום לצינור, המכילה את קוקטייל ה-DNA GHMT2M. יש לערבב בעדינות את השפופרת ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לבסוף מוסיפים את תערובת תגובת הטרנספקציה בחוכמה לתאי PE.

מערבבים בעדינות את המנה למשך 10 עד 15 שניות. דגרו על התאים המועברים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למשך 16 עד 20 שעות. כעת מצפים כלים בקוטר 60 מ"מ בקולגן, ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס, למשך שעתיים לפחות.

לאחר מכן מחלקים פיברובלסטים עובריים של עכברים שזה עתה הופשרו, או MEFs לתוך הכלים המצופים בקולגן. ולהוסיף מצע גידול לנפח סופי, של 4 מ"ל לכל צלחת של 60 מ"מ. נדנדו בעדינות את הכלים והניחו אותם בחממה.

בעת ציפוי MEFs חשוב שהתאים יהיו מצופים באופן שווה. הימנע ממערבולת הכלים, זה יכול לגרום לציפוי לא אחיד. במקום זאת, נדנדו בעדינות את המנה קדימה ואחורה, והניחו אותה בזהירות בחממה.

24 שעות לאחר העברת תאי PE, השתמש במזרק של 30 מ"ל כדי לאסוף את המדיום הרטרו-ויראלי שנוצר על ידי התאים. העבירו את האוסף הראשון של מדיום רטרו-ויראלי דרך מסנן בגודל 45 מיקרומטר, לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל. לאחר מכן הוסף 10 מ"ל של מדיום גידול טרי על דופן המנה, תוך הקפדה לא לעקור את תאי ה- PE.

דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות נוספות. לאחר מכן, הוסף 7.2 מיקרוליטר של 10 מ"ג למיליליטר הקסידין מתרין ברומיד, לצינור החרוטי של 50 מ"ל המכיל סופרנטנט נגיפי. כעת שאפו את המדיום מה-MEFs, והוסיפו 4 מ"ל מהמדיום הרטרו-ויראלי הטרי שנקטף למנה.

דגירה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 48 שעות לאחר הטרנספקציה של תאי ה-PE, אספו את המדיום הרטרו-ויראלי ובצעו את ההתמרה בדיוק באותו אופן, כמו באיסוף הראשון. השליכו את תאי ה-PE לאחר האיסוף השני של המדיום הרטרו-ויראלי והוסיפו 10% אקונומיקה, לכל החומרים במגע עם מדיום רטרו-ויראלי.

לאחר הדגירה שואבים את המדיום הרטרו-ויראלי מה-MEFs, ומוסיפים 4 מ"ל של מדיום ICM, המכיל 05 מיקרו-מולארי, מעכב קולטן TGF Beta Type 1. כל יומיים יש להחליף את מדיום ה-ICM, עד לשימוש נוסף. כדי להתחיל את הצביעה החיסונית, שאפו את מדיום ה-ICM מהיום ה-14 שתוכנתו מחדש MEFs.

לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של 1X PBS קר כקרח, לכל באר של צלחת 12 הבארות. לאחר מכן, שאפו את ה- PBS, הוסיפו 500 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד כדי לתקן את התאים, ודגרו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיבת הפרפורמלדהיד יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1 מ"ל PBS.

לאחר שאיבת ה-PBS, מוסיפים 500 מיקרוליטר של. 02% טריטון X 100, ודוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שאיפת Triton X 100, יש לחסום את התאים עם 500 מיקרוליטר של סרום 10% סוס, למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שאפו את סרום הסוס, והוסיפו 500 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני מדולל. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שאיבת הנוגדן הראשוני, יש לשטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS.

לאחר השטיפה האחרונה של PBS, הוסף 500 מיקרוליטר של נוגדן משני מדולל. עוטפים את הצלחת בנייר כסף ודוגרים בחושך, למשך שעה בטמפרטורת החדר. לבסוף, שאפו את הנוגדן המשני, ושטפו שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS.

עוטפים את הצלחת בנייר כסף, ושומרים בארבע מעלות צלזיוס עד לסיום ההדמיה. שיטה זו מציגה המרה ביעילות גבוהה של MEFs לקרדיומיוציטים. ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת, הוסף את היום התשיעי לאחר הטרנסדוקציה, מראה ביטוי טרופונין T לבבי מופעל, בכ-70% מהתאים.

באופן דומה, ביטוי אלפא-אקטינין לבבי, נצפה בכ-55% מהתאים, בהשוואה לבקרת התמרת GFP. בנוסף, צביעה חיסונית לסמנים לבביים, שבוצעה שבועיים לאחר הטרנסדוקציה, מראה שרוב התאים מבטאים טרופונין I, אלפא-אקטינין וטרופונין T. חלבון צומת הפער Cx43, זוהה גם בפריפריה של ה-ICM. יתר על כן, תיוג משותף של ICMs עם אלפא-אקטינין, או טרופונין T ו-Cx43, חושף תצורות של צמתים מרווחים בין תאים שכנים.

התמרת GHMT2M, וטיפול ב-A83O1, מתכנתים מחדש חלק מה-MEFs, לתאים פועמים ביום השמיני. ביום ה-11 נצפים כ-10000 תאים פועמים לסנטימטר רבוע. מעברי סידן ספונטניים, מתגלים בקרדיומיוציטים פועמים.

תוספת של איזופרוטרנול אגוניסט בטא אדרנרגי, מגדילה משמעותית את תדירות מעברי הסידן הספונטניים. לעומת זאת, הסתה של חוסם תעלות סידן מסוג L, ניפדיפין, מפחיתה משמעותית את תדירות מעברי הסידן. לאחר צפייה בסרטון זה, צריך להבין היטב כיצד לתכנת מחדש פיברובלסטים, לקרדיומיוציטים מושרים פונקציונליים ביעילות גבוהה.

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כולל ריצוף RNA וריצוף שבבים, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון ביטוי גנים גלובלי ומצב כרומטין, משתנות במהלך תכנות מחדש של הלב. אל תשכח שעבודה עם רטרו-וירוס עלולה להיות מסוכנת. אמצעי זהירות, כגון עבודה בארון בטיחות ביולוגית ברמה שתיים, לבישת ציוד מגן אישי וסילוק נכון של כל הפסולת הרטרו-ויראלית, צריכים להיות מיושמים תמיד בעת ביצוע פרוטוקול זה.