שיטה פשוטה לשחזור כדי להכין ממברנה דגימות מן החולדה טרי מבודד המוח Microvessels
7 במאי 2018
. הנה, מתוארת שיטה עבור בידוד של עכברוש המוח microvessels, הכנת דוגמאות ממברנה. פרוטוקול זה יש יתרון ברור של הפקת microvessel מועשר דגימות עם חלבון מקובל תשואה של חיות בודדות. דוגמאות יכול לשמש לאחר מכן עבור ניתוחים חלבון חזקה על אנדותל microvascular המוח.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מיקרו-כלי דם מוחיים ממוח החולדה למחקרים ביוכימיים שמטרתם להבין את המאפיינים המולקולריים של מחסום הדם-מוח של היונקים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בפיזיולוגיה של מחסום דם-מוח ונוירו-פרמקולוגיה, כגון ויסות ולוקליזציה וביטוי של חלבוני צומת הדוק וטרנספורטרים אנדוגניים בבריאות ובחולי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנו יכולים לבודד מספר מספיק של מיקרו-כלים איכותיים מבעל חיים בודד תוך התחשבות בשונות הטבעית בביטוי החלבון בין בעלי חיים בודדים.
מי שתדגים את הטכניקה הזו תהיה ביאנקה ריילי, סטודנטית מצטיינת לתואר ראשון מהמעבדה שלי. לאחר המתת חסד ועריפת ראש של חולדת ספראג-דולי על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במספריים כירורגיים כדי לכרות את העור מגולגולת החולדה על ידי ביצוע חתך רוחבי יחיד. בעזרת רונג'ורים, הסר בזהירות את לוחית הגולגולת וחשוף את המוח.
לאחר מכן, בעזרת מרית, הסר את האיבר. נתק את המוח הגדול, והנח את רקמת המוח המבודדת לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר עם חמישה מיליליטר BMB ו-5.0 מיקרוליטר קוקטייל מעכב פרוטאז. כדי לעבד את הרקמה, העבירו אותה לצלחת פטרי נקייה.
לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, גלגל בעדינות את המוח על נייר סינון בקוטר 12.5 סנטימטר כדי להסיר את קרומי המוח החיצוניים, המודבקים באופן רופף לקליפת המוח. במהלך שלב זה, יש להקפיד על כך שכל רקמת קרום המוח הוסרה מדגימת רקמת המוח. ניתן לדמיין את קרומי המוח כרקמה קרומית שקופה שניתן למשוך בקלות מרקמת המוח.
לחצו בעדינות את רקמת המוח על נייר הסינון, וגלגלו את הממחטה שוב, סובבו את נייר הסינון לעתים קרובות במהלך שלב זה. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים, הפרד את מקלעת הכורואיד מההמיספרות המוחיות. לאחר מכן, שטחו שוב בעדינות את רקמת המוח, והשתמשו במלקחיים כדי להסיר את פקעות הריח הסמוכות לחומר הלבן.
הנח את רקמת המוח בקליפת המוח במכתש זכוכית צונן. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר BMB עם קוקטייל מעכב פרוטאז. בעזרת הומוגנייזר כוח עילי, הכנס עלי לתוך המרגמה, והומוגניזציה של רקמת המוח באמצעות 15 משיכות למעלה ולמטה ב-3,700 סל"ד.
לאחר מכן, שפכו את ההומוגנאט לצינורות צנטריפוגה מסומנים. בין הדגימות, השתמש ב-70% אתנול לניקוי העלי. כדי לבצע צנטריפוגה, הוסף 8.0 מיליליטר של תמיסת דקסטרן 26% לכל צינור צנטריפוגה מסומן המכיל הומוגנט מוח.
הפוך את הצינור פעמיים, ולאחר מכן מערבל היטב את הדגימה. בצע את המערבולת של כל דגימה באמצעות מספר זוויות כדי להבטיח ערבוב יסודי של תמיסת מוח הומוגנית עם תמיסת דקסטרן 26%. צנטריפוגה את הדגימות בחום של 5, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
שאפו את הסופרנטנט, והשעו את הגלולה ב-5.0 מיליליטר BMB עם קוקטייל מעכב פרוטאז. לאחר מכן, מערבל את הגלולה כדי להבטיח ערבוב יסודי. לאחר מכן, הוסף 8.0 מיליליטר של 26% דקסטרן לכל צינור צנטריפוגה, ומערבולת כפי שהודגם זה עתה.
לאחר מכן, צנטריפוגה שוב את הדגימות. בעזרת בקבוק ואקום ופיפטת זכוכית, שאפו את הסופרנטנט וודאו שהכדור המכיל את כלי המיקרו במוח לא יופרע. השעו מחדש את הגלולה ב-BMB עם מעכב פרוטאז ולאחר מכן 26% דקסטרן פעמיים נוספות.
לאחר הצנטריפוגה הסופית, הוסף 5.0 מיליליטר BMB לכל גלולה ומערבולת כדי להשעות מחדש את הדגימה. באמצעות הפרוטוקול שהודגם בסרטון זה, בוצע בידוד מוצלח של כלי דם שלמים ממוח העכברוש. בתמונה זו, המיקרו-כלי נצבע באמצעות נוגדן נגד Oatp1a4, טרנספורטר המתבטא היטב בקרום הפלזמה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח.
כפי שהודגם על ידי Western Blot, תכשירי ממברנה ממיקרו-כלים שנקטפו מחולדות Sprague-Dawley נקבות הועשרו ב-PECAM-1, הידוע גם בשם CD31, חלבון סמן למיקרו-כלי דם במוח. במהלך האופטימיזציה של פרוטוקול זה, נצפתה העשרת PECAM בדגימות ממברנה שהוכנו באמצעות שניים וארבעה שלבי צנטריפוגה דקסטרן. כפי שנקבע על ידי בדיקת החלבון של ברדפורד ומפורט בטבלה זו, תכשירי ממברנה מניבים בדרך כלל ריכוזי חלבון הנעים בין 5.0 מיליגרם למיליליטר ל-10.0 מיליגרם למיליליטר.
ערכי החלבון נקבעו על סמך עקומה סטנדרטית שנוצרה באמצעות BSA כסטנדרט. מוצג כאן, כתם מערבי לחלבון ההובלה BBB Glut1. רצועות בודדות ברורות ב-54 קילודלטון זוהו עבור חלבון BBB זה המתבטא מאוד בכל דגימת ממברנה.
גרף זה ממחיש ביטוי גבוה יותר של Glut1 ב-BBB בחולדות זכרים לעומת נקבות. לא נצפה הבדל בביטוי של נתרן/אשלגן ATPase בין בעלי חיים זכרים ונקבות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים עד שעתיים וחצי אם היא מבוצעת כראוי.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את כל הדגימות על קרח לאורך כל הפרוטוקול ולנקוט משנה זהירות בעת שאיבת הסופרנטנט מכדור המיקרו-כלי לאחר שלבי הצנטריפוגה. בעקבות ההליך הזה, שיטות אחרות, כמו ניתוח קו-אימונו-משקעים, יכולות להתבצע על דגימות מיקרו-כלי דם כדי לענות על שאלות נוספות, כמו שיוך של חלבונים שונים בתוך אותו קומפלקס חלבונים במחסום הדם-מוח. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הפיזיולוגיה של מחסום הדם-מוח והנוירופרמקולוגיה לחקור מאפיינים מולקולריים של מחסום הדם-מוח בבריאות ובמודלים של מכרסמים של מחלות נוירולוגיות.
אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד כלי דם זעירים באיכות גבוהה ממוח החולדה לצורך מחקר משלכם על ביולוגיה של מחסום דם-מוח בבריאות ובמחלות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד מיקרו-כלי דם ממוח של חולדה לצורך חקירת מחסום הדם-מוח (BBB). השיטה מאפשרת ניתוחים איכותיים של חלבונים מבעלי חיים בודדים, ובכך מקלה על חקירת חלבונים של צמתים הדוקים ונשאי חומרים הקשורים לנוירו-פרמקולוגיה ופיזיולוגיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ניתוח חלבונים
- פיזיולוגיה של מחסום הדם-מוח
רקע
- מחסום הדם-מוח ממלא תפקיד מכריע בשמירה על ההומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית.
- הבנת המאפיינים המולקולריים של מחסום הדם-מוח עשויה לסייע במחקרים על מחלות נוירולוגיות.
- שיטה זו לוקחת בחשבון את השונות בביטוי חלבונים בין חולדות שונות.
- דגימות מועשרות של מיקרו-כלי דם חיוניות לקידום מחקרים נוירו-פארמקולוגיים.
מטרת המחקר
- לבידוד מיקרו-כלי דם מוחיים ממוחות של חולדות לצורך מחקרים ביוכימיים.
- לניתוח רכיבים מולקולריים הקשורים למחסום הדם-מוח (BBB) תחת תנאים פיזיולוגיים שונים.
- להערכת הביטוי והבקרה של חלבונים ספציפיים הקשורים לתפקוד ה-BBB.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה המרכזית כוללת טכניקות כירורגיות, שלאחריהן הומוגניזציה וצנטריפוגציה של רקמת מוח.
- המודל הביולוגי מורכב מחולדות Sprague-Dawley, המאפשרות ניתוח פרטני של מאפייני כלי דם זעירים.
- לא הוזכר תהליך עבודה מולטי-אומי (multiomics).
- השלבים המרכזיים כוללים כריתת רקמה, הומוגניזציה ומספר מחזורי צנטריפוגציה לבידוד כלי דם זעירים.
- ניצול החלבון ודרגת הניקוי מוערכים באמצעות Western blotting ובדיקות חלבון בשיטת Bradford.
תוצאות עיקריות
- מיקרו-כלי דם שלמים בודדו בהצלחה ואופיינו עבור ביטוי חלבונים.
- אושר העשרה של PECAM-1 (CD31) ו-Glut1 בתכשירי מיקרו-כלי דם.
- ריכוזי החלבון נעו בדרך כלל בין 5 ל-10 mg/mL לאחר הפרוטוקול.
- נצפה הבדל בולט בביטוי Glut1 בין חולדות זכרים לנקבות.
מסקנות
- מחקר זה מספק שיטה מהימנה לבידוד מיקרו-כלי דם מוחיים, ובכך סולל את הדרך למחקרים עתידיים על מחסום הדם-מוח.
- הפרוטוקול משפר את ההבנה של דינמיקה נוירו-פרמקולוגית ושל פיזיולוגיית ה-BBB.
- התובנות שהושגו יכולות להוביל לגישות טיפוליות טובות יותר למצבים נוירולוגיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד מיקרו-כלי דם מהמוח מאפשר הפחתת סיכונים מכנית של מטרות תרופתיות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על ידי אספקת דגימות עשירות באנדותל המשקפות שונות פיזיולוגית. שיטה זו תומכת בתיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות למחקרי חדירה דרך מחסום הדם-מוח, ובכך משפרת את רמת הביטחון החיזויית בזיהוי מולקולות מובילות. הכנת ממברנה הניתנת לשחזור מבעלי חיים בודדים משפרת את ההלימה של סמני ביולוגים תרגומיים ואת סינון הפורטפוליו במחקר ופיתוח של נוירו-פרמקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של מטרות ספציפיות לאנדותל, כגון נשאי חומרים (transporters) וחלבונים של צומת הדוק (tight junction proteins), במערכת הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מספק בידוד הדיר כלי דם זעירים (microvessels) מחולדות בודדות כדי ללכוד שונות בין-חייית בביטוי המטרה.
- ערך אסטרטגי: תומך בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) לפני אופטימיזציה של תרופה מובילה (lead optimization).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק דגימות ממברנה המתאימות לניתוח כמותי של ביטוי ותפקוד חלבונים במחסום הדם-מוח (BBB).
- ערך תפעולי: מספק תנובות חלבון עקביות (5–10 mg/mL), המאפשרות קלטים סטנדרטיים למדידות במסגרת קמפיינים של סריקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר מוכנות של הבדיקה להערכת השפעות של תרכובות על יעדים אנדותליאליים בפורמט ניתן להרחבה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על הרלוונטיות למחלה על ידי בידוד מיקרו-כלי דם ממודלים של מכרסמים, במטרה לחקור תגובות של מחסום הדם-מוח (BBB) לגירויים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות מערכות ביולוגיות תואמות.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אישור מעורבות המטרה במחסום הדם-מוח.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אספקת דגימות מועשרות בתאי אנדותל למחקרי מנגנון.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בהבהרת מסלולים ובאישור מטרות באמצעות העשרה של סממנים מיקרו-וסקולריים כגון PECAM-1 ו-Glut1.
- סריקה: מספק דגימות הניתנות לשחזור עם פלטי חלבון מדידים עבור סריקת תרכובות ובדיקות מעורבות מטרה (target engagement).
- אנליזה: מאפשר קריאות של Western blot ובדיקת Bradford להשוואת ביטוי חלבון בין תנאים ומגדרים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי שימוש בכלי דם זעירים ממוח של חולדה כמערכת רלוונטית למחלה עבור טיפולים המכוונים למחסום הדם-מוח (BBB).
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת בידוד רב-פעמית עבור פרויקטים מרובים המכוונים למסירת תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) ול modulates של ה-BBB.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתיקוף יעדים במחסום דם-מוח (BBB).
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה וחזרתיות באמצעות שלבי צנטריפוגה מוגדרים ושלבי העשרה מבוססי דקסטראן.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי אספקת נתונים ספציפיים לאנדותל, המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף יעדים מותאם סיכון על בסיס ביטוי מאושב בכלי דם זעירים במוח.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בנוירו-אנטומיה ובטיפול ברקמות כדי לבודד מיקרו-כלי דם מוחיים ללא זיהום.
- נדרשת גישה לציוד הומוגניזציה, לצנטריפוגות המסוגלות להגיע ל-5,000 g ב-4°C, ולתשתית להכנת דקסטראן.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של עיבוד הדגימות כדי לשמור על עקביות בניב החלבון ובטוהר שלו.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על מינים אחרים או מודלים של מחלות מעבר למוח של חולדה.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך לשמור על הדגימות על קרח ולהימנע מהפרעה למשקע במהלך שאיבת הנוזל העליון.
